| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 1mg |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| 500mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
PKC/protein kinase C
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| 体外研究 (In Vitro) |
Ro 31-8820、H89、Ro 31-6045和H85对S6K体外活性的影响[2]
双吲哚基马来酰亚胺（Ro 31-8220和Ro 31-6045）和异喹啉磺酰胺类似物（H89和H85）都被设计为与ATP竞争结合激酶的活性位点。为了确定所有抑制剂是否直接影响S6K活性，在血清刺激的HEK293细胞中表达表位标记的野生型S6K，进行免疫纯化，并在不同剂量的每种抑制剂下检测活性（图3）。虽然Ro 31-8220、H89和H85在体外都抑制了S6K，但Ro 31-6045在100μM以下没有影响，表明该化合物可能通过抑制上游信号通路起作用。 Ro 31-6045对PDK1信号传导的影响[2] PDK1催化的S6K激活环中T229的磷酸化是该激酶最具特征的激活机制。PDK1还通过同源残基的磷酸化激活其他AGC激酶家族成员，包括Akt、PKA和PKC。虽然PKA和PKC已被证明对Ro 31-6045的抗性高达100μM，但理论上Ro 31-6044可能抑制PDK1，并且抗性激酶需要较低水平的PDK1活性。为了测试这种可能性，进行了Ro 31-6045对Akt（与S6K关系最密切的激酶）影响的详细剂量-反应曲线（图4A）。Akt受到弱抑制，IC50>50μM，比S6K高10倍。此外，在高达100μM的浓度下，Ro 31-6045对HEK293细胞中外源表达的PDK1的活性没有影响（图4B），这与PKA和PKC的耐药性一致，表明Ro 31-6044不通过PDK1起作用。 我们使用放射性配体结合研究来确定七种双吲哚基马来酰亚胺类似物对人毒蕈碱M1-M4受体的亲和力，其中六种是蛋白激酶C的选择性抑制剂。这些化合物在M1受体上最有效，Ro-31-8220是最有效的类似物，M1受体的Kd为0.6微M。最弱的化合物，双吲哚基马来酰亚胺IV和双吲哚基马来酰亚胺V，Kd值为100微M。如果在涉及毒蕈碱受体的研究中需要使用浓度为10微M或更高的蛋白激酶C抑制剂，那么双吲哚基马来酰亚胺IV可能是最合适的抑制剂[1]。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
丝裂原刺激的蛋白激酶p70（s6k）/p85（s6k）（s6k）在细胞增殖和生长中起着至关重要的作用，s6k信号通路的抑制剂显示出作为抗肿瘤治疗剂的前景。在这里，我们报告说，双吲哚基马来酰亚胺衍生物Ro 31-6045，以前被报道为激酶抑制剂无活性，在体内抑制S6K活性，IC50=8微M。使用S6K突变形式的结构/功能分析表明，Ro 31-6045的抑制作用与上游激活剂mTOR无关。Ro 31-6045将被证明有助于阐明S6K的复杂激活机制，其与mTOR的独立性将允许确认使用mTOR抑制剂雷帕霉素获得的功能数据[2]。
Ro 31-8220、H89、Ro 31-6045和H85对S6K体内激活的影响[2] 为了寻找S6K信号传导的选择性抑制剂，我们研究了两种常用的AGC家族激酶抑制剂的体内效力，即蛋白激酶C（PKC）抑制剂Ro 31-8220和蛋白激酶A（PKA）抑制剂H89，它们已被证明在体外抑制S6K。它们的非活性类似物Ro 31-6045和H85被纳入作为特异性对照（图1）。Ro 31-8220和H89显著抑制EGF诱导的成纤维细胞S6K活化，IC50值分别为600 nM和3μM。令人惊讶的是，Ro 31-6045也抑制了S6K，IC50=8μM，抑制了H85，IC50=25μM。这些化合物在5μM时均未抑制相关激酶Akt，该浓度显著抑制了S6K的激活（图2A，B）。有趣的是，Ro 31-8220和H89都可重复地增强Akt活性。 Ro 31-6045对S6K突变体体内激活的影响[2] 为了进一步阐明Ro 31-6045的作用机制，我们确定了这种抑制剂对一些S6K结构/功能突变体活性的影响。S6K由一种复杂的机制激活，该机制涉及渥曼青霉素敏感的PI3K激活和通过雷帕霉素敏感激酶mTOR的信号传导。具有疏水基序磷酸化位点和三个被酸性残基取代的自抑制位点（dED3E）的S6K突变形式对渥曼青霉素和雷帕霉素的失活具有抗性。删除激酶C端和N端的部分导致突变体（ΔNΔC）对雷帕霉素保持抗性，但对渥曼青霉素敏感，表明这两个过程之间存在明显差异。由于这两个突变体都在PI3K依赖性激活剂PDK1的靶位点T229上磷酸化，因此这种双缺失突变体很可能揭示了一种新的信号通路。由于这些突变体明显区分了两种激活途径，因此对每种途径进行了Ro 31-6045抑制敏感性测试（图5A）。与渥曼青霉素一样，在将双截短突变体和野生型酶的活性降低80%的浓度下，Ro 31-6045未能显著抑制组成型活性dED3E突变体的活性。使用磷酸化T389抗体对这些提取物进行的蛋白质印迹分析表明，Ro 31-6045对野生型和ΔNΔC的抑制伴随着Thr-389磷酸化降低到与基线相似的水平（图5B），这与该关键调控位点的抑制剂靶向磷酸化一致。事实上，用谷氨酸替代T389使ΔNΔC对Ro 31-6045完全耐药（图5A），证实T389磷酸化是抑制的关键靶点。 |
