Gliotoxin   中文名称: 胶霉毒素

Secondary metabolite and mycotoxin from A. fumigatus

胶霉毒素是一种机会性真菌病原体，通过释放大量能够到达哺乳动物宿主小肺泡气道的分生孢子在环境中传播。在其他健康个体中，巨噬细胞负责快速吞噬和消除这些分生孢子，有效抑制其萌发和随后对肺组织的侵袭。然而，在某些情况下，真菌会逃避吞噬细胞介导的免疫，并在呼吸树中持续存在。在这里，我们报告A。fumigusescapes通过一种强效的免疫抑制Gliotoxin 来策略性地靶向磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸[PtdIn（3,4,5）P3]代谢，从而识别巨噬细胞。延时显微镜显示，巨噬细胞对毒素的反应停止，膜突然收缩，无法有效吞噬大靶点Gliotoxin被发现可以阻止整合素激活并干扰肌动蛋白动力学，这两者都有助于吞噬作用；在永生化吞噬细胞和初级吞噬细胞中也观察到了类似的效果。对毒性潜在分子机制的详细研究表明，吞噬作用的抑制可归因于PtdIns（3,4,5）P3的积累受损以及下游效应器（包括Rac和/或Cdc42）的相关失调。令人惊讶的是，尽管质膜PtdIns（3,4,5）P3明显缺失，但在二酰基甘油模拟物佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯的作用下，经Gliotoxin 处理的巨噬细胞重新激活β整合素，重建肌动蛋白动力学，并恢复吞噬能力。我们的发现将磷酸肌醇代谢确定为胶霉毒素的关键上游靶点，并表明二酰基甘油水平的增加可以绕过膜皱缩和吞噬过程中对PtdNs（3,4-5）P3信号传导的要求。[1]

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Gliotoxin 是一种具有大量免疫抑制作用的霉菌毒素，由烟曲霉等几种霉菌产生。在这项研究中，我们研究了其在与侵袭性曲霉病患者血液中发现的浓度相对应的浓度下对人类中性粒细胞的毒性作用。将细胞与30-100ng/ml的Gliotoxin 孵育10分钟，可以抑制酵母聚糖或血清调理酵母聚糖的吞噬作用，而不影响超氧化物的产生或特定嗜天青颗粒的分泌Gliotoxin 还诱导了肌动蛋白细胞骨架的显著重组，肌动蛋白细胞骨架在细胞核周围坍塌，导致细胞收缩和丝状伪足消失。这种由Gliotoxin 诱导的肌动蛋白表型被cAMP拮抗剂Rp-cAMP逆转，并被pCPT-cAMP模拟，这表明它可能是由于细胞内cAMP稳态失调造成的，如之前所述的Gliotoxin 诱导凋亡。相比之下，Gliotoxin 诱导的吞噬抑制作用并没有被Rp-cAMP逆转，而是被花生四烯酸逆转，花生四烯酸是受毒素影响的已知信号通路的另一个成员。这表明Gliotoxin 可以影响循环中性粒细胞，并通过抑制吞噬作用和随后杀死分生孢子来促进烟曲霉的传播。[2]

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烟曲霉能够内化到肺上皮细胞中，以逃避免疫攻击，进一步传播。我们之前报道过，烟曲霉的一种主要霉菌毒素Gliotoxin促进了这种内化；然而，其机制尚不清楚。在这里，我们报告说，Gliotoxin 能够诱导A549 II型人肺细胞中的cofilin磷酸化。cofilin磷酸化水平过高或过低都会阻断Gliotoxin 诱导的肌动蛋白细胞骨架重排和烟曲霉内化。LIM结构域激酶1（LIMK1）及其上游小GTP酶（Cdc42和RhoA，但不是Rac1）主要介导Gliotoxin 诱导的cofilin磷酸化和烟曲霉内化。同时，Gliotoxin 显著刺激cAMP的增加；然而，添加PKA拮抗剂并不能阻断Gliotoxin 诱导的烟曲霉内化。在体内，外源性Gliotoxin 帮助Gliotoxin 合成缺陷菌株gliPΔ侵入肺组织，免疫抑制小鼠的肺真菌负荷显著增加。总之，这些数据揭示了Gliotoxin 在诱导cofilin磷酸化中的新作用，主要是通过Cdc42/RhoA-LIMK1信号通路促进肌动蛋白细胞骨架重排和烟曲霉内化为II型人肺细胞。[3]

