DT2216

BCL-XL

DT2216 是一种 Von Hippel-Lindau (VHL) E3 连接酶靶向 BCL-XL 蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)，可指导 BCL-XL 降解。由于VHL在血小板中表达较差，DT2216对血小板的毒性明显低于ABT263，使其对多种BCL-XL依赖性白血病和癌细胞更有效。 [1]

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DT2216通过以vhl依赖的方式降解Bcl-xL，选择性杀死依赖Bcl-xL的TCL细胞系。DT2216能与ABT199联合体外协同杀伤TCL PDX细胞。[2]

作为单药或与其他化疗药物联合使用，DT2216 可有效减缓体内多种异种移植肿瘤的生长，而不会显着增加血小板减少症。 [1] DT2216是一种比ABT263更有效的抗肿瘤药物，体内血小板毒性降低[1]

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在体内，单独DT2216对小鼠MyLa TCL异种移植物非常有效，而不会引起明显的血小板减少或其他毒性。此外，在依赖Bcl-2和Bcl-xL的TCL PDX小鼠模型中，DT2216联合ABT199(一种选择性Bcl-2抑制剂)协同降低了疾病负担并提高了生存率。[2] DT2216联合其他BCL-2家族蛋白抑制剂增强抗肿瘤活性[1]
DT2216与常规化疗的协同作用[1]

AlphaScreen用于测定DT2216-BCL-XL、BCL-2和BCL-W的结合亲和力[1]
为了评估DT2216和ABT263对BCL-XL、BCL-2和BCL-W的结合亲和力，我们进行了alphasgreen竞争结合实验。实验在室温下进行，试剂在含有250 mM HEPES pH 7.5, 1 M NaCl, 1% BSA和0.05% Tween-20的缓冲液中稀释。将纯化的重组his标记的BCL-XL (0.1 nM)、BCL-2 (0.2 nM)或BCL-W (0.2 nM)与增加浓度的DT2216或ABT263和15 nM生物素标记的BAD (biotin- lwaaqrygrelrrmsdefgsfkgl n-末端)或30 nM BIM肽(Biotin-MRPEIWIAQELRRIGDEFNA n-末端)孵育至96孔PCR板中最终体积为40 μL。BAD肽用于评估化合物与BCL-XL的结合亲和力，而BIM肽用于评估BCL-2和BCL-W的结合亲和力。孵育24 h后，每孔加5 μL 6X his受体珠珠，末浓度为20 μg/mL，孵育1 h，再每孔加5 μL链霉亲和素供体珠珠，末浓度为20 μg/mL，孵育30 min，孵育结束后，将每个样品17 μL转移到384孔代板相邻孔中。在Biotek的Synergy Neo2多模式读卡器上使用Alpha程序扫描该板。通过GraphPad Prism 7软件的非线性回归、单位点、竞争结合、Fit Ki函数计算每个蛋白/肽对的抑制常数(Ki)。 [1]

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AlphaLISA法测定三元络合物形成[1]
我们使用AlphaLISA检测来监测目标蛋白、PROTAC和E3连接酶之间三元复合物的形成，如前所述44,58。为了验证BCL-XL/BCL-2、DT2216和VHL E3连接酶的形成，将固定浓度的his标记的重组蛋白(100 nM BCL-XL和10 nM BCL-2)和重组活性gst标记的VHL/Elongin B/C复合物(50 nM BCL-XL, 5 nM BCL-2)与不同浓度的测试化合物以4倍连续稀释，在96孔PCR板上培养至最终体积为40 μL。室温孵育30 min后，每孔中加入5 μL α谷胱甘肽供体微球，末浓度为20 μg/mL，孵育15 min。之后，每孔中加入5 μL 6X his受体微球，末浓度为20 μg/mL，室温孵育45 min。然后，在384孔代板的相邻孔中抽取17 μL的样品，在Biotek的Synergy Neo2多模板阅读器上使用Alpha程序对代板进行扫描。数据以平均AlphaLISA信号表示，并针对不同浓度的化合物绘制。

然后将指定浓度的 DT2216 或 ABT263 应用于 MOLT-4 细胞，在将 MOLT-4 细胞接种到 60 mm 培养皿（5 mL 完整细胞培养基/培养皿中的 2.5 × 106 个细胞）后 24 小时。冰-乙醇浴中的冻融循环或冰上孵育 30 分钟都是在 1X 细胞裂解缓冲液中裂解细胞的有效方法。

