| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 1mg |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 50mg |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| 500mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
ALK5
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| 体外研究 (In Vitro) |
GW-6604 (0-10 μM) 通过抑制 TGF-β PAI-1 睡眠和 HepG2 细胞中的睡眠来有效阻断 Smad 休克反应，IC50 为 500 nM [1]。
在用TGF-β反应性野生型PAI-1启动子驱动萤光素酶报告基因稳定转染的HepG2细胞中，GW6604（见图1中的结构）在亚摩尔浓度下抑制TGF-β诱导的PAI-1转录和分泌（IC50=500nm；图2a）。GW6604与TGF-β超家族的两个成员激活素和BMP的选择性是通过激活素-和BMP特异性细胞报告分析来解决的。GW6604与激活素相比显示出五倍的选择性（IC50为2.5μm），并且不抑制BMP信号传导（IC20>10μm）（图2a）[1]。 TGF-β信号传导导致Smad蛋白移位到细胞核并转录TGF-β反应基因。TGF-β反应基因启动子区的Smad结合序列对于TGF-β/Smad诱导的转录至关重要（Dennler等人，1998；Shi和Massague，2003）。使用转染有人工报告基因的HepG2细胞，该报告基因包含来自PAI-1启动子的Smad3/Smad4结合位点的九个相邻拷贝，我们发现GW6604抑制TGF-β诱导的反应，其效力与野生型PAI-1启动因子上测量的效力相当，表明GW6604有效地阻断了Smad依赖性反应（图2b）。为了进一步研究GW6604抑制TGF-β信号传导的机制，使用纯化的重组激酶结构域进行了ALK5自磷酸化测定。如图2c所示，GW6604以140 nm的IC50抑制ALK5活性，其效力与ALK5结合试验中测量的效力相当（IC50=107 nm（表1）。使用包括P38MAPK、VEGFR2、P56lck、ITK、Src和TGF-βII型受体在内的一组其他激酶测试GW6604对ALK5与其他激酶的选择性；GW6604在浓度高达10μm时对这些激酶没有显著活性（表1）。[1] |
| 体内研究 (In Vivo) |
在 SD 临时 DMN 模型中，GW-6604（口服，25-80 mg/kg，每天两次，3 周）可将转录表达降低 80%，并过度表达转录因子 COL IA1。增强阴茎基底，成功减少肝纤维化，并维持正常肝脏重量[1]。
GW6604可促进TGF-β1过表达小鼠的肝脏再生[1] 为了评估GW6604是否在体内生理环境中有效阻断TGF-β的作用，在肝特异性白蛋白启动子的控制下过表达TGF-β1的小鼠（Sanderson等人，1995）在部分肝切除术前后用GW6604治疗，并在肝切除术后40小时杀死动物。通过在每只动物的五个代表性显微镜视野上进行BrdU标记来量化肝脏再生。在部分肝切除的TGF-β转基因动物中，GW6604治疗诱导肝细胞增殖增加了4.7倍（在用载体和GW6604处理的动物中，每个视野分别有1.8±0.4和8.5±2.2个染色核，P=0.02（t检验））（图3）。在肝切除的非转基因动物和用GW6604治疗的非肝切除动物中，BrdU染色没有增加（数据未显示）。这些结果表明，GW6604在体外HepG2细胞中观察到的抗TGF-β活性转化为对体内小鼠肝细胞的影响。[1] GW6604在急性DMN模型中的作用[1] 在纤维化过程中，COL IA1合成的增加主要是由TGF-β作用于肝星状细胞引发的。在连续3天给予DMN的大鼠中，通过定量RT-PCR测量的肝脏COL IA1 mRNA表达在第8天增加了约10倍。在第6、7和8天给DMN预处理的大鼠服用GW6604（25-80mg kg−1 p.o.，b.i.d.），剂量依赖性地抑制了COL IA1的过表达（图4）。[1] GW6604对慢性DMN肝纤维化模型的治疗作用[1] 为了证明GW6604治疗对基质沉积和肝功能的潜在治疗益处，大鼠连续6周服用DMN，最后3周服用GW6604（80mg kg−1 p.o.，b.i.d.）。在DMN给药的前3周，肝脏疾病如所述发展（Wu和Norton，1996；George等人，2001）；DMN仅略微降低了体重进展。DMN组（DMN-GW6604）中所有用GW6604治疗的大鼠都存活了6周，而DMN载体治疗组（DMN载体）的死亡率接近50%（表2）。与生理盐水载体组相比，DMN载体组的肝脏重量显著降低。GW6604阻止了这种下降，并保持了正常的肝脏重量（DMN载体为9±1.4 g，而DMN-GW6604治疗的动物为17.3±0.5 g）（表2）。然而，DMN-GW6604和DMN赋形剂治疗组的体重增加都受到了完全抑制（图5）。用PCNA抗体对肝脏切片进行免疫染色显示，DMN载体处理的大鼠再生肝细胞很少，而DMN-GW6604组的增殖肝细胞增加了10倍（图6）。已知长期服用DMN会导致慢性肝病，其特征是广泛的纤维化导致肝硬化（Wu&Norton，1996；George等人，2001）。肝脏基因表达分析表明，DMN治疗大大增加了编码基质成分（COL IA1、COL IA2和COL III）以及TIMP-1的mRNA，而不会干扰用作参考基因的18S。在DMN-GW6604治疗的动物中，与DMN载体组相比，编码TGF-β1、胶原蛋白和TIMP-1的mRNA的过表达减少了50-75%，表明纤维化过程减少，基质降解增加（表2）。 |
