BAY-36-7620

mGlu1 Receptor (IC50 = 160 nM); mGluR1a (IC50 = 280 nM); mGluR2 (IC50 = 140 nM); mGluR 5 (IC50 = 240 nM)

10 μM 时，BAY 36-7620 (0.1-10 μM) 完全阻止 HEK 293 细胞中 mGlu1 的捕获 [1]。 BAY 36-7620（0.1-10 μM，4 天）可减少肿瘤生长和 A549 细胞植入。 BAY 36-7620（72小时）抑制MCF-7、T-47D、BT-474、MDA-MB-231、Hs578T和BT-549细胞的生长和增殖，其IC50与相关蛋白表达有关[ 2]。在 T-47D、BT-474、MDA-MB-231 和 BT-549 细胞中，BAY 36-7620（25-50 μM，24-72 小时）导致 27.7、37.1、20.8、41.0、21.0 和 15.7μM [3]。显着的 G2/M 期停滞和 DNA 损伤 [3]。\n\n

---

\nL-谷氨酸（Glu）可激活至少八种不同的G蛋白偶联受体（统称为代谢型谷氨酸受体，mGlu受体），这些受体主要作为突触传递的调节因子。mGlu受体由两个结构域组成：激动剂结合的胞外结构域和参与G蛋白激活的跨膜七螺旋区。尽管已有新型mGlu受体激动剂和拮抗剂的报道，但极少能对单一mGlu亚型具有选择性。本研究检测了新型化合物BAY 36-7620 [(3aS,6aS)-6a-萘-2-基甲基-5-亚甲基-六氢-环戊[c]呋喃-1-酮]在瞬时表达于人胚胎肾293细胞的mGlu受体（mGlu1-8）上的效应。BAY 36-7620是mGlu1受体的强效（IC50=0.16μM）选择性拮抗剂，可抑制>60%的mGlu1a受体本构活性（IC50=0.38μM），因此是首个被报道的mGlu1受体反向激动剂。为探究BAY36-7620的作用机制，在递增浓度的BAY36-7620存在下进行Glu剂量效应曲线实验。结果显示BAY36-7620显著降低Glu的最大效应，且不置换Glu结合口袋中的[(3)H]quisqualate结合，进一步表明其是非竞争性mGlu1拮抗剂。对包含mGlu1与DmGluA、mGlu2或mGlu5结构域的嵌合受体的研究表明，mGlu1的跨膜区是BAY36-7620活性的必要条件，其中4-7号跨膜螺旋对其选择性起关键作用。BAY36-7620这一独特作用位点不同于竞争性拮抗剂，表明跨膜区在该受体非激动剂依赖性活性中具有核心作用。BAY36-7620将有助于进一步阐明mGlu1受体的功能重要性，包括其假定的非激动剂依赖性活性。[1]

---

\n\nmGlu1受体/AKT在A549细胞中的作用[2]
\n用BAY 36-7620（10和25μM）或载体（0.05%DMSO，对照组）处理A549细胞。与对照组相比，BAY36-7620处理降低了A549细胞的增殖（图4A）。SK-MES-1细胞中也观察到类似结果（补充数据图S3）。此外，BAY36-7620孵育对16HBE细胞活力无显著影响。\n\n\n用BAY 36-7620（mGlu1受体特异性抑制剂，25μM）、L-quisqualate（强效mGlu1受体激动剂，10μM）或MK2206（AKT抑制剂，5μM）单独或联合处理A549细胞。孵育4天后，BAY36-7620处理增加了cleaved PARP水平并降低bcl-2蛋白表达；L-quisqualate处理则降低cleaved PARP水平并增强bcl-2表达，而MK2206共孵育可阻断L-quisqualate对bcl-2的作用但不影响其对cleaved PARP的效应（图4B）。
\n在低氧条件下，用BAY36-7620（25μM）、L-quisqualate（10μM）或MK2206（5μM）单独或联合处理A549细胞。孵育4天后，BAY36-7620处理降低了HIF-1α蛋白表达（图4C）、HIF活性（图4D）及上清中VEGF（图4E）和IL-8（图4F）的分泌。L-quisqualate处理则增强上述指标，该效应可被MK2206共孵育消除。\n\n

---

\nmGlu1受体/AKT在HUVECs中的作用[2]
\n\nHUVECs预先用BAY 36-7620（25μM）处理30分钟后，用VEGF（100ng/ml）刺激。VEGF刺激导致AKT磷酸化水平升高，而BAY36-7620预处理可阻断该效应（图5A），表明其抑制了HUVECs中VEGF/AKT信号通路。\n
\n\n将HUVECs以2×105细胞/孔接种于Matrigel包被的24孔板，在VEGF（100ng/ml）存在下用BAY 36-7620（25μM）、L-quisqualate（10μM）或MK2206（5μM）单独或联合处理。约48小时后发现，BAY36-7620处理导致毛细血管形成减少，L-quisqualate则增强该过程，后者可被MK2206共孵育阻断（图5B）。\n\n

---

\n本研究比较了利鲁唑与代谢型谷氨酸受体1特异性抑制剂BAY 36-7620在一组乳腺癌细胞系中的抗癌效应。虽然两者均抑制乳腺癌细胞增殖，但其功能效应存在差异，提示利鲁唑的作用可能不依赖mGlu1受体。利鲁唑可诱导不依赖氧化应激的有丝分裂阻滞，而BAY 36-7620对有丝分裂无显著影响。BAY 36-7620比利鲁唑更能显著诱导DNA损伤。利鲁唑通过改变氧化磷酸化和细胞代谢物水平影响细胞代谢。这些结果有助于理解利鲁唑治疗乳腺癌的作用机制。[3]\n\n

