CP 113818

Cholesterol acyltransferase (ACAT)

在细胞测试中，CP-113818抑制 Aβ 的形成 [1]。
CP-113818是一种脂肪酸苯胺衍生物，旨在模拟ACAT的酰基辅酶a底物，是一种在体外和细胞培养中有效的ACAT抑制剂[1]。

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先前基于细胞的研究表明，ACAT抑制会减少胆固醇酯的产生，从而导致Aβ生成减少（Puglielli等人，2001）。在这些研究中，两种不同的ACAT抑制剂CP-113818和Dup128将胆固醇酯的产量降低了45%（Puglielli等人，2001）[1]。

CP-113818（0-7.1 mg/kg/天）可显着降低阿尔茨海默病模型小鼠的淀粉样蛋白病理学[1]。
在这里，我们评估了CP-113818在减少表达含有London（V717I）和Swedish（K670M/N671L）突变的人类APP（751）的转基因小鼠大脑中AD样病理的有效性。用CP-113818治疗两个月后，淀粉样斑块的积聚减少了88%-99%，膜/不溶性Aβ水平减少了83%-96%，同时脑胆固醇酯减少了86%。此外，脑匀浆中可溶性Abeta（42）减少了34%。空间学习略有改善，并与Abeta水平下降相关。在非转基因同窝中，CP-113818还减少了大脑内源性APP的胞外结构域脱落。我们的研究结果表明，ACAT抑制可能通过抑制Aβ肽的产生来有效预防和治疗AD。[1]

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为了确定CP-113818在降低小鼠脑胆固醇酯水平方面的体内疗效，我们最初用ACAT抑制剂治疗非转基因动物。大多数ACAT抑制剂在口服时吸收不良，并在血液或组织中迅速转化（Marzetta等人，1994）。为了尽量减少小鼠血清CP-113818水平的每日波动，我们通过可植入的缓释生物聚合物颗粒输送抑制剂。将含有CP-113818的颗粒通过手术插入背部皮肤下，以允许活性化合物在既定时间内以有效的零级动力学连续和受控释放（美国创新研究）。18只3个月龄的非转基因小鼠接受了含有0、0.2、1.6、3.2、4.8和7.1 mg/kg/天CP-113818的21天释放生物聚合物颗粒（每剂n=3；图1A）。这些研究中使用的最高剂量远低于大鼠的耐受剂量150mg/kg/天，即使考虑到这些动物的生物利用度相对较低（Marzetta等人，1994）。CP-113818（7.1 mg/kg/天）在对食物摄入和体重没有任何明显影响的情况下，将血清中的总胆固醇水平降低了29%（p<0.007）（图1A；数据未显示）。肝脏游离胆固醇和胆固醇酯也以剂量依赖的方式分别降低了37%（p<0.03）和93%（p<0.0004）（图1A）。正如预期的那样，CP-113818对大脑中的游离胆固醇水平没有影响，因为游离胆固醇在很大程度上固定在髓鞘中，不太可能受到ACAT活性的干扰。胆固醇酯的初始水平为2.2mg/g脑组织，与大鼠海马组织约3.5mg/g的报告值相似（Champagne等人，2003），相当于脑总胆固醇的约8%。我们发现，小鼠大脑中的游离胆固醇与胆固醇酯的比例约为10:1，但在富含髓鞘的神经元原代培养物中仅为3:1（补充图S1http://www.neuron.org/cgi/content/full/44/2/227/DC1).CP-113818（7.1 mg/kg）使小鼠脑中胆固醇酯水平降低了86%（p<0.0004；图1A）。因此，这些数据表明，7.1mg/kg/天的CP-113818能有效显著降低非转基因小鼠大脑中的胆固醇酯水平。[1]

