RdRp (RNA-dependent RNA-polymerases)

与 1 µM 瑞德西韦 (GS-5734) 连续孵育 72 小时后，在 2、24、48 和 72 小时测定 GS-443902（GS-441524 三磷酸盐；瑞德西韦代谢物；化合物 4tp）的水平。 ，并且在巨噬细胞、HMVEC 和 HeLa 细胞系中分别获得 300、110 和 90 pmol/百万细胞的 Cmax 值 [1]。化合物 8a，GS-443902，是三磷酸 (TP) 的衍生物 [2]。 GS-443902（NTP；0.01、0.1、1、10、100 μM）整合到未成熟的病毒 RNA 转录本中并导致其过早终止，从而抑制 RSV RdRp 催化的 RNA 产生。在细胞中有效转化为 GS-443902 后，GS-5734 通过靶向其 RdRp 并抑制病毒 RNA 合成，特异性抑制 EBOV 复制 [3]。

Remdesivir（GS-5734；10 mg·kg；静脉注射）快速进入外周血单核细胞（PBMC），给药两小时后，显着高效转化为GS-443902（GS-441524 III）。国家时间规划；磷酸盐；瑞德西韦的代谢物。恒河猴。 GS-443902 的 t1/2 长度为 14 小时，且水平为 24 小时抑制 > 50% 病毒所需的水平，是 PBMC 中的主要代谢产物 [3]。

转录反应在30µL反应缓冲液（50 mM TRIS醋酸盐[pH 8.0]、120 mM乙酸钾、5%甘油、4.5 mM MgCl2、3 mM DTT、2 mM EGTA、50µg/mL BSA、2.5 U RNasin、20µM ATP、100µM GTP、100µM UTP、100µM-CTP和1.5µCi[α-32P]ATP[3000 Ci/mmol]）中含有25µg粗制RSV-RNP复合物。选择转录测定中使用的放射性标记的核苷酸，以匹配正在评估的RSV RNP转录抑制的核苷酸类似物。为了确定核苷酸类似物是否抑制RSV RNP转录，使用6步连续稀释以5倍的增量添加化合物。在30°C下孵育90分钟后，用350µL Qiagen RLT裂解缓冲液停止RNP反应，并使用Qiagen RNeasy 96试剂盒纯化RNA。纯化的RNA在65°C的RNA样品加载缓冲液中变性10分钟，并在含有2M甲醛的1.2%琼脂糖/MOPS凝胶上运行。将琼脂糖凝胶干燥，暴露于Storm磷光屏，并使用Storm磷光仪显影[1]。

EBOV HMVEC抗病毒检测[1]
抗病毒检测在美国疾病控制与预防中心的生物安全4级安全壳（BSL-4）中进行。HMVEC-TERT细胞接种在96孔板中。在培养基中以3倍的连续稀释增量稀释8至10个浓度的化合物，并将每种稀释液的100uL/孔一式三份转移到含有预接种HMVEC-TERT单层的96孔板上。将平板转移到BSL-4容器中，将之前通过滴定测定并在细胞培养基中制备的EBOV-GFP病毒原液的适当稀释液加入到含有细胞和连续稀释化合物的测试平板中。每个板包括三个感染的未经处理的细胞孔和三个未感染的细胞孔，分别作为0%和100%的病毒抑制对照。感染后，将测试板在组织培养箱中孵育3至4天。孵育后，在Envision平板阅读器中通过直接荧光测量病毒复制，以测量报告病毒的GFP表达。计算相对于0%和100%抑制对照的每种测试浓度的抑制百分比，并通过非线性回归确定每种化合物的EC50值，作为抑制病毒复制50%的化合物的有效浓度。

