TTK protein kinase (also known as MPS1; IC50 = 1.7 nM)

CFI-402257 加速三阴性乳腺癌（TNBC）的有丝分裂并诱导有丝分裂分离错误和凋亡。[1]
为了研究 CFI-402257 在 TNBC 中的细胞效应，我们选择了三种常用的细胞系模型：MDA-MB-231、MDA-MB-468 和 MDA-MB-436。据报道，每个细胞系都是非整倍体并含有 TP53 突变，这是临床 TNBC 的特征。纺锤体组装检查点 (SAC) 的功能是阻止后期开始，直到所有染色体都充分附着在有丝分裂纺锤体上，从而确保有丝分裂期间染色体的正确分离。TTK 抑制会导致 SAC 失活和后期提前开始，并伴有染色体错误分离。为了评估 TTK 抑制对有丝分裂时间的影响，使用活细胞显微镜测量从核膜破裂 (NEBD) 到后期开始的时间。CFI-402257 处理 (150 nM) 在所有三个细胞系中显著将有丝分裂时间缩短了 2 到 3 倍（图 1A）。正如预期的那样，对有丝分裂细胞的评分发现，与 DMSO 对照组细胞相比，CFI-402257 处理的细胞中有丝分裂错误（例如滞后染色体、后期桥和多极分裂）显著增多（图 1B 和图 S1）。接下来，我们评估了 CFI-402257 处理是否能增强非整倍性，使用碘化丙啶 (PI) 染色测量 DNA 含量。低剂量 CFI-402257 (100 nM) 处理 72 小时对 DNA 含量的影响不大，但较高剂量 (400 nM) 在所有三个细胞系中可重复地增加了具有 >4n 含量细胞的占比（图 1C）。最后，我们确定由 72 小时处理诱导的非整倍性与凋亡的诱导相关（图 1D）。综上所述，这些在 TNBC 中的细胞效应与 TTK 抑制驱动的 SAC 消除一致，即加速有丝分裂进程并诱导有丝分裂错误、非整倍性和凋亡，这与其他 TTKis 的报道一致。

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全基因组 CRISPR/Cas9 筛选揭示 APC/C 功能受损赋予对 CFI-402257 的抗性。[1]
为了理解 CFI-402257 应答的介质，我们采用了功能基因组学方法。为每个模型生成了稳定表达 Cas9 的细胞系，并使用多伦多人类敲除混合文库 (18) 进行全基因组 CRISPR 筛选。我们采用阳性富集策略来选择赋予对 CFI-402257 抗性的基因敲除。细胞在含有 CFI-402257 或 DMSO 载体对照的培养基中连续培养。对每个细胞系尝试了三种不同浓度的 CFI-402257。在尝试的九次筛选中，有六次成功，表现为耐药细胞群的出现（MDA-MB-468 中一次，MDA-MB-436 中两次，MDA-MB-231 中三次），三次不成功（即未出现耐药细胞群，因为药物浓度过高）。一旦在 CFI-402257 损害混合细胞存活和增殖的初始滞后期后明显出现耐药群体，筛选即告结束（图 2A）。重要的是，转导了靶向 LacZ 的 sgRNA 的细胞与 CFI-402257 平行培养，以确保在筛选所用浓度下发生细胞死亡。使用 MAGeCK 算法评估了基线、DMSO 处理和耐药细胞群中 sgRNA 插入片段的靶向测序，以鉴定在耐药群体中显著富集的 sgRNA。CRISPR 文库在筛选开始和结束时代表性的比较表明，正如预期的那样，在最终的 CFI-402257 耐药群体中代表性降低（图 S2A）。在最终耐药群体中富集的单向导 RNA (sgRNA) 靶向那些其失活促进对 CFI-402257 抗性的基因。为了识别最可靠的候选基因，我们将每次筛选的候选基因列表修剪为仅包含富集 P 值 < 0.05 的基因，然后比较这六次筛选的列表。这项严格的分析揭示了 15 个基因，它们在每个细胞系的至少一次筛选中以及进行的六次筛选中的至少四次中显著富集（表 1 和图 S2B）。使用 Enrichr 分析评估这些候选基因，确定 APC/C 是两个不同基因本体数据库（GO 和 Jensen）中最显著富集的细胞组分。ANAPC13 和 ANAPC15 都是 APC/C 本身的组成部分，而 MAD2L1BP（更广为人知的名字是 p31(comet)）则通过拮抗有丝分裂检查点复合物来负调控 SAC。鉴于在我们的顶级候选基因中鉴定出 APC/C 组分，我们检查了 sgRNA 列表，并在各个细胞系中识别出其他 APC/C 组分，包括 MDA-MB-468 中的 ANAPC4、ANAPC5、CDC16、CDC20 和 CDC23；MDA-MB-436 中的 ANAPC4、CDC20 和 CDC16；以及 MDA-MB-231 中的 ANAPC5、ANAPC10 和 CDC27。总之，我们的功能基因组学方法揭示了在 SAC 失活后负责启动后期的复合物的众多组分，表明后期起始和有丝分裂进程的延迟是介导对 CFI-402257 抗性的一种机制，因此也是药物应答的一个潜在重要决定因素。