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慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞以蛋白激酶C（PKC）依赖的方式表达组成型激活的NOTCH2。NOTCH2的转录活性不仅与其靶基因FCER2（CD23）的表达相关，而且在功能上与CLL细胞活力有关。在大多数CLL病例中，DNA结合的NOTCH2复合物对γ-分泌酶抑制剂（GSI）DAPT不太敏感。因此，我们寻找在转录因子水平干扰NOTCH2信号传导的化合物。使用电泳迁移率变化分析（EMSA），我们鉴定出曲霉病衍生的次生代谢产物Gliotoxin 是一种强效的NOTCH2转录激活抑制剂。Gliotoxin 完全阻断了CLL细胞中与DNA结合的NOTCH2复合物的形成，与它们对DAPT的敏感性无关。Gliotoxin 对NOTCH2信号传导的抑制与CD23（FCER）表达的下调和凋亡的诱导有关。CLL细胞的短时间暴露表明，Gliotoxin 的早期凋亡作用与蛋白酶体调节的核因子κB活性无关，并与NOTCH3和NR4A1表达的上调有关。在离体CLL微环境模型中，Gliotoxin 可以克服原代骨髓基质细胞的支持作用。总之，我们确定Gliotoxin 是一种强效的NOTCH2抑制剂，在CLL中具有很好的治疗潜力[4]。

外源性Gliotoxin 促进烟曲霉对醋酸氢化可的松免疫抑制的小鼠肺组织的侵袭[3]
在我们之前的研究中，Gliotoxin 能够在体外以50 ng/ml的低浓度促进烟曲霉内化到肺上皮细胞中（Jia等人，2014），这远低于之前研究中使用的200 ng/ml（Stanzani等人，2005；Kupfahl等人，2006a，2006b），测试Gliotoxin 是否在体内促进烟曲霉入侵肺上皮是很有趣的。用醋酸氢化可的松免疫抑制的10至12只小鼠感染了每种烟曲霉菌株（野生型B5233，肽合成酶gliP型gliPΔ缺失，或gliPΔ加外源性50 ng/mlGliotoxin ）。gliPΔ突变体感染小鼠的存活率明显高于野生型B5233感染小鼠，外源性Gliotoxin 可降低感染gliPΔ突变小鼠的存活，具有统计学意义（图6A）。感染野生型B5233或glipΔ突变株加外源性Gliotoxin 的小鼠，但未感染glipΔ突变株的小鼠，在感染后3天体重显著下降（图6B）。此外，外源性添加Gliotoxin 显著增加了小鼠的肺部真菌负担（图6C，D）。病理染色显示，感染野生型B5233的小鼠比其他两组小鼠有更强的炎症反应和更严重的肺组织菌丝侵袭（黑色箭头），导致组织坏死。在单独感染gliPΔ的小鼠肺组织中，真菌主要位于支气管，并伴有外周肺组织的炎症反应。相比之下，感染gliPΔ加外源性Gliotoxin 会引起更强的炎症和大量支气管上皮脱落，在某些情况下甚至会侵入肺组织（图6E）。这些结果表明，在感染初期用醋酸氢化可的松免疫抑制的侵袭性曲霉病小鼠模型中，外源性Gliotoxin 促进了烟曲霉对肺组织的侵袭。

Gliotoxin 和其他药物治疗。[1]
Gliotoxin 在DMSO中稀释，在所有情况下均以500 ng/ml（1.53µM）的终浓度使用，但毒素连续稀释的实验除外。在细胞处于无血清培养基中时加入Gliotoxin ，并使其作用30分钟，然后进行进一步的实验操作。在Gliotoxin 攻击后加入第二种化合物（如肉豆蔻酸佛波醇酯[PMA]）的情况下，Gliotoxin 没有从培养基中去除。在指定的时间段内，PMA和渥曼青霉素均以100nM的浓度使用。腺苷酸环化酶激活剂福司克林和cAMP信号传导竞争抑制剂（R）-腺苷，环3'，5'-（硫代磷酸氢盐）三甲基铵（cAMPS-Rp）的最终浓度分别为100和200µM。在有指示的情况下，细胞在暴露于Gliotoxin 或毛喉素之前用cAMPS-Rp预处理。

小鼠分别感染单独的烟曲霉（A. fumigatus）或烟曲霉与外源性50 ng/ml的胶质毒素（Gliotoxin）的混合物。为进行生存分析，感染后每日称量小鼠体重。大多数情况下，生存实验的终点为死亡。在感染后的特定时间点，处死小鼠，称量肺组织，匀浆，然后进行系列稀释，接种于沙氏琼脂平板上，于37℃培养。20小时后，计数并计算肺组织中的菌落数（CFU/g）。为进行组织病理学检查，解剖各组小鼠感染后72小时的肺组织切片，用10%（体积比）甲醛固定，并进行苏木精-伊红（HE）染色和过碘酸-雪夫（PAS）染色。使用配备 Olympus DP71 相机的 BX51 显微镜，在 200 倍或 400 倍放大倍率下，采用明场照明拍摄图像。

[1]. Gliotoxin Suppresses Macrophage Immune Function by Subverting Phosphatidylinositol 3,4,5-Trisphosphate Homeostasis. MBio. 2016 Apr 5;7(2):e02242.