| 酶活实验 |
S6K、Akt和PDK1活性测定[2]
如前所述，使用40S核糖体作为底物测定内源性S6K活性。如前所述，对Myc标记的p70s6k进行免疫沉淀和检测。如前所述，使用RPRATF肽作为底物测定Akt活性。结果以每毫克蛋白质裂解物的活性单位或对照值的百分比表示。一个单位的活性导致每分钟将1pmol的32Pi转移到相应的底物上。myc标记的PDK1的自磷酸化活性基本上如前所述进行测定。简而言之，myc-PDK1是从250μg瞬时转染的HEK293细胞提取物中免疫沉淀出来的，洗涤后的免疫复合物在30°C下在总体积为20μl的25 mM Tris-HCl pH 7.5、0.5 mM二硫苏糖醇、0.5 mM苯甲脒、50μM[γ-32P]ATP（5000 cpm/pmol）和10 mM MgCl2中孵育20分钟。通过在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸来停止反应，并通过SDS-PAGE解析蛋白质。通过干燥凝胶的放射自显影观察PDK1的磷酸化，并通过切除条带的液体闪烁计数进行定量。 |
| 细胞实验 |
细胞培养和细胞提取物的制备[2]
HEK293和Balb/c 3T3细胞在37°c、5%CO2气氛下，在添加了10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中维持。Balb/c 3T3细胞以每10 cm板2×10^6个的速度铺板24小时，然后在不含血清的DMEM中培养24小时使其静止。用含有120mM NaCl和20mM HEPES（pH 7.4）的HEPES缓冲溶液冲洗血清饥饿细胞两次。然后在37°C下用5 nM EGF处理细胞5分钟。或者，如所示，用不同浓度的Ro 31-8220、H89、Ro 31-6045或H85预处理细胞20分钟。刺激后，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞两次，并在含有50 mM Tris、pH 7.5、120 mM NaCl、1%Nonidet-P40、1 mM EDTA、50 mM NaF、40 mMβ-甘油磷酸、0.1 mM钒酸钠、1 mM苯甲脒、0.5 mM苯甲磺酰氟的缓冲液中裂解。用塑料刮刀收集细胞提取物，并在12℃下在4°C下离心15分钟进行清除 000×g.以牛血清白蛋白为标准，采用Bradford法测定蛋白质浓度。将上清液的等分试样冷冻在液氮中，并储存在-70°C下。 瞬时转染[2] 将HEK293细胞以每10 cm板1×10^6个的速度铺板，铺板后24小时，使用如前所述的磷酸钙法或用myc表位标记的PDK1用p70s6k表达构建体转染。使用的构建体是野生型（2B4）；组成型活性、雷帕霉素和渥曼青霉素抗性（dED3E），T389和T421突变为谷氨酸，S411、S418和S424突变为天冬氨酸残基；雷帕霉素抗性、渥曼青霉素敏感的双截短突变体（ΔNΔC）缺失残基1-54和389-502，ΔNΔC与T389突变为谷氨酸（ΔN△C389E）。转染后24小时，将细胞血清饥饿24小时。血清饥饿后，用HEPES缓冲液冲洗细胞，用20%血清刺激20分钟。或者，如所示，用不同浓度的Ro 31-8220、Ro 31-6045、H89或H85预处理细胞。刺激后，如上所述洗涤并收获细胞。 |
| 参考文献 |
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| 其他信息 |
Ro 31-6045 属于吲哚类化合物。除了有助于分析 S6K 信号通路外，Ro 31-6045 还可能成为开发具有重要治疗价值的 S6K 信号通路特异性抑制剂的先导化合物。维持持续高水平的蛋白质合成是肿瘤形成的基本要求。过去一年，S6K 信号通路拮抗剂雷帕霉素的类似物已在临床前和 I 期研究中进行了测试，初步证据表明其在肾细胞癌和非小细胞肺癌中具有抗肿瘤作用。事实上，通过观察发现 S6K 基因扩增且其蛋白在多种乳腺癌细胞系和 8% (68/698) 的原发性肿瘤中过表达，推断 S6K 在乳腺癌中发挥着特定作用。总之，我们已鉴定出双吲哚基马来酰亚胺衍生物Ro 31-6045是一种S6K的体内抑制剂。利用S6K突变体进行的结构/功能分析表明，Ro 31-6045靶向T389磷酸化，且该过程独立于上游激活因子mTOR。该抑制剂将有助于阐明S6K复杂的激活机制，并且与耐药突变体S6K（dED3E）联用，该试剂可用于在细胞系统中进行不依赖雷帕霉素的S6K信号通路分析。此外，Ro 31-6045可能为开发S6K特异性肿瘤生长抑制剂提供先导化合物。[2]
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| 分子式 |
C21H15N3O2
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|---|---|
| 分子量 |
341.362704515457
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| 精确质量 |
341.116