| 酶活实验 |
荧光偏振激酶结合试验[1]
在纯化的重组GST-ALK5（残基198-503）上测试化合物与ALK5的结合。用不同浓度的测试化合物置换罗丹明绿荧光标记的ATP竞争抑制剂（如专利申请WO02/24682000所述）来计算结合pIC50。将GST-ALK5加入到含有62.5mm Hepes（pH 7.5）、1mm DTT、12.5mm MgCl2、1.25mm CHAPS（所有试剂均购自XXX）和1nm罗丹明绿标记配体的缓冲液中，使得基于酶的活性位点滴定，最终ALK5浓度为10nm。将40μl酶/配体试剂加入到含有1μl不同浓度测试化合物的384孔分析板中。在分别具有485、530和505nm激发、发射和二向色滤光片的LJL-Acquest荧光阅读器上立即读取这些板。每个孔的荧光偏振由Acquist计算，然后导入曲线拟合软件以构建浓度-响应曲线。使用相同的测定条件来测量GW6604与其他激酶的结合。[1] Alk5自磷酸化试验[1] ALK5的激酶结构域（Franzen等人，1993）（氨基酸162-503）通过PCR克隆，并在杆状病毒/Sf9细胞系统中表达。该蛋白在C末端标记6-His，并使用Ni2+柱通过亲和层析纯化。由此获得的材料用于评估测试化合物抑制ALK5自磷酸化的能力。[1] 在50μl Tris缓冲液（Tris 50 mm，pH 7.4；氯化钠100毫米；氯化镁5mm；氯化锰5mm；DTT 10 mm）与不同浓度的化合物（试验中0.1%二甲亚砜（DMSO）的最终浓度）在37°C下预孵育10分钟。通过加入3μm ATP（0.5μCi-gama-33P-ATP）引发反应。在37°C下放置15分钟后，通过加入SDS-PAGE样品缓冲液（50 mm Tris-HCl（pH 6.9）、2.5%甘油、1%SDS、5%β-巯基乙醇）停止磷酸化。样品在95°C下煮沸5分钟，并在12%SDS-PAGE上运行。将干燥的凝胶暴露在荧光屏上过夜。使用Storm成像系统定量ALK5自磷酸化。[1] |
| 细胞实验 |
ALK5抑制剂抗TGF-β活性的细胞测定[1]
在HepG2细胞（ATCC）的转录测定中测试化合物活性。用包含驱动萤光素酶（萤火虫）报告基因的人PAI-1启动子（-806至+72区）的报告构建体或含有先前描述的Smad结合位点的九个相邻拷贝的构建体稳定转染细胞（Dennler等人，1998）。通过有限稀释法和所选克隆的克隆扩增获得稳定转染的细胞系。与对照组相比，含有人PAI-1启动子（-806至+72）的细胞系对TGF-β刺激的反应是萤光素酶活性增加10至20倍，而含有9个相邻Smad结合位点的细胞系对于TGF-β刺激反应强烈，在添加TGF-β后萤光素酶活性增加了500倍以上。 为了测试化合物的抗TGF-β活性，将细胞接种在96孔微孔板中，在200μl含血清的培养基中，每孔浓度为35000个细胞。然后将微孔板置于37°C、5%CO2气氛的细胞培养箱中24小时。然后将细胞在无血清的BME培养基中培养，在加入重组TGF-β1（1 ng ml-1）前30分钟，以10 nm至10μm的浓度（DMSO的终浓度为1%）加入GW6604。孵育过夜后，用PBS洗涤细胞，加入10μl被动裂解缓冲液（Promega，Carbonières，France）裂解细胞。相对于对照组，萤光素酶活性的抑制被用作化合物活性的衡量标准。构建浓度-反应曲线，从中以图形方式确定IC50值。 |
| 动物实验 |
急性DMN模型[1]
在仔细研究DMN诱导的纤维化发展后，建立了急性DMN模型。其目的是尽早检测与纤维化相关的基因变化，并最终在短时间内测试化合物的体内活性。[1] 体重200-225克的雄性Sprague-Dawley大鼠连续3天（第1-3天）接受腹腔注射12.5 mg kg−1 DMN或生理盐水。随后，动物在第6、7和8天每天两次口服GW6604或其溶剂（20% HCl 1 n、80%羟丙基甲基纤维素(0.5%)、Tween 80(5%)，pH值调节至4），剂量为4 ml kg⁻¹。在第8天，即第五次给药GW6604或溶剂2小时后，通过吸入CO₂处死动物。收集肝脏组织，通过RT-PCR定量胶原蛋白IA1 (COL IA1) mRNA。结果以DMN诱导的COL IA1增加的抑制百分比表示，并与对照组进行比较。COL IA1 mRNA的定量以核糖体18S rRNA为内参。每组使用 4 至 6 只大鼠。[1] 慢性 DMN 模型[1] 体重 200–225 g 的雄性 Sprague–Dawley 大鼠，每周连续 3 天，腹腔注射 10 mg kg−1 的 DMN 或生理盐水，持续 6 周。DMN 给药 3 周后，开始给予 GW6604（80 mg kg−1，口服，每日两次）或其溶剂（4 ml kg−1）治疗，持续 3 周。在 3 周的治疗期间，继续给予 DMN。6 周结束后，用 CO2 吸入法处死动物。采集血液样本，用于实验室分析 ALAT、ASAT、总胆红素、碱性磷酸酶和透明质酸。收集肝脏组织，用于RT-PCR定量分析编码COL IA1、胶原蛋白IA2（COL IA2）、胶原蛋白III α1链（COL III）、TIMP-1和TGF-β1的基因，并进行组织学评估。肝脏mRNA水平相对于18S rRNA的变化以与生理盐水对照组相比的倍数变化表示。在6周治疗期结束时报告死亡率。所有动物均存活至DMN治疗的最初3周。 |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