[2]. Gliotoxin from Aspergillus fumigatus affects phagocytosis and the organization of the actin cytoskeleton by distinct signalling pathways in human neutrophils. Microbes Infect. 2007 Jan;9(1):47-54. Epub 2006 Dec 12.

[3]. Gliotoxin Induces Cofilin Phosphorylation to Promote Actin Cytoskeleton Dynamics and Internalization of Aspergillus fumigatus Into Type II Human Pneumocyte Cells. Front Microbiol. 2019 Jun 18;10:1345.

[4]. Gliotoxin is a potent NOTCH2 transactivation inhibitor and efficiently induces apoptosis in chronic lymphocytic leukaemia (CLL) cells. Br J Haematol. 2013 Mar;160(5):618-29.

胶霉毒素是一种吡嗪并吲哚类化合物，其二硫键连接着一个二氧取代的吡嗪环；它是由多种真菌产生的真菌毒素。胶霉毒素具有多种功能，包括作为真菌毒素、免疫抑制剂、EC 2.5.1.58（蛋白质法尼基转移酶）抑制剂、蛋白酶体抑制剂和抗真菌剂。它是一种有机二硫化物、吡嗪并吲哚类化合物、有机杂四环化合物和二肽。
据报道，胶霉毒素存在于绿色木霉（Trichoderma virens）、液化木霉（Trichoderma deliquescens）以及其他一些有相关数据的生物体中。
胶霉毒素是一种含硫抗生素，由多种真菌产生，其中一些真菌是人类病原体，例如曲霉属（Aspergillus），此外，木霉属（Trichoderma）和青霉属（Penicillium）的真菌也能产生胶霉毒素。胶质毒素具有免疫抑制特性，因为它能抑制并诱导某些免疫系统细胞（包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、巨噬细胞和胸腺细胞）的凋亡。(L1941)
胶质毒素是一种真菌毒素，由多种木霉属、纤毛唐菖蒲属、烟曲霉属和青霉属真菌产生。它被用作免疫抑制剂。

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巨噬细胞和中性粒细胞似乎在曲霉病的病理过程中发挥着独立但互补的作用：前者负责快速有效地吞噬吸入的分生孢子，而后者可能在对抗复杂而广泛的菌丝网络方面发挥更积极的作用，这些菌丝网络对于巨噬细胞来说实在太大，无法被吞噬。通过抑制磷脂酰肌醇信号传导，进而干扰肌动蛋白细胞骨架动力学和整合素功能，胶质毒素可能损害两种专业吞噬细胞的功能，从而确保其子代的存活，同时保持菌丝网络免受中性粒细胞的攻击。[1] 总之，本研究首次阐明了烟曲霉的重要毒素胶质毒素通过 Cdc42/RhoA-LIMK1 和 cAMP/PKA-LIMK1 信号通路刺激 cofilin 磷酸化，进而调节肌动蛋白细胞骨架重排，促进烟曲霉内化进入肺上皮细胞（图 7）。[3]

C13H14N2O4S2

326.38

326.039

C, 47.84; H, 4.32; N, 8.58; O, 19.61; S, 19.65

67-99-2

6223

White to off-white solid powder

1.8±0.1 g/cm3

699.7±55.0 °C at 760 mmHg

153.5ºC

377.0±31.5 °C

0.0±5.0 mmHg at 25°C

1.814

0.52

131.68

2

6

1

21

621

4

CN1C(=O)[C@]23CC4=CC=C[C@@H]([C@H]4N2C(=O)[C@]1(SS3)CO)O

FIVPIPIDMRVLAY-RBJBARPLSA-N

InChI=1S/C13H14N2O4S2/c1-14-10(18)12-5-7-3-2-4-8(17)9(7)15(12)11(19)13(14,6-16)21-20-12/h2-4,8-9,16-17H,5-6H2,1H3/t8-,9-,12+,13+/m0/s1

(3R,5aS,6S,10aR)-6-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-methyl-2,3,5a,6-tetrahydro-10H-3,10a-epidithiopyrazino[1,2-a]indole-1,4-dione

Gliotoxin; gliotoxin; 67-99-2; Aspergillin; CCRIS 4025; Gliotoxin from Gliocladium fimbriatum; NSC 102866; UNII-5L648PH06K; BRN 0050675; Aspergillin

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMF : 5 mg/mL (~15.32 mM)
DMSO : ~5 mg/mL (~15.32 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。