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细胞热移测定(CETSA)[1]
CETSA测定法改编自Smith等人。简单地说，用1 μM DT2216或DMSO处理2.5 × 107 MOLT-4或RS4细胞6小时，然后收获，用PBS洗涤，并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的PBS中重悬。在MOLT-4细胞中加入10 μM MG132抑制BCL-XL的降解。将重悬细胞用液氮冷冻解冻4次。每次冻融循环后，裂解液进行短暂的旋涡以确保均匀解冻。将可溶性部分从细胞碎片中分离出来，在20000 ×g下4℃离心30 min，然后在42℃至69.5℃梯度温度下加热3 min，再冷却到25℃下3 min。处理后的样品在20000 ×g下4℃离心30 min，去除变性蛋白，然后进行免疫印迹分析。

DT2216对BCL-XL降解的药效学研究[1]
按照以下方法，在雌性CB-17 SCID-beige小鼠中建立了MOLT-4异种移植瘤。当肿瘤体积约为600 mm³时，荷瘤小鼠接受单次注射载体或DT2216（15 mg/kg/腹腔注射）治疗。在图4b图例所示的每个时间点，分别从载体组和DT2216治疗组中各处死两只小鼠，并收集肿瘤组织。提取肿瘤蛋白，并通过免疫印迹分析检测BCL-XL的降解情况。按照先前的方法，将这些肿瘤的一部分用于 DT2216 分析。

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体内血小板毒性试验[1]
单次给予 DT2216 或 ABT263[1]
对 5-6 周龄的雌性 CB-17 SCID-beige 小鼠进行单次腹腔注射 DT2216（7.5、15 和 25 mpk）或单次口服 ABT263（25、50 和 100 mpk）治疗。如图 4c 图例所示，在不同时间点，通过颌下静脉丛途径从每只小鼠采集约 50 μL 血液，置于 EDTA 抗凝管中，并使用 HEMAVET 950FS 全自动血液分析仪进行血小板计数。[1]

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每日给予 ABT263 或每周一次给予 DT2216[1]
雌性 CB-17 SCID-beige 小鼠接受 ABT263（50 mpk/天/口服）或 DT2216（15 mpk/周/腹腔注射）治疗。在每次注射 ABT263 后 6 小时（0.25 天），从每只小鼠采集约 50 μL 血液；或者在每周一次注射 DT2216 后 0.25 天、1.25 天、2.25 天、3.25 天、4.25 天、5.25 天、6.25 天、7.25 天、8.25 天、9.25 天、10.25 天、11.25 天、12.25 天、17.25 天和 24.25 天，从每只小鼠采集血液。使用 HEMAVET 950FS 血小板计数。MOLT-4 T-ALL 异种移植小鼠模型[1]
为了检测 DT2216 对 MOLT-4 T-ALL 异种移植瘤生长的影响，收集 MOLT-4 T-ALL 细胞，并将其悬浮于常规 RPMI 培养基中，与 Matrigel 基质胶（1:1）混合。将悬浮于 100 μL RPMI 培养基-Matrigel 基质胶混合物中的细胞（5 × 10⁶ 个细胞）皮下注射到 CB-17 SCID 小鼠的右侧腹部。每日监测肿瘤生长情况，并每周使用游标卡尺或数字卡尺测量肿瘤大小两次。肿瘤体积采用以下公式计算：[(L × W²) × 0.5]，其中 L 为长度（毫米），W 为宽度（毫米）。当平均肿瘤体积达到 150–200 mm³ 时开始治疗。将动物随机分为若干组（n = 6–8），使各组初始平均肿瘤体积大致相等。每周称量小鼠体重两次，并根据各组小鼠在治疗开始前的平均体重进行治疗。用于腹腔注射的 DT2216 和 ABT263 配制于 50% PHOSAL 50 PG、45% MIGLYOL® 810 N 和 5% 聚山梨酯 80 中。DT2216 和 ABT263 以 15 mpk/周的剂量，通过腹腔注射给药，每次注射 100 μL 溶剂（扩展数据图 8）。用于口服的 ABT263 配制于 10% 乙醇、30% PEG 400 和 60% PHOSAL 50 PG 中（图 4）。对照组小鼠腹腔注射 100 μL 溶剂。当小鼠体内肿瘤最大体积达到机构关于啮齿动物肿瘤终点的政策所规定的“人道终点”时，对小鼠实施安乐死。此外，为避免小鼠遭受过度疼痛或痛苦，若肿瘤出现溃疡或小鼠出现任何健康问题，也对其进行安乐死。小鼠采用二氧化碳窒息法处死，随后进行颈椎脱臼，并采集包括肿瘤在内的各种组织进行进一步分析。

