| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 1mg |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 50mg |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| 500mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
ALK5
ALK5 (activin receptor-like kinase 5, also known as TGF-β receptor type I). |
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| 体外研究 (In Vitro) |
GW-6604 (0-10 μM) 能有效抑制 HepG2 细胞中 TGF-β PAI-1 的表达和睡眠，从而阻断 Smad 休克反应，其 IC50 值为 500 nM [1]。
在稳定转染了 TGF-β 反应性野生型 PAI-1 启动子驱动的荧光素酶报告基因的 HepG2 细胞中，GW6604（结构见图 1）在亚微摩尔浓度下即可抑制 TGF-β 诱导的 PAI-1 转录和分泌（IC50=500 nM；图 2a）。我们使用激活素和 BMP 特异性细胞报告基因检测方法，研究了 GW6604 对激活素和 BMP（TGF-β 超家族的两个成员）的选择性。 GW6604 对激活素的选择性是其五倍（IC50 为 2.5 μM），且不抑制 BMP 信号通路（IC20 > 10 μM）（图 2a）[1]。 TGF-β 信号转导导致 Smad 蛋白易位至细胞核，并启动 TGF-β 反应基因的转录。TGF-β 反应基因启动子区域的 Smad 结合序列对于 TGF-β/Smad 诱导的转录至关重要（Dennler 等，1998；Shi 和 Massague，2003）。我们利用转染了包含九个相邻的源自 PAI-1 启动子的 Smad3/Smad4 结合位点的人工报告基因的 HepG2 细胞，结果表明 GW6604 对 TGF-β 诱导的反应具有抑制效力，其效力与在野生型 PAI-1 启动子上测得的效力相当，提示 GW6604 能有效阻断 Smad 依赖性反应（图 2b）。为了进一步研究 GW6604 抑制 TGF-β 信号通路的机制，我们使用纯化的重组激酶结构域进行了 ALK5 自磷酸化实验。如图 2c 所示，GW6604 抑制 ALK5 活性的 IC50 值为 140 nM，其效力与 ALK5 结合试验中测得的效力相当（IC50=107 nM（表 1））。我们使用一系列其他激酶（包括 P38MAPK、VEGFR2、P56lck、ITK、Src 和 TGF-β II 型受体）测试了 GW6604 对 ALK5 相对于其他激酶的选择性；在浓度高达 10 μM 时，GW6604 对这些激酶均未表现出显著活性（表 1）[1]。 GW6604 抑制 ALK5 自磷酸化的 IC50 值为 140 nM。它以 500 nM 的 IC50 值（0-10 µM 范围）阻断 HepG2 细胞中 TGF-β 诱导的 PAI-1 表达。GW6604 高效抑制Smad信号通路反应。这些数据表明，ALK5抑制作用强效，并且在TGF-β反应细胞中具有细胞活性。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
在SD的DMN临时模型中，GW-6604（口服，25-80 mg/kg，每日两次，持续3周）可降低转录表达80%，并过表达转录因子COL IA1，增强阴茎基底部，成功减少肝纤维化，并维持正常的肝脏重量[1]。
GW6604可促进TGF-β1过表达小鼠的肝脏再生[1] 为了评估GW6604是否在体内生理条件下有效阻断TGF-β的作用，我们对在肝脏特异性白蛋白启动子控制下过表达TGF-β1的小鼠（Sanderson等，1995）进行了GW6604治疗，分别在部分肝切除术前后进行，并在肝切除术后40小时处死动物。通过对每只动物的五个代表性显微镜视野进行BrdU标记来量化肝脏再生情况。在部分肝切除的TGF-β转基因动物中，GW6604治疗使肝细胞增殖增加了4.7倍（载体组和GW6604组每个视野的染色细胞核数分别为1.8±0.4和8.5±2.2，P=0.02（t检验））（图3）。在肝切除的非转基因动物和未进行肝切除的动物中，GW6604治疗并未增加BrdU染色（数据未显示）。这些结果表明，在体外HepG2细胞中观察到的GW6604的抗TGF-β活性可转化为体内对小鼠肝细胞的影响。[1] GW6604在急性DMN模型中的作用[1] 在纤维化过程中，COL IA1合成的增加主要由TGF-β作用于肝星状细胞触发。连续3天给予DMN的大鼠，在第8天通过定量RT-PCR检测发现肝脏COL IA1 mRNA表达量增加了约10倍。