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为了表征CP-113818治疗对AD样病理的影响，我们使用了hAPP小鼠，该小鼠在小鼠Thy-1启动子（mThyl-1hAPP751）的调控下表达含有London（V717I）和Swedish（K670M/N671L）突变的人类APP751（Rockenstein等人，2001）。这些动物分别在4个月和6个月大时在新皮层和海马体中出现可检测的斑块，并在6个月龄时开始出现记忆缺陷。鉴于我们之前的观察结果，CP-113818减少了Aβ的产生，而不是清除，我们使用相对年轻的hAPP小鼠来尽量减少初始Aβ的沉积。4.5个月龄的hAPP小鼠（n=12）服用了含有13mg CP-113818（7.2mg/kg/天）的60天释放生物聚合物颗粒，而年龄匹配的动物则植入了安慰剂颗粒（n=12）。最近的报告表明，在各种AD转基因小鼠模型中，雌性小鼠的Aβ和淀粉样蛋白病理水平高于年龄匹配的雄性小鼠，Callahan等人，2001年，Lee等人，2002年，Wang等人，2003年，洛伐他汀可能以性别特异性的方式发挥作用（Park等人，2003）。因此，我们在安慰剂组和CP-113818组中纳入了相似数量的雄性和雌性动物，以检测抑制剂在我们的小鼠模型中可能的性别特异性作用。在Morris水迷宫（MWM）试验4天后，在第57天处死动物以确保抑制剂的持续存在。在7.2 mg/kg/天的CP-113818剂量下，肾上腺皮质细胞中没有发现毒性的组织学证据，这是ACAT抑制剂的潜在类别相关效应（图1B）。血清总胆固醇和肝脏游离胆固醇/胆固醇酯降低到与之前在非转基因动物中观察到的水平相似的水平（图1A和1C）。值得注意的是，用CP-113818治疗2个月的hAPP小鼠的肝脏胆固醇酯水平降低了87%（p<0.0001）（图1C）。综上所述，这些实验表明，在没有肾上腺毒性的情况下，CP-113818治疗2个月有效地降低了hAPP小鼠的胆固醇酯水平。评估这些动物大脑中Aβ负荷的组织要求排除了直接检查其脑胆固醇酯水平的可能性。[1]

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接下来，我们使用夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）测量了脑匀浆中70%甲酸提取物（“不溶性”aβ）和相同匀浆的初始Tris缓冲盐水（TBS）部分（可溶性aβ）中的aβ1-40和aβ1-42水平。与斑块负荷相似，Aβ水平差异很大，正如转基因小鼠在病理早期所预期的那样，Johnson Wood等人，1997年，Kawarabayashi等人，2001年。用CP-113818处理后，甲酸组分中的Aβ1-40和Aβ1-42浓度降至几乎检测不到的水平。在用CP-113818治疗后，所有动物的“不溶性”Aβ1-40总体下降了92%（p<0.024），“不溶的”Aβ1-42总体下降了83%（p<0.032），Aβ1-42/Aβ1-40比值没有显著差异（图3A）。由于大脑提取物是从包括皮质和海马在内的整个半球获得的，因此该年龄段男性和女性Aβ水平的差异因男性海马中缓慢发展的淀粉样蛋白病理而加剧（见图2B）。根据性别进行分析时，只有女性“不溶性”Aβ充分升高，CP-113818治疗后Aβ1-40下降了96%（p<0.014），Aβ1-42下降了90%（p<0.01；图3A）。重要的是，初始TBS组分中的可溶性Aβ水平也降低了，Aβ1-42显著降低了34%（p<0.0014）。这种下降在两性中都具有统计学意义。可溶性Aβ1-40水平接近检测限，但在所有动物中都观察到下降趋势（20%），仅在雄性动物中显著（图3B）。因此，三种不同的检测方法，硫黄素S和Aβ染色以及AβELISA，独立表明CP-113818治疗在减少hAPP小鼠淀粉样蛋白病理方面非常有效。可溶性Aβ的减少表明CP-113818可能减少Aβ的产生或加速其分解代谢或清除。[1]

