α2A-adrenoceptor antagonist (Ki = 8.5 nM)

BRL 44408是一种强效（Ki=8.5 nM）和选择性（>50倍）的α2A肾上腺素受体拮抗剂（K（B）=7.9 nM）[1]。

在大鼠中，BRL 44408穿透中枢神经系统，导致脑和血浆峰值浓度分别为586 ng/g和1124 ng/ml。在药效学试验中，用BRL 44408对在固定比率30操作反应范式下反应的大鼠进行预处理，导致可乐定剂量反应曲线向右移动，这表明体内存在α2肾上腺素受体拮抗作用。与突触前自身受体拮抗和神经递质释放的强直性调节一致，BRL 44408的急性给药提高了内侧前额叶皮层中去甲肾上腺素和多巴胺的细胞外浓度，但没有血清素。此外，BRL 44408可能通过抑制α2A异质受体，使皮质乙酰胆碱水平显著增加。在强迫游泳试验和时间表诱导的多饮试验中，BRL 44408分别通过剂量依赖性地减少不动时间和辅助饮水量产生抗抑郁样反应，而在内脏疼痛模型中，BRL 44408通过减少对苯醌（PPQ）诱导的腹部拉伸表现出镇痛活性。最后，BRL 44408不会导致整体运动协调能力下降，也不会改变整体运动活动。BRL 44408神经化学和行为特征的临床前特征表明，选择性拮抗α2A肾上腺素受体可能是治疗情绪障碍和内脏疼痛的有效策略。[1]

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急性呼吸窘迫综合征（ARDS）以急性缺氧性呼吸功能障碍或衰竭为特征，是肺部多器官衰竭的表现，最常见的危险因素是败血症。研究人员此前表明，阻断α2-肾上腺素受体（α2-AR）可以减轻内毒素诱导的大鼠肺损伤。α2A-肾上腺素受体（α2A-AR）是α2-AR的一个亚型，在炎症性疾病中起着关键作用，但其机制尚不清楚。在这里，他们探讨了特异性α2A-AR拮抗剂马来酸BRL 44408对盲肠结扎穿刺（CLP）诱导的大鼠ARDS的影响及其潜在机制。马来酸BRL 44408的预给药显著减轻了CLP诱导的肺组织组织损伤、巨噬细胞浸润、炎症反应和干湿比。然而，CLP组和CLP+BRL组的存活率没有统计学差异。CLP组细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）、p38MAPK和p65被激活，马来酸BRL 44408抑制了这些信号分子的激活，c-Jun N-末端激酶（JNK）和蛋白激酶A（PKA）的激活在这两组之间没有变化。马来酸BRL-44408降低了脂多糖（LPS）诱导的NR8383大鼠肺泡巨噬细胞中细胞因子的表达，并降低了ERK1/2、p38MAPK和p65的磷酸化。JNK和PKA不受LPS的影响。总之，这些发现表明，α2A-AR的拮抗作用改善了CLP诱导的急性肺损伤，并涉及ERK1/2、p38MAPK和p65通路的下调，与JNK和PKA的激活无关[2]。

放射性配体结合和cAMP积累测定[1]
用于放射性配体结合研究的膜是由表达人α2A肾上腺素受体cDNA的培养的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞制备的。收集汇合的单层，在50 mM Tris（HCl）、pH 7.4缓冲液中均质化，并在1000 g下离心。然后在35000 g下离心上清液，将所得沉淀用Tris缓冲液重新悬浮，并在-80°C下冷冻。在测定当天，将Tris缓冲液、BRL 44408、1nM[3H]MK 912（美国85 Ci/mmol）、2.5µg解冻的膜蛋白和0.5 mg PVT WGA SPA珠在96细胞微滴定Packard Optiplate的每个孔中合并在一起。使用四参数逻辑斯谛曲线拟合模型对不少于11个浓度的BRL 44408的%特异性结合数据进行回归分析，以得出IC50估计值。随后的Ki值由Cheng-Prusoff方程计算得出（Cheng&Prusoff，1973）。

大鼠药代动力学研究[1]
本研究对禁食（过夜）的雄性Sprague-Dawley大鼠（275-350 g）单次皮下注射10 mg/kg的BRL-44408后，进行了药代动力学表征。在给药后6小时内，每隔一段时间采集一次血液和脑组织样本，样本置于含有EDTA抗凝剂的试管中，并用去离子水以1:1的比例稀释。加入含有内标的乙腈进行蛋白质沉淀处理。将上清液转移至洁净的试管中，在37℃下用氮气吹干，然后用乙腈/去离子水[50:50 (v/v)]复溶，用于LC-MS分析。采用与 API4000 联用的 Agilent 1100 高效液相色谱仪 (HPLC) 进行 LC-MS 分析。分离在 Waters C-18 Xterra MS 色谱柱 (2.1×20 mm, 2.5 µm) 上进行，流动相为 10 mM 乙酸铵水溶液 (A) 和乙腈 (B)，流速为 400 µl/min，采用线性梯度洗脱，B 相比例在 5 min 内从 5% 升至 90%。质谱仪分别采用正离子电喷雾和多反应监测 (MRM) 模式进行操作。