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H146 SCLC 异种移植模型[1]
为测试 DT2216 单独或与 ABT199 联合用药对 H146 SCLC 异种移植瘤生长的影响，将 5 × 10⁶ 个 H146 SCLC 细胞悬浮于常规 RPMI 培养基中，与 Matrigel 混合，并按照先前描述的方法皮下植入雌性 CB-17 SCID 小鼠的右侧腹部。按照上述方法监测肿瘤生长情况，测量肿瘤大小并测定肿瘤体积。如图 5c 所示，细胞植入四周后开始治疗。将动物随机分为四组：载体组、DT2216 15 mpk/周（腹腔注射）组、ABT263 15 mpk/周（腹腔注射）组、ABT199 50 mpk/天（口服）组以及 DT2216 + ABT199 联合治疗组。DT2216 和 ABT263 的制剂如上所述。ABT199 的口服制剂由 60% PHOSAL 50 PG、30% 聚乙二醇 (PEG) 400 和 10% 乙醇配制而成。所有动物均按照机构规定实施安乐死，并采集各种组织样本。称量肿瘤重量，并通过免疫印迹法检测 BCL-XL、BCL-2 和 MCL-1 的表达。

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MDA-MB-231 乳腺癌异种移植模型[1]
为了检测 DT2216 联合多西他赛对 MDA-MB-231 乳腺癌异种移植瘤生长的影响，将 5 × 10⁶ 个 MDA-MB-231 细胞悬浮于常规 RPMI 培养基中，与 Matrigel 混合，皮下植入雌性 NOD-SCID 小鼠右侧腹部。当平均肿瘤体积达到约 130 mm³ 时，将动物随机分为载体组、DT2216 组（15 mpk/q4d/ip）、多西他赛组（7.5 mpk/q14d/iv）和 DT2216 + 多西他赛组。多西他赛溶解于 5% DMSO + 30% PEG 300 + 5% Tween 80 + 60% dH2O 溶液中。该溶液经过滤除菌，得到澄清溶液，用于静脉注射。DT2216 在开始给予多西他赛前两天给药，如图 6c 所示。

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T-ALL PDX 模型[1]
为了建立 T-ALL PDX 小鼠模型，将 8 周龄 NSG 小鼠在细胞接种前 24 小时进行亚致死剂量照射（0.25 Gy）。将 PDX 细胞（1 × 10⁶）悬浮于 PBS 中，并通过尾静脉注射到小鼠体内。注射后10天，通过骨髓穿刺样本（CUL76和D115 T-ALL）或外周血（332X-Luci）中人源和鼠源抗CD45抗体的共染色来确定肿瘤植入情况。小鼠被随机分为不同组。CUL76 PDX小鼠分别接受DT2216（15 mg/kg/q4d/ip）、ABT199（100 mg/day/po）、化疗（长春新碱0.15 mg/kg + 地塞米松5 mg/kg + L-天冬酰胺酶1000 U/kg，ip，每周一次）、DT2216联合ABT199或化疗，或ABT199联合化疗治疗，如图6f所示。 D115 和 332X-Luci PDX 分别接受 DT2216、化疗或 DT2216 与化疗联合治疗，如扩展数据图 10 所示。每周通过评估外周血或骨髓穿刺液中的白血病 (hCD45+) 细胞来监测小鼠的疾病进展，并观察其生存情况。

[1]. A selective BCL-XL PROTAC degrader achieves safe and potent antitumor activity. Nat Med. 2019 Dec;25(12):1938-1947.

[2]. DT2216—a Bcl-xL-specific degrader is highly active against Bcl-xL-dependent T cell lymphomas. J Hematol Oncol. 2020; 13: 95.

Bcl-XL蛋白水解靶向嵌合体DT2216是一种抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-超大蛋白（Bcl-XL）靶向降解剂，采用蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）技术制备，具有潜在的促凋亡、免疫调节和抗肿瘤活性。DT2216由Bcl-XL配体与Von Hippel-Lindau（VHL）E3连接酶配体连接而成。DT2216给药后，其Bcl-XL结合部分特异性靶向并结合肿瘤微环境（TME）中肿瘤浸润性调节性T细胞（Tregs）以及依赖Bcl-XL生存的癌细胞（例如某些Bcl-XL依赖性T细胞恶性肿瘤）表面表达的Bcl-XL。反过来，VHL E3连接酶配体被募集到内质网（ER），Bcl-XL被泛素标记。这导致Bcl-XL泛素化和蛋白酶体介导的降解。Bcl-XL的降解抑制了其抗凋亡活性，恢复了Bcl-XL表达的Treg细胞和Bcl-XL依赖性癌细胞的凋亡过程，并导致这些细胞的耗竭。Treg细胞的减少可能激活抗肿瘤CD8+介导的免疫反应，从而抑制肿瘤生长。Bcl-XL是Bcl-2家族的成员，在凋亡的负调控中发挥重要作用。其在肿瘤中的表达与Treg细胞存活率的提高相关。Treg细胞在癌症进展和肿瘤免疫抑制中起着关键作用。与其他 Bcl-XL 抑制剂相比，DT2216 不会引起血小板毒性，因为 VHL E3 连接酶在血小板中表达不高。