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为了分析CP-113818治疗对hAPP小鼠认知功能的影响，我们对动物进行了MWM空间学习和记忆测试。由于hAPP小鼠从6个月大开始出现认知缺陷，与非转基因同窝小鼠相比，我们研究中6.5个月大的动物预计只会因Aβ积累而出现轻微恶化。一致地，与同窝动物相比，发现水下平台所需的游泳路径长度和时间潜伏期仅显示转基因动物的空间学习和记忆受到轻微干扰。仅在雌性转基因小鼠中观察到Aβ积累导致的认知功能明显受损。在这些动物中，CP-113818治疗逆转了观察到的空间学习障碍（p<0.014；图4）。与安慰剂相比，CP-113818治疗在第1天和第3天之间显著改善了学习（p<0.016）。CP-113818治疗不影响非转基因雌性小鼠的空间表现，这与这些动物缺乏Aβ沉积是一致的。仅在第4天，CP-113818治疗的雄性非转基因动物在游泳路径方面的表现优于安慰剂治疗的队列（p<0.04；补充图S3http://www.neuron.org/cgi/content/full/44/2/227/DC1)但不能逃避潜伏期；然而，两组在第1天和第3天或第4天之间的改善是相同的。当用CP-113818治疗时，所有hAPP小鼠加在一起显示出快速完成任务的趋势，并在第3天达到性能平稳期（p<0.07；图4）。这可能是由于最大游泳速度造成的天花板效应。与安慰剂相比，CP-113818治疗在第1天和第3天之间的改善是显著的（p<0.033）。正如预期的那样，CP-113818没有引起突触素免疫反应性评估的突触密度的显著变化，这与非转基因动物与转基因动物在幼年时没有差异是一致的（补充图S4）。尽管需要在更大的年龄对更多的小鼠进行测试，以进一步评估淀粉样蛋白病理减少对空间学习和记忆的影响，但MWM测试中表现的改善与CP-113818治疗的雌性动物的总体斑块负荷和aβ的显著降低密切相关。[1]

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在用CP-113818治疗的第54至57天之间，每天对每只动物进行三次行为性能评估空间导航，持续4天。在每个Morris水迷宫（MWM）试验中，测量了游泳路径（到达平台所需的长度，单位为米）和逃避潜伏期（到达平台的秒数）。前两个面板显示了我们研究中所有动物的数据，无论性别如何。除了hAPP转基因小鼠外，我们还在这项研究中使用了相同数量的未经治疗和经CP-113818治疗的非转基因同窝小鼠。结果显示，与非转基因小鼠相比，转基因小鼠的MWM试验仅略有损伤，因此由于CP-113818减少了淀粉样蛋白的积累，几乎没有改善的余地。下图仅显示了雌性小鼠的结果。与雄性队列相比，雌性淀粉样蛋白负荷增加了2倍，与非转基因同窝动物相比，只有雌性转基因动物的表现明显下降。CP-113818治疗改善了雌性队列的这一表现（第3天p<0.014），因此治疗过的hAPP转基因动物在游泳路径和逃避潜伏期测试中的表现与非转基因动物相似。数据表示平均值±SEM；n=每只动物每天3次试验；用Mann-Whitney U检验计算统计差异。[1]