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大鼠固定比率反应 (FR-30)[1]
成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠单独饲养，体重限制在自由摄食体重的约 85%。大鼠接受训练，在 FR-30 食物呈现程序下对反应杆做出反应。每日实验包含三个部分，每个部分均由10分钟的暂停期和10分钟的反应期组成。暂停期内，实验箱处于黑暗状态，且无预设后果。反应期内，实验箱内的照明灯亮起，按下操作杆会发出咔哒声。完成反应后，实验者会获得食物颗粒（45毫克无尘颗粒）。在每个暂停期开始时，分别以递增剂量腹腔注射（ip）可乐定（0.01–0.1毫克/千克）或5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT（0.1–1.0毫克/千克）。在拮抗剂研究中，于绘制可乐定累积剂量-反应曲线前30分钟，预先腹腔注射BRL-44408（10毫克/千克）或伊达唑啉（3.0毫克/千克）。 ED50 值定义为在有或无拮抗剂的情况下，可乐定或 8-OH-DPAT 使反应率降低 50% 的剂量。

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体内微透析[1]
微透析技术按先前描述的方法进行（Beyer 等，2002）。雄性 Sprague-Dawley 大鼠（280-350 g，美国查尔斯河实验室）用异氟烷麻醉，并通过立体定位手术将微透析导管置于内侧前额叶皮层（mPFC；相对于前囟和硬脑膜，AP +3.2 mm；ML +0.5 mm；DV -1.8 mm）上方。立体定位手术后24小时恢复期后，将带有4毫米活性膜的微透析探针（CMA/12；20 kDa截留分子量；CMA Microdialysis）以1 µl/min的流速（乙酰胆碱实验中为0.5 µl/min）灌注人工脑脊液（aCSF；125 mM NaCl、3 mM KCl、0.75 mM MgSO4、1.2 mM CaCl2；pH 7.4），并插入内侧前额叶皮层（mPFC）。探针插入3小时后，每隔30分钟（乙酰胆碱实验中为40分钟）收集自由活动大鼠的透析液。收集4个基线样本后，分别给予0.9%氯化钠溶液（生理盐水）或BRL-44408（10 mg/kg，皮下注射）。在药物存在的情况下，对自由活动的大鼠进行至少 3.5 小时的透析，并收集透析液。

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定时诱导多饮 (SIP)[1]
如前所述 (Platt 等，2008)，本研究使用雄性 Sprague-Dawley 大鼠（300-400 克；查尔斯河实验室）。实验在通风隔音的实验箱中进行（120 分钟），实验箱内配备有食物颗粒投放器、食槽和水瓶。实验在周二和周五进行，其余时间作为对照日。每次实验中，每分钟投放一粒食物颗粒（BioServ 45 毫克精密无尘颗粒），共投放 120 粒。在测试开始前 20 分钟，分别腹腔注射 BRL-44408（10–30 mg/kg）或水。测试结束后，测量饮水量（毫升）。计算饮水量（毫升），并以对照组饮水量的百分比表示，数据采用单因素方差分析（ANOVA）和 Dunnett 事后检验进行分析。

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对苯醌 (PPQ) 模型[1]
根据先前的方法（Siegmund 等，1957），在雄性 CD-1 小鼠（20–25 g）腹腔注射 2 mg/kg PPQ（溶于 4% 乙醇水溶液；Sigma-Aldrich）后，评估化合物缓解急性内脏（腹部）疼痛的能力。在给予PPQ前60分钟，腹腔注射BRL-44408（1–30 mg/kg）。PPQ给药后，将小鼠单独置于有机玻璃笼中，分别在PPQ注射后5分钟和10分钟开始，记录每1分钟的腹部扭体次数。数据采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett事后检验进行分析，结果以平均值±标准误（SEM）表示，代表疼痛行为逆转的百分比。

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转棒试验和运动活性[1]
为了检验BRL-44408对运动能力的潜在影响，我们使用加速转棒装置对雄性Sprague-Dawley大鼠（125–150 g）进行测试，方法如前所述（Dunham & Miya, 1957）。转棒试验的转速设定为在300秒内从0 rpm加速至40 rpm，大鼠在转棒上停留的最大时间设定为300秒。大鼠在第一天接受两次训练试验，随后分别接受单次注射赋形剂（0.9%氯化钠溶液）、BRL-44408（30 mg/kg，皮下注射）或吗啡（10 mg/kg，皮下注射）。数据采用重复测量方差分析进行分析，结果以平均值±标准误（SEM）表示，即大鼠从转棒上跌落的潜伏期（秒）。在给予BRL（3–30 mg/kg，腹腔注射）4小时后评估大鼠的运动活性。将大鼠置于开放式场地（90×90 cm 的有机玻璃箱，箱壁高 30 cm）中，并用悬挂在场地上方的摄像头记录其 5 分钟的运动情况，以便观察和记录整个场地。大鼠随机分为四组：假手术组、BRL-44408/BRL 组、CLP 组和 CLP + BRL 组。每组又分为两个亚组（CLP 后 6 小时或 24 小时），每个亚组包含 6 至 8 只大鼠。大鼠用 2% 戊巴比妥钠生理盐水（40 mg/kg，腹腔注射）麻醉。CLP 手术按先前描述的方法进行（Otero-Antón 等，2001）。简而言之，在腹部正中做一个 2 cm 的切口。暴露盲肠后，在回盲瓣远端结扎以避免肠梗阻，用18号针头穿刺一次，轻轻挤压使少量粪便从孔中流出，然后将盲肠放回腹腔，分层缝合腹部切口。立即皮下注射生理盐水3 ml/100 g体重进行复苏。假手术组和BRL组的大鼠接受常规手术操作，但不进行盲肠结扎或穿刺。术后将大鼠放回笼中，正常喂养。 CLP 后 5 小时，BRL 组和 CLP + BRL 组的大鼠腹腔注射 5 mg/kg BRL-44408 马来酸盐（溶于 1 ml 生理盐水中），而假手术组和 CLP 组的大鼠腹腔注射相同体积的生理盐水。[2]