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| 元素分析 |
C, 73.89; H, 4.43; N, 12.31; O, 9.37
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| CAS号 |
113963-68-1
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| PubChem CID |
2400
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| 外观&性状 |
Orange to red solid powder
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| 密度 |
1.5±0.1 g/cm3
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| 沸点 |
655.7±55.0 °C at 760 mmHg
|
| 熔点 |
271°C
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| 闪点 |
350.3±31.5 °C
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| 蒸汽压 |
0.0±2.0 mmHg at 25°C
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| 折射率 |
1.794
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| LogP |
3.65
|
| tPSA |
68.96
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
2
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| 氢键受体(HBA)数目 |
2
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| 可旋转键数目(RBC) |
2
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| 重原子数目 |
26
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| 分子复杂度/Complexity |
604
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| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
O=C1C(C2=CNC3C=CC=CC2=3)=C(C(N1C)=O)C1=CNC2C=CC=CC1=2
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| InChi Key |
SWAWYMIKGOHZMR-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C21H15N3O2/c1-24-20(25)18(14-10-22-16-8-4-2-6-12(14)16)19(21(24)26)15-11-23-17-9-5-3-7-13(15)17/h2-11,22-23H,1H3
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| 化学名 |
3,4-bis(1H-indol-3-yl)-1-methylpyrrole-2,5-dione
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| 别名 |
bisindolylmaleimide v; 113963-68-1; 1-Methyl-3,4-bis(3-indolyl)maleimide; 3,4-di(1H-indol-3-yl)-1-methyl-1H-pyrrole-2,5-dione; Ro 31-6045; 3,4-bis(1H-indol-3-yl)-1-methylpyrrole-2,5-dione; 2,3-bis(1H-Indol-3-yl)-N-methylmaleimide; 1H-Pyrrole-2,5-dione, 3,4-di-1H-indol-3-yl-1-methyl-; Ro-31-6045
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.9295 mL | 14.6473 mL | 29.2946 mL | |
| 5 mM | 0.5859 mL | 2.9295 mL | 5.8589 mL | |
| 10 mM | 0.2929 mL | 1.4647 mL | 2.9295 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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