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我们之前的基于细胞的研究表明，ACAT抑制会减少Aβ的产生，并改变所有三种分泌酶对APP的加工（Puglielli等人，2001）。为了确定CP-113818处理是否改变了hAPP小鼠的脑APP加工，我们首先通过SDS-PAGE解析甲酸提取的脑蛋白，以检测APP及其蛋白水解衍生物。Western blot分析显示，甲酸提取的全长APP和APP C末端片段（CTFs）C83和C99未被CP-113818改变。然而，用ACAT抑制剂处理后，α和β分泌酶（sAPP）的分泌切割产物水平都降低了，尽管不如Aβ显著（补充图S5http://www.neuron.org/cgi/content/full/44/2/227/DC1).在CTF没有变化的情况下抑制sAPP的产生有点令人惊讶，这可能是甲酸提取引起的伪影。由于经处理的hAPP小鼠的组织已用甲酸提取或固定用于组织学研究，我们观察了MWM测试中使用的非转基因同窝小鼠的总脑裂解物中APP CTF的水平。使用非转基因动物进行这些实验也可以评估CP-113818对内源性APP加工的影响。CP-113818降低了非转基因同窝动物的肝脏胆固醇/胆固醇酯和血清胆固醇，与图1C所示的转基因动物相似（数据未显示）。与安慰剂治疗的小鼠相比，CP-113818治疗动物的脑裂解物中内源性小鼠APP-CTF水平降低了44%（n=8；p<0.005；值标准化为APP全蛋白水平；图5A和5B）。由于蛋白质负载量高，在低分子量范围内涂抹，我们无法从这些样品中分辨出C99和C83（图5A）。然而，我们能够在初始匀浆的可溶性TBS部分中特异性检测到分泌的APPα（sAPPα），这是α-分泌酶切割的N-末端产物。在CP-113818处理的动物中，sAPPα呈下降趋势（3.4%；p<0.014=不显著），而总sAPP（包括β分泌酶产物sAPPβ）显著降低了19.1%（p<0.038；图5A和5B）。总sAPP和sAPPα之间的比率下降了36%（p<0.013），表明ACAT抑制剂治疗的小鼠对α-分泌酶的抑制不如其他胞外结构域脱落蛋白酶（如BACE）明显。接下来，我们询问了非转基因脑裂解物中的CP-113818是否影响γ分泌酶成分水平和γ活性。我们没有检测到PS1 N端和C端片段、尼卡司汀和pen-2水平的显著变化（图5C；与所有其他图一样，显示了16个样本中的8个）。尼卡司汀的成熟也不受CP-113818治疗的影响。为了检测APP以外底物的γ和α分泌酶样活性的潜在变化，我们测试了两种γ分泌酶底物，Notch和N-cadherin De Strooper等人，1999年；Marambaud等人，2003年。众所周知，这两种蛋白质都会经历α-分泌酶样切割，由Notch的TACE和N-钙粘蛋白的金属蛋白酶介导。Brou等人，2000年；Marambaud等人，2003年。Notch细胞内结构域（NICD）代表最终的γ-分泌酶切割产物，其水平表明Notch的α-分泌酶样和γ-分泌蛋白酶活性的变化。当蛋白质从非转基因小鼠脑裂解物中免疫沉淀时，CP-113818治疗的NICD水平在统计学上没有变化（图5C）。同样，N-钙粘蛋白-CTF1（金属蛋白酶切割的产物和γ-分泌酶的底物）的水平不受ACAT抑制剂的影响（图5C）。这些数据表明，CP-113818>不会改变至少两种γ-分泌酶底物的加工，这些底物的α-分泌酶样裂解也不受影响。CP-113818处理动物的脑裂解物中BACE蛋白水平也没有变化（图5D）。解释我们数据的一种机制是ACAT抑制可能导致APP和未知蛋白质之间的相互作用，阻断三种分泌酶对APP的访问，而不是直接抑制每种分泌酶。ApoE是脑脂质代谢和Aβ沉积/清除中的一种必需蛋白，其表达也不会因ACAT抑制而改变（图5D）。为了排除CP-113818在胆固醇代谢没有变化的情况下对APPβ和γ分泌酶切割的潜在直接影响，我们分别使用纯化的重组BACE1和分离自携带内源性γ分泌酶的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的膜组分进行了体外β和γ分泌物酶测定。BACE1和γ-分泌酶活性均不受反应混合物中CP-113818含量增加的影响（图5E和5F）。最后，我们测试了CP-113818是否直接调节锌或Aβ42-Bush等人（1994年）、Jarrett等人（1993年）促进的Aβ40的体外聚集。当锌（p<0.56）或Aβ42（p<0.96）促进时，CP-113818在体外未能直接抑制Aβ40的聚集（图5G）。在没有锌或Aβ42的情况下，单独使用Aβ40在4天内没有显著聚集（p<0.671）。总之，这些数据表明，在所有测试的对照蛋白的水平或处理没有任何明显变化的情况下，经CP-113818处理的非转基因小鼠大脑中的APP CTFs、总sAPP以及在较小程度上的sAPPα水平都降低了。尽管这些数据以及hAPP小鼠可溶性Aβ的减少强烈表明ACAT抑制剂可以减少Aβ的产生，但它们并不排除胆固醇代谢改变对Aβ聚集、分解代谢和/或清除的额外有益作用[1]。

体外荧光法测定BACE1活性[1]
荧光法β-分泌酶活性试剂盒用于体外检测BACE1活性。根据制造商的说明进行反应，并稍作修改。简而言之，将1μg纯化的重组人BACE1（研发系统）重新悬浮在10μl的1×细胞提取缓冲液中，并在不存在或存在指示量的CP-113818的情况下与EDANS/DABCYL-REEVNLDAEFKR底物肽一起孵育2小时。通过荧光板读数器测量释放的EDANS荧光。作为阴性对照，将特定的β-分泌酶抑制剂GL-189以指定浓度添加到其中一个样品中。