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失活 ANAPC4、ANAPC13 和 MAD2L1BP 赋予对多种 TTKis 的抗性。[1]
我们选择进一步研究在我们的 CFI-402257 筛选中鉴定为 TTKi 抗性介导因子的有丝分裂检查点复合物拮抗剂 MAD2L1BP 和 APC/C 组分 ANAPC13。我们还研究了 ANAPC4，它先前在 siRNA 筛选中被描述参与二倍体细胞对染色体不稳定性的耐受（表 S2）。为了确认这些候选基因能使 TNBC 抵抗 CFI-402257，我们使用筛选出的 sgRNA 通过 CRISPR/Cas9 编辑以及 siRNA 作为正交方法使它们失活。通过定量 PCR (qPCR)、Western blot 分析（当有足够抗体时）或测序确认了敲低和基因组编辑（图 3、图 S3 和 S4 以及表 S3）。在 CRISPR 编辑或 siRNA 敲低后，我们进行了集落存活实验，以确定基因操作对 CFI-402257 敏感性的影响。这两种方法都证实 ANAPC4、ANAPC13 和 MAD2L1BP 介导了 MDA-MB-231 细胞对 CFI-402257 的应答，因为对这些基因的遗传干扰导致 TNBC 对 TTK 抑制的抗性增加（图 3 A-C）。此外，我们发现，在 MDA-MB-231 细胞中，由这些基因敲低赋予的抗性与用 CFI-402257 处理后凋亡减少、非整倍性诱导减弱以及有丝分裂时间延长相关（图 3 D-I）。尽管在基础条件下有丝分裂错误率很高（图 1），但我们发现当敲低细胞用 CFI-402257 处理时，正常有丝分裂的数量增加（图 3 G-I）。在 MDA-MB-436 细胞中也观察到类似效应（图 S3）。我们接下来询问 ANAPC4、ANAPC13 和 MAD2L1BP 的遗传操作是否影响对其他已发表的选择性 TTKis 的敏感性，包括 MPI-0479605、NMS-P715 和 Mps-Bay2a。与 CFI-402257 相比，这些抑制剂在磺酰罗丹明 B (SRB) 剂量反应实验中表现出对 TNBC 存活率类似的效应，尽管它们的效力较低（图 4A）。与我们针对 CFI-402257 的结果一致，CRISPR/Cas9 和 siRNA 介导的 ANAPC4、ANAPC13 和 MAD2L1BP 敲低也赋予了对这些 TTKis 的抗性，尽管在不同细胞系和被操作基因之间以及在测试浓度下具有不同的外显率（图 4 B 和 C 以及图 S4）。

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对 CFI-402257 的反应与乳腺癌和肺癌细胞系中 APC/C 基因表达特征的降低相关。[1]
最后，我们试图研究我们功能基因组学筛选揭示的生物学机制是否可用于识别内在 CFI-402257 反应的生物标志物相关物。为一组 52 个可获得基因表达谱的乳腺癌细胞系生成了药物反应谱（图 5A 和表 S4）。我们假设 APC/C 组分或 MAD2L1BP 低表达的癌症对 CFI-402257 相对耐药。为了验证这一点，我们使用基因集富集分析 (GSEA) (24) 评估了包含 16 个 APC/C 基因和 MAD2L1BP 的基因集（图 5B）与 CFI-402257 反应之间的关联。我们发现 APC/C-MAD2L1BP 基因集与体外对 CFI-402257 的反应显著相关（图 5C）。有趣的是，在乳腺癌亚型中，APC/C-MAD2L1BP 基因集与 CFI-402257 反应的关联在 TNBC 模型中最为显著（图 5D）。在另一组独立的 20 个肺腺癌细胞系中评估该基因集，证实了这种关联（图 S5A）。然后，我们评估了一个定义为 16 个 APC/C 基因和 MAD2L1BP 平均表达的 APC/C-MAD2L1BP 基因特征（图 5B），并发现该元基因与乳腺癌细胞系中 CFI-402257 反应之间存在显著关联（图 S5B）。此外，在组成 APC/C-MAD2L1BP 基因集的 17 个基因中，我们发现仅由 ANAPC4 和 CDC20 组成的元基因与 CFI-402257 反应最强烈相关（图 5E）。为了探讨 APC/C 元基因作为 CFI-402257 反应的临床相关物的潜在效用，我们使用来自癌症基因组图谱 (TCGA) 的公共基因表达数据，调查了该两基因元基因评分在不同肿瘤类型中的变异性。这表明在乳腺癌和其他肿瘤内部存在显著变异性，重要的是，揭示了许多评分极低的离群值，这些可能代表对 CFI-402257 具有内在抗性的肿瘤（图 5F）。我们观察到的 APC/C 元基因评分的变异促使我们评估临床肿瘤中 APC/C 复合物遗传破坏的频率。先前的一项研究报告称，在 TCGA 泛癌数据集的近 8,000 个肿瘤中，高达 23% 存在 APC/C 复合物组分的点突变。我们针对 TCGA 乳腺癌的聚焦分析，考虑了可能导致功能丧失的体细胞 DNA 改变（即点突变和纯合缺失），在 4% 的原发肿瘤 (17/482) 中发现了这些改变，而在 46% 的病例 (222/482) 中基因表达下调是明显的（图 S6）。因此，临床癌症在 APC/C 功能标志物上表现出可测量的差异，根据我们的功能和相关性研究，这些差异被预测与 TTKi 反应相关。