In vivo efficacy[3]
Rhesus monkeys (Macaca mulatta) were challenged on day 0 by intramuscular injection with a target dose of 1,000 PFU of EBOV Kikwit (Ebola virus H. sapiens-tc/COD/1995/Kikwit), which was derived from a clinical specimen obtained during an outbreak occurring in the Democratic Republic of the Congo (formerly Zaire) in 1995. Challenge virus was propagated from the clinical specimen using cultured cells (Vero or Vero E6) for a total of four passages. Animals (3–6 years old) were randomly assigned to experimental treatment groups, stratified by sex (with equal number of males and females per group) and balanced by body weight, using SAS statistical software. Study personnel responsible for assessing animal health (including euthanasia assessment) and administering treatments were experimentally blinded to group assignment of animals. The primary endpoint for efficacy studies was survival to day 28 following virus challenge. GS-5734 was formulated at Gilead Sciences in water with 12% sulfobutylether-β-cyclodextrin (SBE- β-CD), pH adjusted to 3.0 using HCl. Formulations were administered to anaesthetized animals by bolus intravenous injection at a rate of approximately 1 min per dose in the right or left saphenous vein. The volume of all vehicle or GS-5734 injections was 2.0 ml kg−1 body weight. Animals were anaesthetized using intramuscular injection of a solution containing ketamine (100 mg ml−1) and acepromazine (10 mg ml−1) at 0.1 ml kg−1 body weight.[3]

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Animals were observed at least twice daily to monitor for disease signs, and animals that survived to day 28 were deemed to be protected. Study personnel alleviated unnecessary suffering of infected animals by euthanizing clinically moribund animals. The criteria used as the basis for euthanasia of moribund animals were defined before study initiation and included magnitude of responsiveness, reduced body temperature, and/or specified alterations to serum chemistry parameters35. Serum chemistry was analysed using a Vitros 350 Chemistry System, and coagulation parameters were evaluated using a Sysmex CA-1500 coagulation analyser. Haematology analysis was conducted using a Siemens Advia 120 Hematology System with multispecies software. On days in which GS-5734 or vehicle dosing were scheduled with blood sample collection for clinical pathology or viraemia analysis, blood samples were collected immediately before dose administration.[3]

[1]. Discovery and Synthesis of a Phosphoramidate Prodrug of a Pyrrolo[2,1-f][triazin-4-amino] Adenine C-Nucleoside (GS-5734) for the Treatment of Ebola and Emerging Viruses. Med Chem. 2017 Mar 9;60(5):1648-1661.

[2]. Synthesis and antiviral activity of a series of 1'-substituted 4-aza-7,9-dideazaadenosine C-nucleosides. Bioorg Med Chem Lett. 2012 Apr 15;22(8):2705-7.

[3]. Therapeutic efficacy of the small molecule GS-5734 against Ebola virus in rhesus monkeys. Nature. 2016 Mar 17;531(7594):381-5.

GS-443902 is an organic triphosphate that is GS-441524 in which the 5'-hydroxy group has been replaced by a triphosphate group. It is the active metabolite of remdesivir. It has a role as a drug metabolite, an antiviral drug and an anticoronaviral agent. It is a C-nucleoside, an aromatic amine, a nitrile, a pyrrolotriazine and an organic triphosphate. It is functionally related to a GS-441524.

531.202425003052

530.995

1355149-45-9

GS-441524;1191237-69-0;Remdesivir;1809249-37-3;GS-443902 trisodium;1355050-21-3

56832906

Typically exists as White to light yellow solids at room temperature

2.4±0.1 g/cm3

1.841

-5.92

290

7

17

8

33

941

4

P(=O)(O)(OP(=O)(O)OP(=O)(O)O)OC[C@@H]1[C@H]([C@H]([C@](C#N)(C2=CC=C3C(N)=NC=NN23)O1)O)O

DFVPCNAMNAPBCX-LTGWCKQJSA-N

InChI=1S/C12H16N5O13P3/c13-4-12(8-2-1-6-11(14)15-5-16-17(6)8)10(19)9(18)7(28-12)3-27-32(23,24)30-33(25,26)29-31(20,21)22/h1-2,5,7,9-10,18-19H,3H2,(H,23,24)(H,25,26)(H2,14,15,16)(H2,20,21,22)/t7-,9-,10-,12+/m1/s1

((2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-yl)-5-cyano-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrogen triphosphate

Remdesivir triphosphate metabolite; GS-441524 triphosphate; GS 441524 triphosphate; GS441524 triphosphate; GS443902; GS-443902; GS-441524 Triphosphate; RDV-TP; AEL0YED4SU; UNII-AEL0YED4SU; [[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-aminopyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-yl)-5-cyano-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate; GS443902

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。  (2). 该产品在溶液状态不稳定，请现配现用。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~100 mg/mL (~188.25 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。