ARL66096

Platelet P2YT receptor

血小板P2YT受体拮抗剂对B10细胞P2YT型和P2Y1受体的影响[1]
在B10细胞中，研究了两种已知作为人血小板P2YT受体拮抗剂的化合物阻断adp诱导的腺苷酸环化酶抑制的能力。其中一种化合物AR-C66096或psfs -ATP，是一种ATP衍生物，已被证明可在人血小板上选择性阻断adp诱导的腺苷酸环化酶聚集或抑制(Humphries et al., 1994；Jin et al., 1998)。在B10细胞上，我们发现该化合物也是2- mesadp诱导的腺苷酸环化酶抑制的有效竞争拮抗剂，其pKB值为7.6（图4a和表1）。单独使用时，它对福斯可林刺激的环AMP水平没有影响（至少1 μM）（数据未显示）。拮抗剂的效力虽然很高，但比报道的阻断人类血小板中adp诱导的腺苷酸环化酶抑制的效力低约10倍（表1），但这可能是物种差异造成的。 <人力资源> ADP和相关的核苷二磷酸对B10细胞施加额外的作用，动员细胞内Ca2+（见介绍）。我们还测试了上述拮抗剂AR-C66096阻止这些核苷酸激活该反应的能力。ADP产生细胞内Ca2+的动员，其EC50值为0.91±0.06 μM（与Hechler et al.， 1998c的早期发现一致）。在10 μM浓度AR-C66096存在时，这一点没有变化（图5）。后者对细胞内Ca2+水平也没有单独作用（图5）。这些结果与B10细胞中Ca2+反应归因于P2Y1受体的结果一致，通过其mRNA检测到（Webb等，1996）。它已经被证实（J. Simon等人，未发表的数据）通过使用P2Y1受体的特异性抗体，该蛋白存在于这些B10细胞的细胞表面。

腺苷酸环化酶测定[1]
融合细胞层用无血清培养基（含25 mM HEPES和5 mM葡萄糖，pH=7.4）在37℃下洗涤一次，然后在含有100或200 μM IBMX的培养基中37℃预孵育10-15 min（以抑制磷酸二酯酶对环AMP的分解）。抽吸预孵育培养基，加入含福斯克林(10 μM，亚克隆a；1 μM，子克隆b)， IBMX和效应器。在37°C下孵育5分钟后，通过抽吸培养基并在4°C下30分钟酸化至pH 5.5或以下来终止孵育。离心后（在板中，对于96孔系列），处理等分液进行环AMP测定，按照Carruthers等人（1999）的描述，对亚克隆a进行环AMP测定，使用[3H]-环AMP与蛋白激酶a结合片段结合的竞争。对于索菲亚Antipolis亚克隆b（6孔板）的平行分析，根据制造商的协议使用环AMP试剂盒。在没有药物和福斯可林的情况下，环AMP的基础水平为每孔46±2摩尔环AMP(96孔板；N =9)或2.3±0.1 pmol孔−1 （N =12）在散装情况下（6孔板测定）。 在拮抗研究中，将细胞与AR-C66096在含有200 μM IBMX，或BzATP或A3P5P或A2P5P的培养基中37°C预孵育15分钟（以使该剂完全平衡），或将纯化的ATP与激动剂一起加入。 百日咳毒素（PTX）处理，B10细胞在96孔板上培养至接近合流。每个板上一半孔在37℃下用100 ng ml−1百日咳毒素预处理14-16 h，然后进行激动剂/10 μM福斯考林处理和环AMP测定。

[1]. Activity of adenosine diphosphates and triphosphates on a P2Y(T) -type receptor in brain capillary endothelial cells. Br J Pharmacol. 2001 Jan;132(1):173-82.

1. 在大鼠脑毛细血管内皮细胞克隆群（B10）中，P2Y（核苷酸）受体活性与腺苷酸环化酶的抑制相关，并且其功能与血小板ADP受体P2Y(T)（先前称为“P2T”）相似。然而，在先前对B10细胞的mRNA分析研究中，唯一可检测到的P2Y受体是P2Y(1)受体，而其他研究表明P2Y(1)受体不参与环核苷酸的信号转导。本文旨在阐明这些问题。2. 在B10细胞中测定了纯化核苷酸对福斯克林刺激的腺苷酸环化酶的抑制作用。2-甲基硫代ADP (2-MeSADP)的EC50值为2.2 nM，令人惊讶的是，2-MeSATP也是一种几乎同样强的激动剂（EC50=3.5 nM）。 ATP 和 2-ClATP 是弱的部分激动剂（EC50 分别为 26 μM 和 10 μM），在适当条件下可拮抗 2-MeSADP 的活性。3. 已知的血小板 P2Y(T) 受体选择性拮抗剂 2-丙基硫代腺苷-5'-(β,γ)-二氟亚甲基)三膦酸酯 (AR-C 66096) 是 B10 细胞受体的竞争性拮抗剂，pK(B)=7.6。该配体对同一细胞中的 P2Y(1) 受体无活性。相反，竞争性 P2Y(1) 受体拮抗剂，即 3',5'- 和 2',5'-腺苷双单磷酸酯，却是腺苷酸环化酶抑制受体的弱激动剂。 4. 百日咳毒素完全消除了2-MeSADP对腺苷酸环化酶的抑制作用。5. 总之，这些脑内皮细胞除了P2Y(1)受体外，还具有P2Y(T)型受体。这两种受体在激动剂谱方面具有相似性，但可通过拮抗剂和第二信使激活机制明显区分。本文讨论了B10细胞和血小板P2Y(T)受体之间可能存在的联系。[1]