C77H96CLF3N10O10S4

1542.3554

1540.58

C, 59.96; H, 6.27; Cl, 2.30; F, 3.70; N, 9.08; O, 10.37; S, 8.31

2365172-42-3

2365172-42-3;DT2216 HCl; DT2216NC; DT2216-isomer;

139331475

White to light yellow solid powder

12.8

321Ų

5

20

29

105

3130

5

CC1=C(SC=N1)C2=CC=C(C=C2)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](CN3C(=O)[C@H](C(C)(C)C)NC(=O)CCCCCC(=O)N4CCN(CC4)CC[C@H](CSC5=CC=CC=C5)NC6=C(C=C(C=C6)S(=O)(=O)NC(=O)C7=CC=C(C=C7)N8CCN(CC8)CC9=C(CCC(C9)(C)C)C1=CC=C(C=C1)Cl)S(=O)(=O)C(F)(F)F)O

PXVFFBGSTYQHRO-REQIQPEASA-N

InChI=1S/C77H96ClF3N10O10S4/c1-51(53-18-20-55(21-19-53)70-52(2)82-50-103-70)83-73(96)66-44-61(92)48-91(66)74(97)71(75(3,4)5)85-68(93)16-12-9-13-17-69(94)90-42-36-87(37-43-90)35-33-59(49-102-62-14-10-8-11-15-62)84-65-31-30-63(45-67(65)104(98,99)77(79,80)81)105(100,101)86-72(95)56-24-28-60(29-25-56)89-40-38-88(39-41-89)47-57-46-76(6,7)34-32-64(57)54-22-26-58(78)27-23-54/h8,10-11,14-15,18-31,45,50-51,59,61,66,71,84,92H,9,12-13,16-17,32-44,46-49H2,1-7H3,(H,83,96)(H,85,93)(H,86,95)/t51-,59+,61+,66-,71+/m0/s1

(2S,4R)-1-[(2S)-2-[[7-[4-[(3R)-3-[4-[[4-[4-[[2-(4-chlorophenyl)-5,5-dimethylcyclohexen-1-yl]methyl]piperazin-1-yl]benzoyl]sulfamoyl]-2-(trifluoromethylsulfonyl)anilino]-4-phenylsulfanylbutyl]piperazin-1-yl]-7-oxoheptanoyl]amino]-3,3-dimethylbutanoyl]-4-hydroxy-N-[(1S)-1-[4-(4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)phenyl]ethyl]pyrrolidine-2-carboxamide

DT2216 HCl; DT-2216; DT 2216; DT2216; 2365172-42-3; DT-2216; (2s,4r)-1-((s)-2-(7-(4-((r)-3-((4-(N-(4-(4-((4'-chloro-4,4-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-[1,1'-biphenyl]-2-yl)methyl)piperazin-1-yl)benzoyl)sulfamoyl)-2-((trifluoromethyl)sulfonyl)phenyl)amino)-4-(phenylthio)butyl)piperazin-1-yl)-7-oxoheptanamido)-3,3-dimethylbutanoyl)-4-hydroxy-N-((s)-1-(4-(4-methylthiazol-5-yl)phenyl)ethyl)pyrrolidine-2-carboxamide; Y8JQ9V7JAJ; (2S,4R)-1-[(2S)-2-[[7-[4-[(3R)-3-[4-[[4-[4-[[2-(4-chlorophenyl)-5,5-dimethylcyclohexen-1-yl]methyl]piperazin-1-yl]benzoyl]sulfamoyl]-2-(trifluoromethylsulfonyl)anilino]-4-phenylsulfanylbutyl]piperazin-1-yl]-7-oxoheptanoyl]amino]-3,3-dimethylbutanoyl]-4-hydroxy-N-[(1S)-1-[4-(4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)phenyl]ethyl]pyrrolidine-2-carboxamide; UNII-Y8JQ9V7JAJ; CHEMBL4745523; DT2216

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~100 mg/mL (~64.8 mM)
Ethanol: ~100 mg/mL (~64.8 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。