在第6、7和8天给予DMN预处理的大鼠GW6604（25-80 mg kg−1，每日两次，口服），可剂量依赖性地抑制COL IA1的过表达（图4）。[1] GW6604在慢性DMN肝纤维化模型中的治疗作用[1] 为了验证GW6604治疗对基质沉积和肝功能的潜在治疗作用，大鼠连续6周接受DMN治疗，并在最后3周接受GW6604（80 mg kg−1，每日两次，口服）治疗。在DMN给药的前3周，肝脏疾病如前所述发展（Wu & Norton, 1996; George et al., 2001）；DMN仅轻微减缓了体重增长。 DMN组（DMN-GW6604组）中所有接受GW6604治疗的大鼠均存活了6周，而DMN-载体组（DMN-载体组）的死亡率接近50%（表2）。与生理盐水组相比，DMN-载体组的肝脏重量显著下降。GW6604可阻止这种下降，并维持正常的肝脏重量（DMN-载体组为9±1.4 g，DMN-GW6604组为17.3±0.5 g）（表2）。然而，DMN-GW6604组和DMN-载体组的体重增长均被完全抑制（图5）。 PCNA抗体免疫染色显示，DMN载体处理组大鼠肝脏切片中再生肝细胞数量极少，而DMN-GW6604组大鼠肝脏增殖肝细胞数量增加了10倍（图6）。已知长期DMN给药会导致慢性肝病，其特征是广泛的纤维化，最终发展为肝硬化（Wu & Norton, 1996; George et al., 2001）。肝脏基因表达分析表明，DMN处理显著增加了编码基质成分（COL IA1、COL IA2和COL III）以及TIMP-1的mRNA表达，而未影响作为内参基因的18S rRNA的表达。在DMN-GW6604治疗的动物中，编码TGF-β1、胶原蛋白和TIMP-1的mRNA表达水平较DMN-载体组降低了50-75%，表明纤维化过程减少，基质降解增加（表2）。 体内研究已证实GW6604可用于治疗肝纤维化疾病。作为一种ALK5抑制剂，它能阻断TGF-β信号通路，而TGF-β信号通路是纤维化的关键驱动因素。然而，公开文献中关于GW6604的具体体内疗效数据，包括动物模型、给药方案和详细结果，仍然有限。 |
| 酶活实验 |
荧光偏振激酶结合分析[1]
在纯化的重组GST-ALK5（氨基酸残基198-503）上测试了化合物与ALK5的结合。通过不同浓度的测试化合物置换罗丹明绿荧光标记的ATP竞争性抑制剂（详见专利申请WO02/24680，2000）来计算结合pIC50值。将GST-ALK5加入含有62.5 mM Hepes（pH 7.5）、1 mM DTT、12.5 mM MgCl2、1.25 mM CHAPS（所有试剂均购自XXX）和1 nM罗丹明绿标记配体的缓冲液中，使最终ALK5浓度为10 nM（基于酶活性位点滴定）。将 40 μl 酶/配体试剂加入含有 1 μl 不同浓度测试化合物的 384 孔检测板中。立即使用 LJL Acquest 荧光读板机读取孔板，激发波长、发射波长和二向色滤光片分别为 485 nm、530 nm 和 505 nm。Acquest 计算每个孔的荧光偏振值，然后将其导入曲线拟合软件以构建浓度-效应曲线。使用相同的检测条件测定 GW6604 与其他激酶的结合。[1] Alk5 自磷酸化测定[1] ALK5 激酶结构域（Franzen 等，1993）（氨基酸 162-503）通过 PCR 克隆，并在杆状病毒/Sf9 细胞系统中表达。该蛋白在C端添加了6-His标签，并使用Ni2+柱通过亲和层析纯化。所得物质用于评估测试化合物抑制ALK5自磷酸化的能力。[1] 将纯化的酶（10 nM）溶于50 μl Tris缓冲液（50 mM Tris，pH 7.4；100 mM NaCl；5 mM MgCl2；5 mM MnCl2；10 mM DTT）中，并与不同浓度的化合物（测试中二甲基亚砜（DMSO）的最终浓度为0.1%）在37°C下预孵育10分钟。加入3 μM ATP（0.5 μCi γ-33P-ATP）启动反应。在 37°C 下反应 15 分钟后，加入 SDS-PAGE 上样缓冲液（50 mM Tris-HCl (pH 6.9)、2.5% 甘油、1% SDS、5% β-巯基乙醇）终止磷酸化反应。样品在 95°C 下煮沸 5 分钟，然后进行 12% SDS-PAGE 电泳。干燥后的凝胶在磷屏上曝光过夜。使用 Storm 成像系统定量 ALK5 的自磷酸化。[1] 使用重组 ALK5 蛋白和底物肽进行体外激酶活性测定，评估 ALK5 激酶活性。自磷酸化通过放射性 ATP 掺入或磷酸化特异性抗体进行测定。IC50 值由剂量反应曲线计算得出。选择性通过针对一系列相关激酶进行分析来评估。 |
| 细胞实验 |
ALK5抑制剂抗TGF-β活性测定的细胞分析[1]