总之，尽管肝纤维化是一种多因素疾病，但TGF-β似乎发挥着重要作用，新型ALK5抑制剂GW6604的研究结果也证实了这一点。GW6604在体外抑制TGF-β信号通路，并在体内阻断TGF-β的作用，这体现在其能够促进肝损伤或部分肝切除术后肝细胞的增殖，以及降低急性和慢性肝纤维化模型中基质基因的表达。在DMN诱导的慢性肝纤维化模型中，GW6604是一种有效的治疗手段，因为它降低了死亡率并减轻了纤维化，从而改善了肝功能。这些数据表明，通过抑制ALK5来阻断TGF-β的作用是治疗慢性肝病的一种有前景的方法。[1]
|
| 分子式 |
C19H14N4
|
|---|---|
| 分子量 |
298.34126
|
| 精确质量 |
298.121
|
| 元素分析 |
C, 76.49; H, 4.73; N, 18.78
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| CAS号 |
452342-37-9
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| PubChem CID |
9861063
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| 外观&性状 |
Off-white to light yellow solid powder
|
| 密度 |
1.2±0.1 g/cm3
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| 沸点 |
505.2±50.0 °C at 760 mmHg
|
| 闪点 |
272.5±16.5 °C
|
| 蒸汽压 |
0.0±1.2 mmHg at 25°C
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| 折射率 |
1.650
|
| LogP |
3.18
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| tPSA |
54.46
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| 氢键供体(HBD)数目 |
1
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
3
|
| 可旋转键数目(RBC) |
3
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| 重原子数目 |
23
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| 分子复杂度/Complexity |
368
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
|
| InChi Key |
BDCBRQYHYNUWAM-UHFFFAOYSA-N
|
| InChi Code |
InChI=1S/C19H14N4/c1-2-6-14(7-3-1)18-12-15(9-11-21-18)16-13-22-23-19(16)17-8-4-5-10-20-17/h1-13H,(H,22,23)
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| 化学名 |
2-phenyl-4-(5-pyridin-2-yl-1H-pyrazol-4-yl)pyridine
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| 别名 |
GW 6604; GW-6604; 2-Phenyl-4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridine; 2-phenyl-4-(3-pyridin-2-yl-1H-pyrazol-4-yl)pyridine; CHEMBL205736; 273G6SN31H; Pyridine, 2-phenyl-4-(3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl)-; GW6604
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month 注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。 |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : ~100 mg/mL (~335.19 mM)
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 3.3519 mL | 16.7594 mL | 33.5188 mL | |
| 5 mM | 0.6704 mL | 3.3519 mL | 6.7038 mL | |
| 10 mM | 0.3352 mL | 1.6759 mL | 3.3519 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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