---

\n利鲁唑与BAY 36-7620抑制乳腺癌细胞生长[3]
\n\n既往报道显示GRM1参与乳腺癌细胞生长增殖。为评估药物对细胞生长的影响，用利鲁唑或BAY 36-7620处理ER+和ER-乳腺癌细胞系72小时。两种药物在所有细胞系中均降低活细胞数（图2A、2B），其IC50值分别为19.0-62.4μM和15.7-41.0μM（表1）。BT-474、Hs578T和BT-549细胞对两者最敏感，MDA-MB-231细胞敏感性最低。高浓度BAY 36-7620完全抑制细胞生长，而利鲁唑在最高浓度时可抑制70-90%细胞生长。\n\n

---

\n利鲁唑或BAY 36-7620处理抑制细胞增殖[3]
\n\n通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入实验检测两者对增殖的影响。两种药物均降低各乳腺癌细胞系的增殖比例（图3），但该效应与GRM1水平无相关性。在测试浓度下，T-47D、BT-474和BT-549细胞对BAY 36-7620的敏感性显著高于利鲁唑，提示BAY 36-7620对增殖的抑制作用更强。值得注意的是，低GRM1表达细胞对两者仍高度敏感，表明可能存在脱靶效应。\n\n

---

\n利鲁唑与BAY 36-7620改变细胞周期和致癌通路基因表达特征[3]
\n\n对MCF-7、BT-474和BT-549细胞进行基因表达分析以揭示药物作用机制。选择这些细胞系以比较不同敏感性（BT-549最敏感，MCF-7最不敏感）。BT-549和BT-474细胞处理24小时，MCF-7细胞处理48小时。总体而言，两种药物在三株细胞中诱导相似的基因特征（图4A），但也存在差异：BAY 36-7620（而非利鲁唑）在MCF-7和BT-474细胞中诱导胆固醇生物合成基因特征。\n\n

---

\n利鲁唑比BAY 36-7620更强诱导G2/M周期阻滞[3]
\n\n检测两者对细胞周期分布的影响。利鲁唑在所有乳腺癌细胞系中均呈剂量和时间依赖性诱导G2/M阻滞（图5），其中BT-474和BT-549细胞最敏感（分别在48小时和24小时出现亚G1期细胞增加）。BAY 36-7620在T-47D、BT-474、MDA-MB-231和BT-549细胞中诱导较温和的G2/M阻滞（图5D-5J），对MCF-7细胞无影响（图5A、5B）。虽然两者均抑制增殖，但利鲁唑更显著的G2/M阻滞提示其存在其他作用靶点。\n\n

---

\n利鲁唑（而非BAY 36-7620）诱导乳腺癌细胞有丝分裂阻滞[3]
\n\n通过组蛋白H3磷酸化（有丝分裂标志物）区分G2阻滞或有丝分裂阻滞。利鲁唑在所有细胞系中均显著增加磷酸化H3阳性细胞数（图6A、6B），而BAY 36-7620的效应具有细胞系依赖性：在MCF-7、T-47D和BT-549细胞中显著减少磷酸化H3阳性细胞，在MDA-MB-231细胞中轻微增加。\n
\n\n检测有丝分裂标志物显示：利鲁唑显著降低MCF-7、T-47D、Hs578T和BT-549细胞中磷酸化cdc2水平，并增加Hs578T细胞中cyclin B1表达（图6C，补充图2），支持其诱导有丝分裂阻滞的作用。BAY 36-7620仅在高浓度时降低磷酸化cdc2，且不增加cyclin B水平（图6C，补充图2）。结果表明利鲁唑在G2/M阻滞中特异性诱导有丝分裂阻滞，而BAY 36-7620对两者影响均有限。\n\n

---

\nBAY 36-7620处理诱导DNA损伤[3]
\n\n通过组蛋白H2AX磷酸化（γ-H2AX，DNA双链断裂标志物）评估DNA损伤。两种药物在所有乳腺癌细胞系中均增加γ-H2AX焦点阳性细胞比例（图7A），但BAY 36-7620诱导的H2AX磷酸化更显著。图7B展示ER+（MCF-7）和ER-（MDA-MB-231）细胞系中γ-H2AX核焦点增加的代表性图像。\n\n

---

\n利鲁唑诱导的周期阻滞不依赖氧化应激[3]
\n\n为评估两者是否增加氧化应激，检测活性氧（ROS）和谷胱甘肽（GSH）水平。BAY 36-7620在T-47D和BT-474 ER+细胞中显著增加ROS，利鲁唑仅在BT-474细胞中显著增加ROS（图8A）。BAY 36-7620增加ROS的作用显著强于利鲁唑。两者在ER-细胞中均未显著增加ROS，且在MDA-MB-231（BAY 36-7620处理）和Hs578T细胞（两者处理）中ROS略有下降。利鲁唑和BAY 36-7620处理降低BT-474和Hs578T细胞中总GSH水平（图8B），这两株细胞的GRM1蛋白水平较低，提示药物可能作用于其他谷氨酸受体靶点。

BAY 36-7620（5-10 mg/kg，腹腔注射；每天一次，持续 24 天）可减少胸腺裸鼠模型中的肿瘤生长，并延长肺癌肿瘤的形成[2]。 BAY 36-7620（0.01-0.03 mg/kg，注射；4 小时）在急性硬膜下血肿模型中具有神经保护作用 [4]。