在HepG2细胞（ATCC）中，通过转录分析检测化合物活性。将细胞稳定转染包含人PAI-1启动子（-806至+72区域）驱动的荧光素酶（萤火虫）报告基因的报告基因构建体，或转染包含九个相邻的先前报道的Smad结合位点拷贝的构建体（Dennler等人，1998）。通过有限稀释法和选定克隆的克隆扩增获得稳定转染的细胞系。含有人类 PAI-1 启动子（-806 至 +72）的细胞系在 TGF-β 刺激下，荧光素酶活性较对照组增加 10 至 20 倍；而含有 9 个相邻 Smad 结合位点的细胞系对 TGF-β 刺激反应更为强烈，添加 TGF-β 后荧光素酶活性增加超过 500 倍。 为检测化合物的抗 TGF-β 活性，将细胞以每孔 35,000 个细胞的浓度接种于 96 孔微孔板中，每孔加入 200 μl 含血清培养基。然后将微孔板置于 37°C、5% CO₂ 的细胞培养箱中培养 24 小时。将细胞培养于无血清BME培养基中，并在加入重组TGF-β1（1 ng ml⁻¹）前30分钟，加入浓度为10 nM至10 μM（DMSO终浓度为1%）的GW6604。过夜孵育后，用PBS洗涤细胞，并加入10 μl被动裂解缓冲液（Promega，Carbonières，France）裂解细胞。以荧光素酶活性相对于对照组的抑制率作为化合物活性的指标。绘制浓度-效应曲线，并从中通过图形确定IC₅₀值。在TGF-β反应性细胞系（如HepG2）中评估细胞活性。用GW6604（0-10 µM）处理细胞，并用TGF-β刺激细胞。通过 qRT-PCR 或荧光素酶报告基因检测来测定 TGF-β 诱导的基因表达（例如 PAI-1）的抑制情况。使用磷酸化 Smad 抗体通过蛋白质印迹法来评估 Smad 磷酸化水平。 |
| 动物实验 |
急性DMN模型[1]
在仔细研究DMN诱导的纤维化发展后，建立了急性DMN模型。其目的是尽早检测与纤维化相关的基因变化，并最终在短时间内测试化合物的体内活性。[1] 体重200-225克的雄性Sprague-Dawley大鼠连续3天（第1-3天）接受腹腔注射12.5 mg kg−1 DMN或生理盐水。随后，动物在第6、7和8天每天两次口服GW6604或其溶剂（20% HCl 1 n、80%羟丙基甲基纤维素(0.5%)、Tween 80(5%)，pH值调节至4），剂量为4 ml kg⁻¹。在第8天，即第五次给药GW6604或溶剂2小时后，通过吸入CO₂处死动物。收集肝脏组织，通过RT-PCR定量胶原蛋白IA1 (COL IA1) mRNA。结果以DMN诱导的COL IA1增加的抑制百分比表示，并与对照组进行比较。COL IA1 mRNA的定量以核糖体18S rRNA为内参。每组使用 4 至 6 只大鼠。[1] 慢性 DMN 模型[1] 体重 200–225 g 的雄性 Sprague–Dawley 大鼠，每周连续 3 天，腹腔注射 10 mg kg−1 的 DMN 或生理盐水，持续 6 周。DMN 给药 3 周后，开始给予 GW6604（80 mg kg−1，口服，每日两次）或其溶剂（4 ml kg−1）治疗，持续 3 周。在 3 周的治疗期间，继续给予 DMN。6 周结束后，用 CO2 吸入法处死动物。采集血液样本，用于实验室分析 ALAT、ASAT、总胆红素、碱性磷酸酶和透明质酸。收集肝脏组织，用于RT-PCR定量分析编码COL IA1、胶原蛋白IA2 (COL IA2)、胶原蛋白III α1链 (COL III)、TIMP-1和TGF-β1的基因，并进行组织学评估。肝脏mRNA水平相对于18S rRNA的变化以与生理盐水对照组相比的倍数变化表示。在6周治疗期结束时报告死亡率。所有动物均存活至DMN治疗的最初3周。 在肝纤维化动物模型（例如CCl4诱导或胆管结扎模型）中研究体内疗效。GW6604通过口服或腹腔注射给药。通过胶原沉积染色进行组织学评估肝纤维化。在肝组织中检测TGF-β信号通路标志物，包括Smad磷酸化和纤维化基因表达。 |
| 药代性质 (ADME/PK) |
GW6604 的分子式为 C19H14N4，分子量为 298.34。通过高效液相色谱法 (HPLC) 测定，其纯度通常 ≥98%。该化合物可溶于二甲基亚砜 (DMSO)。公开文献中尚未充分描述其详细的药代动力学参数，包括半衰期、口服生物利用度和血浆蛋白结合率。
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| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
GW6604 的安全数据表明它是一种仅供实验室使用的研究化合物。包括急性毒性、器官毒性和遗传毒性在内的具体毒理学特征尚未广泛公布。与所有激酶抑制剂一样，应采取适当的安全预防措施进行操作。
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| 参考文献 | |
| 其他信息 |