1. 有丝分裂时间及错误分析：
o 通过双胸苷阻断法同步化TNBC细胞（MDA-MB-231/468/436）。
o 使用CFI-402257（150 nM）或DMSO对照处理。
o 活细胞显微镜测量从核膜破裂（NEBD）到后期开始的时间。
o 定量有丝分裂错误（滞后染色体、后期桥、多极分裂）。

2. DNA含量及非整倍性诱导：
o 用CFI-402257（100–400 nM，72小时）处理细胞。
o 碘化丙啶（PI）染色结合流式细胞术检测>4n DNA含量。

3. 凋亡实验：
o CFI-402257处理（72小时）后进行Annexin-V/PI染色。
o 流式细胞术定量凋亡细胞（Annexin V⁺）。

4. 全基因组CRISPR/Cas9抗性筛选：
o 用多伦多人类敲除文库转导Cas9表达的TNBC细胞系。
o 在CFI-402257压力下进行阳性选择（每个细胞系3个剂量）。
o MAGeCK算法鉴定抗性群体中富集的sgRNAs。

5. 功能验证（siRNA/CRISPR）：
o 通过siRNA敲低或CRISPR敲除ANAPC4、ANAPC13和MAD2L1BP。
o 集落存活实验确认CFI-402257抗性。
o 机制分析：敲低后有丝分裂时间、凋亡和DNA含量变化。

6. 对其他TTK抑制剂的交叉抗性：
o 对CFI-402257、MPI-0479605、NMS-P715、Mps-Bay2a进行剂量反应实验（SRB）。
o 在ANAPC4/ANAPC13/MAD2L1BP敲低细胞中验证抗性。

7. 药物基因组学分析：
o 在52个乳腺癌/20个肺癌细胞系中测试CFI-402257敏感性（AAC）。
o GSEA将APC/C基因特征（16个基因+MAD2L1BP）与药物反应关联。[1]

Disruption of the anaphase-promoting complex confers resistance to TTK inhibitors in triple-negative breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Feb 13;115(7):E1570-E1577. doi: 10.1073/pnas.1719577115.

Luvixasertib 是一种口服生物利用度高的选择性双特异性蛋白激酶 TTK（单极纺锤体 1 激酶，Mps1）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，luvixasertib 选择性地结合并抑制 Mps1 的活性。这会使纺锤体组装检查点 (SAC) 失活并加速有丝分裂，导致染色体排列错误和分离错误，以及有丝分裂检查点复合物不稳定。这可诱导 Mps1 过表达的癌细胞死亡。Mps1 是一种酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶，在增殖的正常组织中表达，对 SAC 的正常功能和染色体排列至关重要。Mps1 在多种人类肿瘤中过表达，并在肿瘤细胞的失控生长中发挥关键作用。

C28H30N6O3

498.5762

497.242

C, 70.00; H, 6.28; N, 14.07; O, 9.65

1610759-22-2

1610759-22-2;1610677-37-6 (HCl);

118086034

White to off-white solid powder

3.6

114

3

7

8

37

805

0

O([H])C1(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])(C([H])([H])N([H])C2=C([H])C(=NC3=C(C([H])=NN23)C2C([H])=C([H])C(=C(C([H])([H])[H])C=2[H])C(N([H])C2([H])C([H])([H])C2([H])[H])=O)OC2=C([H])N=C([H])C([H])=C2[H])C1([H])[H]

UEFIRPJHDWPZBI-CGSFZAOMSA-N

InChI=1S/C29H31N5O3/c1-18-11-20(6-9-23(18)28(35)33-21-7-8-21)24-17-32-34-25(24)12-22(37-27-5-3-4-10-30-27)13-26(34)31-16-19-14-29(2,36)15-19/h3-6,9-13,17,19,21,31,36H,7-8,14-16H2,1-2H3,(H,33,35)/t19-,29+

N-cyclopropyl-4-(7-((((1s,3s)-3-hydroxy-3-methylcyclobutyl)methyl)amino)-5-(pyridin-2-yloxy)pyrazolo[1,5-a]pyridin-3-yl)-2-methylbenzamide

CFI402257 CFI 402257 CFI-402257

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。