---

mGlu1受体在非小细胞肺癌中的作用[2]
将5×10⁵个A549或H1299细胞注射至无胸腺裸鼠胁腹部，并用BAY 36-7620（mGlu1受体特异性抑制剂，5、10 mg/kg/天，腹腔注射）处理。移植24天后，BAY36-7620治疗组的A549（图2A）和H1299肿瘤体积（图2B）均小于对照组，表明BAY36-7620通过抑制mGlu1受体阻断了肺肿瘤裸鼠的肿瘤生长。Kaplan-Meier分析显示，对照组与BAY36-7620治疗组的生存曲线存在显著差异。与对照组相比，BAY36-7620治疗显著延长了接种小鼠的生存期（图2C和2D）。

---

mGlu1受体/AKT信号通路[2]
将5×10⁵个A549细胞注射至无胸腺裸鼠胁腹部，并用BAY 36-7620（mGlu1受体特异性抑制剂，5、10 mg/kg/天，腹腔注射）处理。结果显示BAY36-7620治疗降低了A549肿瘤中磷酸化AKT（Ser-473）水平（图3A），但对JNK、ERK和p38的磷酸化无显著影响（补充数据图S1）。在SK-MES-1肿瘤中，BAY36-7620治疗同样抑制了AKT磷酸化（补充数据图S2）。

---

本研究评估了(3aS,6aS)-6a-萘-2-基甲基-5-亚甲基-六氢-环戊[c]呋喃-1-酮（BAY 36-7620）的神经保护和行为学效应，该化合物是一种新型、选择性且具有全身活性的代谢型谷氨酸（mGlu）1受体拮抗剂。在大鼠急性硬膜下血肿模型中显示神经保护作用（术后4小时静脉输注0.01-0.03 mg/kg/h时疗效达40-50%）；而在大脑中动脉闭塞模型中，闭塞后立即、2小时和4小时三次静脉推注0.03-3 mg/kg时呈现神经保护趋势。其低温效应轻微且仅出现在远高于神经保护有效剂量的情况下，表明神经保护作用非低温所致。BAY 36-7620可对抗小鼠戊四唑诱导的惊厥（最小有效剂量MED：10 mg/kg，静脉注射）。大鼠实验表明，BAY 36-7620不产生离子型谷氨酸（iGlu）受体拮抗剂苯环利定和(+)-5-甲基-10,11-二羟基-5H-二苯并(a,d)环庚烯-5,10-亚胺（MK-801）的典型副作用：不破坏感觉运动门控、不诱导苯环利定样辨别效应或刻板行为、不促进颅内自我刺激行为。虽然BAY 36-7620不影响苯丙胺或阿扑吗啡诱导的行为刻板及感觉运动门控障碍，但能减弱iGlu受体拮抗剂的某些行为效应（如过度理毛或舔舐行为及其对颅内自我刺激的促进作用）。结论认为mGlu1受体拮抗可在不引发iGlu受体拮抗典型副作用的情况下产生神经保护和抗惊厥作用。[4]

---

神经保护效应[4]
在创伤性脑损伤硬膜下血肿模型中，术后4小时输注BAY 36-7620产生神经保护作用[F(5,59)=3.86, P<0.01；图2上 panel]，但量效曲线呈倒U型，在0.01-0.03 mg/kg剂量范围内获得约40-50%的最大疗效。在缺血性中风大脑中动脉闭塞模型中，0.03至3 mg/kg剂量范围内三次静脉推注呈现神经保护趋势，但未达统计学显著性[F(3,31)=2.55, P=0.07；图2下 panel]。

---

抗惊厥效应[4]
在戊四唑模型中，BAY 36-7620提高惊厥阈值，静脉注射MED为10 mg/kg，20 mg/kg时疗效约35%[F(3,58)=8.17, P<0.001；图3]。

---

低温效应[4]
静脉注射[F(3,24)=2.84, P=0.059]和腹腔注射[F(2,18)=4.28, P<0.05；图4]后，BAY 36-7620均诱导低温效应。静脉给药时MED为3 mg/kg，10 mg/kg时最大降温0.72°C，效应在15分钟达峰，60分钟消失。腹腔给药效价略低（MED：10 mg/kg），但降温更显著（30 mg/kg时最大降温1.48°C，给药后20分钟达峰）。体温影响呈时间依赖性[静脉：F(4,96)=89.27, P<0.001；腹腔：F(6,108)=21.04, P<0.001]，两种给药途径的时间进程相似。

---

MK-801、苯丙胺及阿扑吗啡诱导的行为兴奋/刻板行为[4]
预给BAY 36-7620（0.1-10 mg/kg，静脉注射）可减弱MK-801诱导的舔舐[F(3,36)=7.97, P<0.001]和面部理毛行为[F(3,36)=27.77, P<0.001]（图5上 panel），MED为10 mg/kg；但不影响MK-801的其他行为症状（如嗅探、共济失调和卷舌，数据未显示）。值得注意的是，相同剂量范围内BAY 36-7620不影响苯丙胺或阿扑吗啡诱导的行为兴奋/刻板行为（如嗅探、探索和咬啮；图5中下 panel），表明其与MK-801的相互作用具有行为特异性，非单纯药物行为抑制所致。单独测试时BAY 36-7620（0.1-10 mg/kg，静脉注射）不引发行为症状（数据未显示）。

---

PCP药物辨别[4]
训练识别PCP（2 mg/kg）的大鼠对PCP[ED50值（95%置信区间）：1.10（0.69-1.74）mg/kg，腹腔注射]或MK-801[0.11（0.06-0.21）mg/kg，腹腔注射]产生完全泛化（图6上 panel）。BAY 36-7620不诱导PCP线索泛化（30 mg/kg腹腔注射时最大泛化水平为20%药物杠杆选择；图6上 panel）。测试剂量范围内未见行为中断迹象（除1/5大鼠在0.3 mg/kg MK-801时未选择杠杆外）。预给1-30 mg/kg BAY 36-7620不能拮抗PCP线索（图6下 panel），且仍无行为中断现象（除3 mg/kg时1/5大鼠未选择杠杆外）。