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APP细胞内结构域的体外生成[1]
膜制备和APP胞内结构域（AICD）的体外生成如Gu等人2001年、Kim等人2002年所述进行。P2膜组分由过表达野生型APP的CHO细胞制备，并用蛋白酶抑制剂重新悬浮在缓冲液H（20 mM HEPES，150 mM NaCl，10%甘油，5 mM EDTA[pH 7.4]）中。通过在0°C或37°C下将膜组分与指定量的CP-113818一起孵育1小时进行体外切割实验。作为阴性对照，向其中一个样品中加入了一种特定的γ-分泌酶抑制剂L-685458。

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浊度测定[1]
根据Jarrett等人（1993）的方法监测Aβ40聚集。简而言之，Aβ40（100μg/ml）在37°C下在384孔板（60μl/孔）的TBS中孵育。通过在400nm处跟踪吸光度来监测井浊度4天。 添加“老化”（在室温下预孵育2周）Aβ42（Aβ42/Aβ40=1/10）（Jarrett等人，1993）或锌/组氨酸缓冲液（350μM组氨酸中50μM Zn2+）（Bush等人，1994）可促进Aβ40聚集。不含Aβ40的样品的信号掩盖了测试孔的吸光度。对于某些实验，孵育缓冲液包括CP-113818（10μM）。

动物/疾病模型： C57BL/6、hAPP（人淀粉样前体蛋白）转基因小鼠[1]
剂量： 0、0.2、1.6、3.2、4.8 和 7.1 mg/kg/天
给药途径： 通过植入式缓释生物聚合物颗粒，非转基因小鼠给药 21 天，hAPP 小鼠给药 60 天
实验结果： 血清总胆固醇水平降低 29%，肝脏游离胆固醇和胆固醇酯分别降低 37% 和 93%，呈剂量依赖性。非转基因小鼠。在 hAPP 小鼠中，有效降低胆固醇酯水平，减少斑块数量，并减轻淀粉样蛋白负荷，且与性别无关，无肾上腺毒性。在hAPP转基因小鼠的大脑中，“不溶性”和可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的水平降低。在Morris水迷宫测试中，雌性hAPP小鼠的空间学习和记忆能力恢复正常。hAPP转基因小鼠减少了内源性APP的加工，但不影响Notch或N-cadherin的加工，并且不直接抑制非转基因同窝小鼠的β-和γ-分泌酶活性或Aβ聚集。\n

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\n动物和药物处理[1]
\nhAPP转基因小鼠在神经元特异性鼠(m)Thy-1启动子（mThy-1-hAPP751；相对于转基因为杂合子，C57BL/6 F3背景）的调控下，过表达带有伦敦(V717I)和瑞典(K670M/N671L)突变的人类APP751（Rockenstein等人，2001）。 hAPP品系是通过将转基因APP751小鼠与C57BL/6小鼠杂交而建立的。相应的同窝小鼠用于对照研究。所有小鼠均按照标准动物饲养规程饲养，自由摄取标准饲料，并置于JSW-Research公司单笼通风的无病原体环境中。每只小鼠的转基因状态均通过使用特异性引物和相应的杂交探针，对尾部组织进行实时PCR检测来确认。实验前，所有小鼠均接受改良的Irvine测试以评估其神经系统状态；出现神经系统紊乱的小鼠被排除在实验之外。随后，小鼠被随机分配到不同的处理组，并进行个体编码。进行行为学测试、生化分析和脑组织形态学评估的研究人员对小鼠的分组情况不知情。 CP-113818是一种强效的ACAT1和ACAT2抑制剂（Chang等人，2000）。只有测试化合物，而非载体生物聚合物和药丸中的其他物质，会释放到血液中。药丸的制备旨在提供21天或60天的持续药物释放。植入药丸时，动物先用异氟烷麻醉。然后，根据供应商的说明，使用特制精密套管针将含有CP-113818或安慰剂的无菌药丸皮下植入左肩前外侧。植入和治疗过程中未观察到明显的感染、不适或痛苦迹象，也无需额外止血。\n