总之，尽管肝纤维化是一种多因素疾病，但TGF-β似乎发挥着重要作用，新型ALK5抑制剂GW6604的研究结果证实了这一点。GW6604在体外抑制TGF-β信号通路，并在体内阻断TGF-β的作用，这体现在其能够促进肝损伤或部分肝切除术后肝细胞的增殖，以及降低急性和慢性肝纤维化模型中基质基因的表达。在DMN诱导的慢性肝纤维化模型中，GW6604是一种有效的治疗方法，因为它能降低死亡率并减轻纤维化，从而改善肝功能。这些数据表明，通过抑制ALK5来阻断TGF-β的作用是治疗慢性肝病的一种有前景的方法。[1] GW6604是一种用于研究TGF-β信号通路和ALK5生物学的研究工具化合物，尚未获准用于临床。该化合物已被用于研究肝纤维化和其他TGF-β驱动的疾病。GW6604是了解ALK5在纤维化、癌症和免疫调节中作用的重要工具。
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| 分子式 |
C19H14N4
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|---|---|
| 分子量 |
298.34126
|
| 精确质量 |
298.121
|
| 元素分析 |
C, 76.49; H, 4.73; N, 18.78
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| CAS号 |
452342-37-9
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| PubChem CID |
9861063
|
| 外观&性状 |
Off-white to light yellow solid powder
|
| 密度 |
1.2±0.1 g/cm3
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| 沸点 |
505.2±50.0 °C at 760 mmHg
|
| 闪点 |
272.5±16.5 °C
|
| 蒸汽压 |
0.0±1.2 mmHg at 25°C
|
| 折射率 |
1.650
|
| LogP |
3.18
|
| tPSA |
54.46
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
1
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
3
|
| 可旋转键数目(RBC) |
3
|
| 重原子数目 |
23
|
| 分子复杂度/Complexity |
368
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
|
| InChi Key |
BDCBRQYHYNUWAM-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C19H14N4/c1-2-6-14(7-3-1)18-12-15(9-11-21-18)16-13-22-23-19(16)17-8-4-5-10-20-17/h1-13H,(H,22,23)
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| 化学名 |
2-phenyl-4-(5-pyridin-2-yl-1H-pyrazol-4-yl)pyridine
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| 别名 |
GW 6604; GW-6604; 2-Phenyl-4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridine; 2-phenyl-4-(3-pyridin-2-yl-1H-pyrazol-4-yl)pyridine; CHEMBL205736; 273G6SN31H; Pyridine, 2-phenyl-4-(3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl)-; GW6604
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month 注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。 |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : ~100 mg/mL (~335.19 mM)
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 3.3519 mL | 16.7594 mL | 33.5188 mL | |
| 5 mM | 0.6704 mL | 3.3519 mL | 6.7038 mL | |
| 10 mM | 0.3352 mL | 1.6759 mL | 3.3519 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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