---

惊跳阈值与前脉冲抑制[4]
静脉注射后，BAY 36-7620降低大鼠听觉惊跳幅度[BAY 36-7620因子：F(3,224)=6.85, P<0.001；试验因子：F(7,224)=35.13, P<0.001]，MED为3 mg/kg，10 mg/kg时最大抑制约50%（高强度脉冲下效应更显著；图7上 panel）。惊跳曲线右移表明其提高惊跳阈值。但小鼠静脉注射相同剂量范围不影响惊跳反应（图7下 panel）。BAY 36-7620不影响大鼠前脉冲抑制（数据未显示），也不逆转MK-801[F(1,112)=41.32, P<0.001]、PCP[F(1,112)=33.41, P<0.001]或阿扑吗啡[F(1,112)=53.13, P<0.001；数据未显示]诱导的前脉冲抑制破坏。

---

颅内自我刺激[4]
方差分析显示颅内自我刺激阈值受MK-801因子[F(1,24)=6.03, P<0.05]和BAY 36-7620因子[F(1,24)=5.62, P<0.05]影响。BAY 36-7620（10 mg/kg，腹腔注射）与载体联用时不改变阈值，但完全阻断MK-801（0.025 mg/kg，腹腔注射）诱导的颅内自我刺激行为促进（图8）。

膜制备及[3H]-准质酸结合试验[1]
[3H]如上所述，培养并瞬时转染mGlu1as受体的HEK293细胞进行QA结合。转染24小时后，在KREBS-Tris缓冲液（Tris 20mM, NaCl 118mM, KH2PO4 1.2 mM, MgSO4 1.2 mM, KCl 4.7mM, CaCl2 1.8mM，葡萄糖5.6mM, pH 7.4）中回收膜，匀浆，池化，40000 g离心20分钟。得到的颗粒在相同的缓冲液中重悬，匀浆并在- 20°C下作为颗粒保存，直到使用（< 1个月）。以牛血清白蛋白为标准，采用双双霉素酸测定法（Smith等人，1985年）测定蛋白质水平。
使用的绑定条件执行并修改如下。结合实验在含有HEPES 40mM和CaCl2 2.5mM的缓冲液中进行，用NaOH调节pH为7.4。将膜微球重悬于上述缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物中，在[3H]QA（比活性25Ci/mmol）存在下，以50μg蛋白等分培养，室温下终体积为100μl，孵育1小时。用600nM [3H]QA和不同浓度的冷QA和BAY 36-7620进行竞争实验。通过Whatmann QF/C过滤器快速过滤（在3%奶粉中预浸泡45分钟），使用Brandel收集机终止孵育。过滤器在HEPES/CaCl2缓冲液中冲洗，并以3ml PCS闪烁剂计数。在1mM Glu存在下测定非特异性结合。

蛋白质印迹分析[2]
细胞类型： A549 细胞系
测试浓度： 10, 25 μM
孵育时间：过夜
实验结果：裂解的PARP表达增强，bcl减少-2蛋白表达。降低 HIF-1α 蛋白表达和 HIF 活性。上清液中 VEGF 和 IL-8 的分泌减少。

---

细胞增殖测定[3]
细胞类型： T MCF-7、T-47D、BT-474、MDA-MB-231、Hs578T 和 BT-549 细胞线
测试浓度： 50 μM
孵育持续时间： 72 hrs（小时）
实验结果：减少所有乳腺癌细胞系中的增殖细胞。

---

HIF活性测定[2]
将转录因子响应型萤火虫荧光素酶构建体“HIF Reporter”和组成型表达Renilla荧光素酶构建体的混合物反向转染到A549细胞中。同时转染非诱导型萤火虫荧光素酶和组成型表达鼠兔荧光素酶的混合物作为阴性对照，以及组成型表达萤火虫和鼠兔荧光素酶的混合物作为阳性对照。转染24 h后，在缺氧条件下分别用BAY 36-7620 (25 μM)、L-quisqualate （10 μM）或MK2206 （5 μM）单独或联合处理A549细胞，4天后用Dual-Glo荧光素酶法测定HIF的活性。

---

实验四：A549细胞用BAY 36-7620 (25 μM)或不预处理30 min，然后用L-quisqualate （10 μM）刺激。在治疗后的不同时间点收集细胞，检测AKT磷酸化水平（Ser-473）。[2]
实验5:A549细胞分别用BAY 36-7620 （10 μM和25 μM）或对照（0.05% DMSO，对照）处理。在治疗后不同时间点检测细胞增殖情况。[2]
实验6:BAY 36-7620 (25 μM)、L-quisqualate （10 μM）或MK2206 （5 μM）分别单独或联合作用于A549细胞。孵育4天后，收集细胞，检测裂解的PARP、PARP和bcl-2蛋白的表达。[2]
实验7：缺氧条件下，A549细胞分别接受BAY 36-7620 (25 μM)、L-quisqualate （10 μM）或MK2206 （5 μM）单独或联合作用。孵育4 d后，收集细胞检测HIF-1α蛋白表达和HIF活性，收集上清液检测VEGF和IL-8蛋白水平。[2]
实验8：用BAY 36-7620 (25 μM)或不预处理HUVECs 30 min，然后用VEGF （100 ng/ml）刺激HUVECs。在治疗后的不同时间点收集细胞，检测AKT磷酸化水平（Ser-473）。[2]
实验9：将HUVECs以每孔2×105个细胞的速度，分别涂覆在24孔板上，在VEGF （100 ng/ml）存在下孵育，并分别用BAY 36-7620 （25 μM）、L-quisqualate （10 μM）或MK2206 （5 μM）单独或联合处理。约48 h后，评价形成的毛细血管。[2]