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\n\n组织取样[1]
\n在最后一次MWM训练后的第二天，即治疗的第57天，处死动物。通过心脏穿刺采集血液，取全血清用于胆固醇测定。进行4℃ PBS经心灌注后，进行解剖。取出脑组织，沿矢状面切开，然后分别置于液氮中冷冻或浸入4%多聚甲醛溶液中固定，用于组织学评估。肝脏置于液氮中冷冻，肾上腺置于4%多聚甲醛溶液中固定，然后进行常规石蜡包埋和切片。对苏木精-伊红染色的 6–8 μm 切片进行分析，以检测 CP-113818 的毒性。\n

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\n\n脑斑块负荷和突触素分析 [1]
\n组织形态学分析中，从 12 只动物（6 只安慰剂组，6 只 CP-113818 组；每组 3 只雄性，3 只雌性）的一侧大脑半球制备 8 至 15 张组织切片（10 μm）。评估皮层和海马中淀粉样斑块的数量和表面积。使用 6E10（1:5000；单克隆抗体）作为一抗，Cy3 荧光标记的羊抗小鼠 IgG 作为二抗进行 Aβ 染色。使用相同脑组织的切片进行突触素染色（1:5000；单克隆抗体）。采用光学显微镜对海马CA1区突触素免疫反应斑点进行计数。免疫组织化学反应的评估采用计算机辅助定量分析法。

[1]. The ACAT inhibitor CP-113,818 markedly reduces amyloid pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 2004 Oct 14;44(2):227-38.