BRL 44408 的药代动力学特性[1]
在雄性 Sprague-Dawley 大鼠中测定了 BRL 44408 的脑和血浆暴露量。单次皮下注射 10 mg/kg 后，发现该 α2A 肾上腺素受体拮抗剂能中等程度地穿过血脑屏障，脑和血浆的峰浓度分别为 586 ng/g 和 1124 ng/ml [脑/血浆比值 = 0.51，基于脑组织 AUC_0-inf 为 2344 (h/ng/g)，血浆 AUC_0-inf 为 4637 (h/ng/ml)]。两个隔室的峰浓度均在 2 小时测得（表 3）。

[1]. Preclinical characterization of BRL 44408: antidepressant- and analgesic-like activity through selective alpha2A-adrenoceptor antagonism. Int J Neuropsychopharmacol. 2010 Oct;13(9):1193-205.

[2]. α2A -AR antagonism by BRL-44408 maleate attenuates acute lung injury in rats with downregulation of ERK1/2, p38MAPK, and p65 pathway. J Cell Physiol. 2020 Oct;235(10):6905-6914.

总之，本系列实验描述了选择性α2A-肾上腺素能受体拮抗剂BRL 44408的受体和行为药理学。我们已证明，BRL 44408的急性治疗可在临床前模型中产生一系列神经化学和行为效应，包括抗抑郁样和镇痛活性。这些数据表明，选择性拮抗α2A-肾上腺素能受体可能是一种治疗情绪障碍和某些类型疼痛的有效机制。此外，基于其对乙酰胆碱（ACh）的神经化学效应，α2A-肾上腺素能受体拮抗作用可能有助于治疗认知缺陷，而认知缺陷通常表现为重度抑郁症和慢性疼痛的合并病理。[1]

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在此，我们证实了BRL-44408马来酸盐对脓毒症诱导的大鼠急性肺损伤（ALI）的肺保护作用及其在NR8383细胞系中的抗炎作用。我们的数据表明，这些效应与抑制ERK1/2、p38和p65通路激活有关，而对JNK和PKA没有影响。需要进一步研究以阐明α2A-AR与ERK1/2、p38MAPK和NF-κB通路之间的关系。[2] BRL 44408的药代动力学特性[1]
在雄性Sprague-Dawley大鼠中测定了BRL 44408的脑和血浆暴露量。单次皮下注射 10 mg/kg 后，发现该 α2A 肾上腺素受体拮抗剂能中等程度地穿过血脑屏障，脑组织和血浆中的峰值浓度分别为 586 ng/g 和 1124 ng/ml [脑组织：血浆比=0.51，基于脑组织中的 AUC0-inf 为 2344 (h/ng/g)，血浆中的 AUC0-inf 为 4637 (h/ng/ml)]。两个隔室中的峰值水平均在 2 小时测得（表 3）。

C17H21N3O4

331.366344213486

331.153

C, 61.62; H, 6.39; N, 12.68; O, 19.31

681806-46-2

681806-46-2;118343-19-4;

10382026

Light brown to brown solid powder

0.979

102.23

3

6

4

24

406

0

CC1C2=CC=CC=C2CN1CC3=NCCN3.C(=C\C(=O)O)\C(=O)O

DDIQGSUEJOOQQQ-BTJKTKAUSA-N

InChI=1S/C13H17N3.C4H4O4/c1-10-12-5-3-2-4-11(12)8-16(10)9-13-14-6-7-15-13;5-3(6)1-2-4(7)8/h2-5,10H,6-9H2,1H3,(H,14,15);1-2H,(H,5,6)(H,7,8)/b;2-1-

(Z)-but-2-enedioic acid;2-(4,5-dihydro-1H-imidazol-2-ylmethyl)-1-methyl-1,3-dihydroisoindole

BRL 44408 MALEATE; BRL-44408 maleate; 681806-46-2; BRL 44408 maleate salt; BRL-44408 maleate salt; 96KFS04PNM; UNII-96KFS04PNM; BRL-44408 (maleate);

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。