---

基因表达分析[3]
50 μM利鲁唑或BAY 36-7620处理MCF-7细胞48小时。BT-474和BT-549细胞处理24h，因为细胞进入subG1的速度很快。总RNA用RNeasy迷你试剂盒按照制造商的方案纯化。RNA经DNA酶处理去除污染的DNA。使用Human Genome U133A 2.0 Array检测药物治疗与DMSO对照后基因表达的变化。每种条件使用3个独立重复。为了进行分析，使用R Bioconductor中的justma函数对原始CEL文件进行处理，得到log2表达值。使用基因集富集分析分析基因表达特征，量化每个特征和样本对的上调（P+）或下调（P-）的统计学显著性。如果P+ < 0.05（红色），则表示样本的特征显著上调；如果P- < 0.05（蓝色），则表示样本的特征显著下调；如果P- < 0.05（蓝色），则表示样本的特征无显著变化（黑色）。为了进行微阵列验证，使用Taqman逆转录试剂盒按照制造商的协议（Thermo Fisher Scientific, Waltham， MA）对DMSO、50 μM利鲁唑或50 μM BAY 36-7620处理过的细胞中的RNA进行逆转录。预先设计的Taqman法用于验证基因，对互补DNA进行定量PCR。RPLP0基因作为内务基因对照。结果显示，与使用δ δ Ct方法进行DMSO对照处理相比，基因表达发生了相对的折叠变化。

动物/疾病模型：肺肿瘤小鼠模型[2]
剂量：5、10 mg/kg
给药途径：腹腔注射(ip)；每日一次，持续24天
实验结果：抑制无胸腺小鼠肺肿瘤的生长。与对照组相比，接种疫苗的小鼠生存期延长。降低A549肿瘤中AKT的磷酸化水平。

---

动物/疾病模型：硬膜下血肿大鼠模型[4]
剂量：0-3 mg/kg
给药途径：静脉注射(iv)； 4 小时（小时（小时））
实验结果：神经保护作用，0.01 和 0.03 mg/kg 剂量下的疗效为 40-50%。\n

---

\n\n实验 2：将 5×10⁵ 个 A549 或 H1299 细胞注射到无胸腺裸鼠的侧腹部，并用 BAY 36-7620（5、10 mg/kg/天，腹腔注射）治疗。每六天测量一次肿瘤体积。总生存期从接种当天计算至生存结束。
\n实验 3：将 5×10⁵ 个 A549 细胞注射到无胸腺裸鼠的侧腹部，并用 BAY36-7620（5、10 mg/kg/天，腹腔注射）治疗。植入24天后，切除肿瘤以测定AKT磷酸化（Ser-473）和微血管密度。[2]\n\n

---

\n\n大脑中动脉闭塞术[4]
\n在全身麻醉下，采用颞下入路闭塞左侧大脑中动脉。吸入麻醉剂为异氟烷（Forene®，雅培公司，德国威斯巴登），与压缩空气或80%苯乙烯：30%氧气混合，浓度为4-1.5% v/v（Bederson等，1986）。剃除左侧颞顶叶区域的毛发，消毒皮肤，并在眼眶和外耳道之间切开。沿正中线切开，分离颞肌并将其拉至一侧，以暴露颅骨侧面。在手术显微镜下显露大脑中动脉，未损伤面神经、面部主要动静脉、眼外肌、泪腺和颧骨。小心切开硬脑膜，采用微双极电凝术永久性闭塞嗅束和大脑下静脉之间的大脑中动脉及其分支。为防止再通，切除闭塞的血管。使用氰基丙烯酸酯组织胶分层缝合肌肉和皮肤伤口。在损伤后立即、2 小时和 4 小时，分别静脉推注三次 BAY 36-7620（0.03–3 mg/kg）或赋形剂。动物麻醉苏醒后被放回笼中。\n

---

\n\n急性硬膜下血肿[4]
\n大鼠使用异氟烷（Forene®，参见大脑中动脉闭塞法）麻醉，并根据标准手术程序（Miller等，1990）进行一些修改，诱导硬膜下血肿。简而言之，剃除头部顶部毛发，消毒皮肤，并沿正中线纵向切开。去除一小部分骨膜，并根据立体定位坐标（前囟后方-1.0 mm，外侧-2.8 mm）（Paxinos和Watson，1986）在颅骨上钻孔。小心打开硬脑膜，并将特制塑料套管插入脑背侧与硬脑膜之间的硬膜下腔。随后，用组织胶将套管固定到位。通过尾静脉穿刺采集未肝素化的自体血，并经预先固定的套管直接注入硬膜下腔（4分钟内注入总量为200 μl）。之后，缩短探针并用氰基丙烯酸酯组织胶封闭。用缝合夹闭合皮肤伤口。术后立即开始，持续静脉输注BAY 36-7620（0.003–0.03 mg/kg/h）或载体，持续4小时。在手术和输注BAY 36-7620或载体期间，使用保温垫和覆盖几层组织，监测并维持大鼠体温在生理范围内（37.0±0.5 °C）。动物麻醉苏醒后被放回笼中。\n

---

\n戊四唑惊厥试验[4]
小鼠（每组n=10）禁食16-24小时后，静脉注射BAY 36-7620（3-20 mg/kg）或溶剂，随后立即以0.3 ml/min的速率经尾静脉注射戊四唑溶液（5 mg/ml）。一旦小鼠出现阵挛性癫痫发作，立即停止戊四唑注射。诱发此类癫痫发作所需的戊四唑剂量被认为是惊厥阈值剂量。为了便于图表展示，BAY 36-7620预处理后获得的平均阈值剂量与溶剂预处理后获得的平均阈值剂量相比，以百分比增加表示。采用单因素方差分析（ANOVA）分析个体阈值剂量，并进行Tukey事后检验。若与溶剂对照组相比，BAY 36-7620能显著提高阈值剂量（P<0.05），则认为该药物具有抗惊厥作用。\n