我们之前的细胞实验表明，ACAT抑制剂可降低胆固醇酯的生成，从而减少Aβ的产生（Puglielli等人，2001）。在这些研究中，两种不同的ACAT抑制剂CP-113818和Dup128使胆固醇酯的生成降低了高达45%（Puglielli等人，2001）。我们目前的研究显示，小鼠脑内胆固醇酯水平的降低更为显著，这可能归因于缓释生物聚合物载体，该载体确保了抑制剂的持续释放。虽然难以预测脑内CP-113818的最终浓度，但这种ACAT抑制剂的结构（一种小分子脂肪酸类似物）以及脑内胆固醇酯相对于血清胆固醇的显著降低（分别降低了86%和29%）表明其能够穿过血脑屏障。先前一项研究报道，猴子口服化合物CP-113818后，其血液浓度波动幅度可达100倍（Marzetta等，1994）。我们自身对肝脏或脑组织中CP-113,818的定量分析均告失败，这与该抑制剂的快速周转或清除相符（Marzetta等，1994）。尽管一些研究表明血清胆固醇与脑组织Aβ水平相关，提示神经元Aβ的生成可能受血清胆固醇的影响（Puglielli等，2003），但血清胆固醇降低29%不太可能使脑组织Aβ水平降至本研究中观察到的水平。更可能的解释是，脑胆固醇酯水平下降86%表明细胞内胆固醇代谢发生改变，这导致了CP-113,818处理组动物脑内Aβ积累的减少。
在转基因小鼠中，可溶性Aβ42仅下降了34%，而“不溶性”Aβ则下降了83%–99%。这些数据可能与脑内这些肽的复杂代谢有关，可溶性Aβ的净含量不仅取决于其生成速率，还取决于其沉积、降解和清除速率（Saido，1998）。另一方面，仅Aβ生成量的减少就足以解释CP-113818对小鼠脑内“不溶性”Aβ和淀粉样斑块的显著影响。 Aβ生成或分解代谢的微小变化，例如唐氏综合征患者APP基因剂量增加50%，都可能不成比例地加速Aβ病理的进展，并导致阿尔茨海默病（AD）发病年龄提前（Saido，1998）。同样，早老素基因的家族性阿尔茨海默病（FAD）突变仅使Aβ42生成增加约1.2至3倍，却会导致疾病的早发性，且发病年龄可从30岁开始（Borchelt等，1996；Citron等，1997；Duff等，1996；Holcomb等，1998）。尽管我们倾向于将CP-113,818处理的小鼠中Aβ病理的减少归因于Aβ生成减少，但我们不能排除脑胆固醇代谢的改变除了影响APP加工外，也可能影响Aβ的聚集、分解代谢和/或清除。需要开展进一步研究来评估我们研究结果的这些方面。
由于各研究中使用的动物模型、给药方法和治疗时长存在差异，因此几乎不可能直接比较CP-113818与他汀类药物（或他汀类化合物）的疗效。Refolo等人（2001）和Petanceska等人（2002）使用了双转基因小鼠品系PSAPP，该品系小鼠在12周龄时开始出现Aβ沉积（Holcomb等人，1998）。他们分别从小鼠8周龄开始口服降胆固醇药物BM15.766（250 mg/kg/天）（Refolo等人，2001）或阿托伐他汀（30 mg/kg/天）（Petanceska等人，2002），疗程分别持续5周和8周。 BM15.766 使淀粉样蛋白负荷降低了 53%，甲酸提取的 Aβ40 降低了 58%，Aβ42 降低了 48%（Refolo 等，2001）。阿托伐他汀使淀粉样蛋白负荷降低了约 62%（2.7 倍），甲酸提取的 Aβ40 和 Aβ42 分别降低了约 60%（2.5 倍）和约 50%（2 倍）（Petanceska 等，2002）。在另一项豚鼠研究中，口服辛伐他汀（剂量约为 250 mg/kg/天）3 周后，内源性去垢剂提取的总 Aβ 降低了约 45%（Fassbender 等，2001）。有趣的是，一项研究表明，对12月龄的Tg2576小鼠（表达家族性阿尔茨海默病突变型APP）进行为期3周的洛伐他汀治疗，并未影响雄性小鼠的淀粉样蛋白负荷或脑内Aβ水平，但却加重了雌性小鼠的Aβ病理（Park等，2003）。目前尚不清楚这种截然相反的结果是由于遗传背景的差异，还是由于治疗时间较短且开始于较晚的年龄，此时已形成大量Aβ沉积。据报道，雌性Tg2576小鼠比雄性小鼠更早出现淀粉样蛋白病理，这可能是由于雌性小鼠在12月龄时脑内突触锌含量较高所致（Callahan等，2001；Lee等，2002）。尽管难以将洛伐他汀与CP-113818的疗效进行比较，但可以肯定的是，在Aβ沉积之前给予他汀类药物或他汀类药物，可以显著降低不同动物模型中的Aβ病理。可以推测，ACAT抑制剂对APP代谢的影响与总胆固醇水平变化的影响具有叠加效应。因此，理论上，他汀类药物和ACAT抑制剂联合使用可能对阿尔茨海默病患者的病理产生协同作用。
CP-113818从未进行过临床试验，而辉瑞公司生产的、经过充分研究的ACAT抑制剂CI-1011（阿伐西米贝）此前已进入血管疾病和动脉粥样硬化的III期临床试验。阿伐西米贝被认为对人体安全，且具有良好的治疗窗。我们的研究结果表明，缓释生物聚合物形式的ACAT抑制剂可作为治疗和预防阿尔茨海默病的一种潜在策略，可单独使用或与他汀类药物联合使用。[1]

C24H42N2OS3

470.7981

470.245

C, 61.23; H, 8.99; N, 5.95; O, 3.40; S, 20.43

135025-12-6

164373

White to off-white solid powder

8.8

118

1

5

17

30

439

1

CCCCCCCCC(C(=O)NC1=C(C=C(N=C1SC)C)SC)SCCCCCC

XAMYAYIMCKELIP-FQEVSTJZSA-N

InChI=1S/C24H42N2OS3/c1-6-8-10-12-13-14-16-20(30-17-15-11-9-7-2)23(27)26-22-21(28-4)18-19(3)25-24(22)29-5/h18,20H,6-17H2,1-5H3,(H,26,27)/t20-/m0/s1

(2S)-2-hexylsulfanyl-N-[6-methyl-2,4-bis(methylsulfanyl)pyridin-3-yl]decanamide

135025-12-6; cp-113818; CP 113818; N-(2,4-Bis(methylthio)-6-methylpyridin-3-yl)-2-(hexylthio)decanoic acid amide; CP 113,818; CP-113,818; Decanamide, 2-(hexylthio)-N-(6-(methyl-2,4-bis(methylthio)-3-pyridinyl)-, (S)-; (2S)-2-hexylsulfanyl-N-[6-methyl-2,4-bis(methylsulfanyl)pyridin-3-yl]decanamide;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。