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研究人员此前曾指出（Webb等人，1996），另一种未知的P2Y受体可能是B10细胞中腺苷酸环化酶抑制的可能来源。现在看来情况确实如此，因为腺苷酸环化酶抑制作用对血小板 P2YT 受体的特异性拮抗剂 AR-C66096 敏感（图 4a），而 AR-C66096 并不影响 B10 细胞中 P2Y1 受体的活性（图 5）。此外，双单磷酸 P2Y1 拮抗剂也能完全区分这两种受体（图 3）。在血小板中，ADP 介导的腺苷酸环化酶抑制作用是由 P2YT 受体引起的（见引言），由此我们可以得出结论，B10 细胞中的这种抑制作用是由一种内皮细胞受体产生的，该受体在功能上与血小板受体非常相似，甚至可能相同。因此，(i) 这两个受体均对 ADP 有反应，表现为腺苷酸环化酶抑制，且不引起细胞内 Ca2+ 动员（如前所述）；(ii) 两者均可被 AR-C66096 竞争性拮抗（Daniel 等，1998（血小板）和图 4a）；(iii) 也可被 BzATP 竞争性拮抗（Vigne 等，1999（血小板）和图 4b）；(iv) 两者均不被 P2Y1 受体的双磷酸拮抗剂阻断（Fagura 等，1998；Hechler 等，1998b；Jin 和 Kunapuli，1998（血小板）和图 3）；(v) 两者均涉及一种对百日咳毒素敏感的 G 蛋白（Ohlmann 等，1995（血小板）和图 6），这与 P2Y1 受体不同。 B10 细胞，并且（vi）两者（再次与 P2Y1 受体不同）均不受 100 μM PPADS 的拮抗作用（Geiger 等，1998（血小板）；Webb 等，1996（B10））。此外，在腺苷酸环化酶抑制的激动剂效力方面，ADP 在大鼠血小板（Savi 等，1994a）和大鼠 B10 细胞（表 1）中均比 2-MeSADP 弱 400 至 500 倍。
然而，血小板 P2YT 受体和 B10 细胞中类似的受体对某些三磷酸腺苷衍生物的活性存在差异。 2-ClATP、2-MeSATP 和 ATP 本身显然是鼠 B10 细胞中腺苷酸环化酶抑制的激动剂（图 1），但已被证实是人血小板中 ADP 诱导的腺苷酸环化酶抑制（以及聚集）的拮抗剂（Cusack & Hourani, 1982; Park & Hourani, 1999）。目前尚无证据表明物种差异可能导致这种显著变化。另一种啮齿动物——小鼠的血小板 P2YT 受体在 ADP 反应及其对 AR-C66096 的敏感性方面与人类的受体表现相同（Kim et al., 1999）。 ADP介导的腺苷酸环化酶抑制作用在大鼠血小板上的效力仅比在人血小板上的效力高4倍（Savi等人，1994a）（使用纯核苷酸：Geiger等人，1998）。[1]

C14H18F2N5NA4O12P3S

703.261194705963

702.944

C, 27.33; H, 3.60; F, 6.18; N, 11.38; O, 31.20; P, 15.10; S, 5.21

145782-74-7

90488830

Typically exists as solid at room temperature

307

3

19

10

41

941

4

S(CCC)C1N=C(C2=C(N=1)N(C=N2)[C@H]1[C@@H]([C@@H]([C@@H](COP(=O)([O-])OP(C(F)(F)P(=O)([O-])[O-])(=O)[O-])O1)O)O)N.[Na+].[Na+].[Na+].[Na+]

IETVOLFQZIGNAQ-HVYRMSERSA-J

InChI=1S/C14H22F2N5O12P3S.4Na/c1-2-3-37-13-19-10(17)7-11(20-13)21(5-18-7)12-9(23)8(22)6(32-12)4-31-36(29,30)33-35(27,28)14(15,16)34(24,25)26;;;;/h5-6,8-9,12,22-23H,2-4H2,1H3,(H,27,28)(H,29,30)(H2,17,19,20)(H2,24,25,26);;;;/q;4*+1/p-4/t6-,8-,9-,12-;;;;/m1..../s1

tetrasodium;[[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-propylsulfanylpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-oxidophosphoryl]oxy-[difluoro(phosphonato)methyl]phosphinate

145782-74-7; 2-(Propylthio)adenosine-5'-O-(beta,gamma-difluoromethylene)triphosphatetetrasodiumsalt; tetrasodium;[[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-propylsulfanylpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-oxidophosphoryl]oxy-[difluoro(phosphonato)methyl]phosphinate; 2-propylthio-D-beta,gamma-difluoromethylene ATP;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。