---

\n\n体温[4]
\n将不同组别的大鼠（每组n=7）分别给予溶剂或不同剂量的BAY 36-7620（1–10 mg/kg，静脉注射；10–30 mg/kg，腹腔注射）处理，并在固定时间点重复测量其食管体温。测量时间点包括：给药前5分钟，以及给药后7.5、15、30和60分钟（静脉注射剂量反应测定），或给药后5、10、20、40和80分钟（腹腔注射）。为了进行图形展示，结果以相对于基线值的温度变化（°C）表示，并校正了载体处理对照组中观察到的温度变化。采用重复测量单因素方差分析分析绝对体温数据，然后进行Tukey事后比较。\n

---

\n\nMK-801、苯丙胺和阿扑吗啡诱导的行为刺激/刻板行为[4]
\n雄性Wistar大鼠在给予MK-801（0.2 mg/kg，腹腔注射；每组n=10）、苯丙胺（3 mg/kg，腹腔注射；每组n=5）或阿扑吗啡（0.1 mg/kg，皮下注射；每组n=5）前5分钟，接受BAY 36-7620（0.1–10 mg/kg，静脉注射）处理，并在单独的标准Makrolon®（3型）笼中观察特定行为症状的发生情况。动物在第二次给药后立即开始观察，观察时间为60分钟（安非他明试验）或30分钟（MK-801和阿扑吗啡试验）。MK-801试验的行为检查清单包括以下症状：舔舐、啃咬、生殖器梳理、面部梳理、嗅闻、探索、共济失调、“湿狗样”抖动和卷舌；而安非他明和阿扑吗啡试验的行为检查清单包括：舔舐、啃咬、生殖器梳理、嗅闻、探索和打哈欠。症状评分采用时间抽样法。因此，在 MK-801 和阿扑吗啡测试中，每隔 2.5 分钟观察一次大鼠；在安非他明测试中，每隔 5 分钟观察一次大鼠，观察每种行为症状的发生情况（如果出现则记为“1”，如果未出现则记为“0”；在阿扑吗啡测试中，得分包括：如果症状未出现则记为“0”，如果症状轻微出现则记为“1”，如果症状明显出现则记为“2”）。苯环利定 (PCP) 药物辨别 [4]
动物先接受不同剂量的训练化合物（0.5–2 mg/kg，腹腔注射）进行测试，随后进行泛化测试，分别使用 MK-801（0.03–0.3 mg/kg，腹腔注射）和 BAY 36-7620（10–30 mg/kg，腹腔注射），或进行拮抗测试，使用 BAY 36-7620（0、1–30 mg/kg，腹腔注射）。泛化测试在注射测试化合物 15 分钟后进行。在拮抗研究中，先用 BAY 36-7620（或溶剂）进行预处理，15 分钟后再注射 PCP（2 mg/kg，腹腔注射）。测试结果以选择药物操作杆的大鼠百分比（药物操作杆选择率）表示。此外，选择操作杆（药物杆或载体杆）的动物百分比被确定为行为紊乱的指标（即操作杆选择率）。采用最小二乘线性回归分析，在对数概率转换数据后，估计ED50值及其相应的95%置信区间。如果药物杆选择率至少达到80%，则认为泛化已完成。\n\n

---

\n声惊吓实验：惊吓阈值和预脉冲抑制[4]
\n在药物测试前，将每只动物置于背景噪声为70 dB的惊吓箱中，5分钟后，暴露于20次120 dB、40 ms的宽带脉冲，每次脉冲间隔15秒。随后，将动物按这些试验的平均振幅进行分组。在分组后2至3天进行测试。单独测试了 BAY 36-7620 的效果（1、3 和 10 mg/kg，在测试前 5 分钟静脉注射），或在预先用 MK-801（0 和 0.5 mg/kg，皮下注射）、PCP（0 和 1.5 mg/kg，皮下注射）和阿扑吗啡（0 和 1 mg/kg，皮下注射）处理后进行测试，这些药物在 BAY 36-7620 给药前 15 分钟给药。在与 MK-801 和 PCP 的联合实验中，BAY 36-7620 的剂量为 10 mg/kg，静脉注射；而在与阿扑吗啡的联合实验中，BAY 36-7620 的剂量为 3 mg/kg，静脉注射。在所有联合实验中，均在给予 BAY 36-7620 后 5 分钟进行测试。\n

---

\n\n\n颅内自刺激实验[4]
\n因此，它可以被视为颅内自刺激奖赏效能的阈值，向左或向右的偏移分别可以解释为奖赏效能的降低或增加。在测试前 20 分钟腹腔注射 MK-801（0 或 0.025 mg/kg），并在测试前 5 分钟腹腔注射 BAY 36-7620（0 或 10 mg/kg）。BAY 36-7620 悬浮于含有 2.5–5% Solutol® HS 15（12-羟基硬脂酸乙氧基化物）和 2.5–5% 乙醇（无水乙醇，99.8%）的溶剂中，或悬浮于含有 5–10% Cremophor（Cremophor EL®）和去离子水或 0.9% NaCl 的溶剂中。

[1]. BAY36-7620: a potent non-competitive mGlu1 receptor antagonist with inverse agonist activity. Mol Pharmacol. 2001 May;59(5):965-73.

[2]. Inhibition of metabotropic glutamate receptor 1 suppresses tumor growth and angiogenesis in experimental non-small cell lung cancer. Eur J Pharmacol. 2016 Jul 15;783:103-11.

[3]. Riluzole exerts distinct antitumor effects from a metabotropic glutamate receptor 1-specific inhibitor on breast cancer cells. Oncotarget. 2017 Jul 4;8(27):44639-44653.

[4]. Neuroprotective and behavioral effects of the selective metabotropic glutamate mGlu(1) receptor antagonist BAY 36-7620. Eur J Pharmacol. 2001 Oct 5;428(2):203-14.

我们利用嵌合型mGlu受体的数据表明，mGlu1的跨膜区（TM区）对于BAY 36-7620的抑制作用是必需的。此外，无论胞外结构域（ECD）是mGlu5、mGlu2还是DmGluA受体的ECD，BAY 36-7620的表观亲和力均相同，尽管后两者与mGlu1受体的ECD序列同一性仅为41%。在跨膜区内，我们发现mGlu1受体的TM4至TM7足以在mGlu5受体中形成BAY36-7620结合位点。这表明，与MPEP选择性作用的观察结果（Pagano等人，2000）相反，TM3在mGlu1受体对BAY36-7620的选择性识别中并不发挥作用。在TM4至TM7中，TM6在所有mGlu受体中均相同，因此不能参与BAY36-7620的特异性识别。但mGlu1和mGlu5受体在TM4、TM5和TM7中存在一些残基差异。初步实验表明，正如其他mGlu1选择性非竞争性拮抗剂CPCCOEt（Litschig等人，1999）所观察到的那样，mGlu1的TM7对于BAY36-7620的作用至关重要（Carroll、Kuhn、Pin和Prézeau，未发表数据）。最近有研究提出，CPCCOEt 和 mGlu5 选择性非竞争性拮抗剂 MPEP 相互作用于 mGlu1 和 mGlu5 受体中存在的相似空腔内（Litschig 等，1999；Pagano 等，2000）。事实上，已有研究表明，该结合口袋内仅有的几个残基决定了这两个分子的高选择性。根据我们的数据，BAY36-7620 很可能与这些其他非竞争性 mGlu 受体拮抗剂结合于同一空腔内。尽管还需要更多研究来进一步表征 BAY36-7620 的结合位点，但我们的数据足以证明 mGlu1 受体的跨膜区在 BAY36-7620 的拮抗作用中起着关键作用。值得注意的是，不仅 BAY36-7620，MPEP 也被发现是反向激动剂。此外，尽管在单独表达的天然mGlu1受体上未检测到CPCCOEt的反向激动剂活性（Litschig等人，1999），但我们最近发现，该化合物能够显著抑制与Gαq亚基共表达增强的mGlu1受体10-15%的非激动剂依赖性活性（F. Carroll，未发表数据），表明CPCCOEt是mGlu1受体的一种非常部分反向激动剂。综上所述，这些数据表明，在所有已证实与mGlu1或mGlu5受体跨膜区相互作用的非竞争性拮抗剂中，均具有反向激动剂活性。这与所有已知与这些受体胞外结构域（ECD）结合的竞争性拮抗剂形成鲜明对比。因此，我们提出mGlu1和mGlu5受体的天然组成活性更多地来源于其跨膜区而非胞外结构域。事实上，跨膜区（TM区）可能像视紫红质样GPCR一样，即使胞外结构域（ECD）保持非活性（开放）构象，也会在活性和非活性状态之间振荡。非竞争性拮抗剂与跨膜区的结合会稳定非活性状态，这与视紫红质样受体的情况类似。相反，竞争性拮抗剂与胞外结构域的结合会阻止激动剂的结合，并使其维持在非活性开放状态，但无法阻止这些受体跨膜区活性和非活性状态之间的平衡。综上所述，我们的研究鉴定了一种新的高选择性mGlu1受体拮抗剂，这将有助于进一步阐明该受体亚型在大脑中的作用。此外，我们的数据表明，BAY 36-7620是mGlu1的反向激动剂。由于mGlu1的组成型活性受选择性剪接调控（Prezeau等人，1996），该化合物将有助于区分mGlu1变体的某些作用。我们的研究进一步证实了作用于mGlu1和mGlu5受体跨膜区（TM区）的拮抗剂可以抑制其激动剂非依赖性活性。这些化合物的这种活性有助于阐明这些受体的TM区在其天然组成型活性中的具体作用。此外，BAY36-7620和MPEP的这种活性将有助于阐明mGlu受体组成型活性的潜在生理意义。值得注意的是，据报道，几种1型受体家族的反向激动剂具有中性拮抗剂所不具备的特异性，例如5HT2C（Barker等人，1994）或5HT1A（Albert等人，1999）受体。[1]代谢型谷氨酸受体1（mGlu1受体）在多种癌细胞类型中的表达高于正常细胞，这凸显了其在肿瘤行为中的潜在作用。本研究旨在探讨mGlu1受体在实验性非小细胞肺癌（NSCLC）中的作用。首先，与正常支气管上皮细胞相比，包括腺癌和鳞状细胞癌亚型在内的人类NSCLC细胞系中mGlu1受体的蛋白表达水平更高。使用 mGlu1 受体特异性抑制剂 BAY 36-7620 抑制 mGlu1 受体可抑制 A549 或 H1299 肿瘤小鼠的生长并延长其生存期。BAY36-7620 处理可抑制 A549 肿瘤中的 AKT 磷酸化，并且 BAY36-7620 预处理可阻断 L-奎斯奎酸（一种强效的 mGlu1 受体激动剂）诱导的 A549 细胞中的 AKT 磷酸化。BAY36-7620 处理可降低 A549 细胞的增殖。BAY36-7620 处理可提高 PARP 裂解水平并降低 bcl-2、HIF-1α 和 VEGF 的蛋白表达。相反，L-奎斯奎酸处理降低了PARP裂解水平，并增强了bcl-2、HIF-1α、VEGF和IL-8的蛋白表达，而与MK2206（一种AKT抑制剂）共同孵育可逆转这些作用。BAY36-7620预处理阻断了VEGF诱导的HUVECs中AKT的磷酸化。L-奎斯奎酸处理HUVECs可增强毛细血管管状结构的形成，而与MK2206共同孵育可逆转这种作用。此外，mGlu1受体敲低抑制了A549或H1299肿瘤小鼠的肿瘤生长并延长了其生存期。总之，抑制mGlu1受体可抑制实验性非小细胞肺癌（NSCLC）的肿瘤生长和血管生成。[2]

---

由于对其作用机制的了解有限，利鲁唑在乳腺癌治疗方案中的应用受到阻碍。本研究采用药理学方法，在一系列人乳腺癌细胞系中研究了利鲁唑的抗肿瘤作用，并与已知的谷氨酸受体拮抗剂BAY 36-7620的作用进行了比较。两种药物均对细胞增殖、细胞周期和DNA损伤标志物产生细胞系依赖性影响。两种药物均抑制细胞生长和细胞数量，同时改变参与细胞周期调控和致癌通路基因的表达。利鲁唑和BAY 36-7620均可诱导细胞死亡，但它们在细胞周期中的作用不同。利鲁唑诱导的细胞死亡伴有有丝分裂阻滞，而BAY 36-7620诱导的细胞死亡对细胞周期没有显著影响。利鲁唑诱导细胞发生显著的代谢变化，包括氧化磷酸化降低和细胞代谢物水平改变，提示利鲁唑在细胞代谢中可能发挥新的作用。某些细胞系对利鲁唑或 BAY 36-7620 表现出不同的敏感性。这些数据支持不同的药物诱导的细胞周期抑制机制，从而导致细胞死亡。[3] 有趣的是，研究发现 BAY 36-7620 甚至能够减弱非竞争性 NMDA 受体拮抗剂的一些行为效应，例如刻板的梳理或舔舐行为，以及它们对颅内自我刺激的促进作用。在类似条件下测试时，苯丙胺或阿扑吗啡诱导的刻板行为不受 BAY 36-7620 的影响。因此，可以得出结论，BAY 36-7620 与非竞争性 NMDA 受体拮抗剂之间的行为相互作用是特异性的，而不仅仅是药物诱导的（受刺激的）行为抑制的结果。 BAY 36-7620 对苯丙胺诱导的行为刺激/刻板行为无影响，这表明先前在行为学研究中观察到的 mGlu 受体对多巴胺能神经传递的调节作用，涉及的并非 mGlu1 受体，而是其他类型的 mGlu 受体（例如，Kim 和 Vezina，1998a；Kim 和 Vezina，1998b；Kronthaler 和 Schmidt，1996）。BAY 36-7620 能够完全阻断 MK-801 诱导的颅内自刺激的促进作用，这一发现提示 mGlu1 受体拮抗剂可能降低非竞争性 NMDA 受体拮抗剂的滥用潜力。因此，有必要开展进一步的实验，直接研究BAY 36-7620与非竞争性NMDA受体拮抗剂的正强化刺激特性之间的相互作用，并通过自我给药范式进行评估。目前获得的mGlu1受体拮抗剂和NMDA受体拮抗剂之间的行为相互作用，与先前报道的mGlu1受体（或I组mGlu受体）激活促进NMDA受体功能的结果相符，这在不同的体外实验中均有观察到（例如，Fitzjohn等人，1996；Martin等人，1997；Pisani等人，1997；Rahman和Neuman，1996）。然而，正如本研究观察到的，并非所有非竞争性NMDA受体拮抗剂诱导的行为效应都受到BAY 36-7620的类似影响，这表明mGlu1受体的调节作用取决于NMDA受体在大脑中的定位，而NMDA受体正是PCP或MK-801特定行为效应的基础。鉴于这种差异性相互作用，以及mGlu1受体拮抗剂与MK-801联合治疗在谷氨酸损伤的细胞培养物中显示出叠加的神经保护作用（Faden等人，2001），研究NMDA受体拮抗剂的神经保护和抗惊厥作用在多大程度上受到BAY 36-7620联合治疗的影响，将具有重要意义。[4]

C19H18O2

278.345025539398

278.131

C, 74.24; H, 6.89; N, 13.67; O, 5.20

232605-26-4

9903757

Typically exists as solid at room temperature

471.861ºC at 760 mmHg

199.799ºC

0mmHg at 25°C

1.633

3.891

26.3

0

2

2

21

455

2

O1C([C@]2(CC3C=CC4C=CC=CC=4C=3)CC(=C)C[C@@H]2C1)=O

CVIRWLJKDBYYOG-MJGOQNOKSA-N

InChI=1S/C19H18O2/c1-13-8-17-12-21-18(20)19(17,10-13)11-14-6-7-15-4-2-3-5-16(15)9-14/h2-7,9,17H,1,8,10-12H2/t17-,19+/m1/s1

(3aS,6aS)-5-methylidene-3a-(naphthalen-2-ylmethyl)-1,4,6,6a-tetrahydrocyclopenta[c]furan-3-one

BAY-36-7620; BAY367620; BAY 367620; 232605-26-4; BAY-367620; BAY367620; 1H-Cyclopenta(C)furan-1-one, hexahydro-5-methylene-6a-(2-naphthalenylmethyl)-, (3aS,6aS)-; (3aS,6aS)-5-methylidene-3a-(naphthalen-2-ylmethyl)-1,4,6,6a-tetrahydrocyclopenta[c]furan-3-one; 0P934RSF8B; CHEMBL254372; BAY 36-7620

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。