Kainate receptor (IC50 = 7.5 μM); AMPA receptor (IC50 = 11 μM)

在培养的大鼠海马神经元中，GYKI 52466 (0.3-100 μM) 抑制 AMPA 和红藻氨酸受体触发的内向电流[1]。

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在培养的大鼠海马神经元的全细胞电压钳记录中，2,3-苯并二氮杂卓GYKI 52466是红藻氨酸和AMPA激活电流的强效拮抗剂（IC50值分别为7.5和11微M），但对N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）或γ-氨基丁酸反应没有活性。GYKI 52466产生的阻断以非竞争性方式发生，与电压无关，并且没有表现出使用依赖性，表明存在变构阻断机制。在以红藻氨酸为激动剂的动力学实验中，GYKI 52466的结合率和解结合率分别为1.6 x 10（5）M-1 s-1和3.2 s-1。GYKI 52466也通过突触后作用抑制非NMDA受体介导的自发突触电流。非竞争性AMPA/红藻氨酸拮抗剂，如GYKI 52466，在治疗谷氨酸相关神经系统疾病方面比竞争性拮抗剂具有优势，特别是在高水平氨基酸会使竞争性拮抗药相对无效的情况下。此外，研究结果表明，非典型苯二氮卓类药物在非NMDA受体上存在一个新的识别位点[1]。

在 DBA/2 小鼠中，GYKI 52466（腹膜内注射；1.76-13.2 mg/kg；一次）治疗可提供强大的抗惊厥保护，防止声音引起的癫痫发作[2]。

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作用于非NMDA受体的兴奋性氨基酸拮抗剂NBQX（2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰苯并（F）喹喔啉）和GYKI 52466（1-（4-氨基苯基）-4-甲基-7,8-亚甲二氧基-5H-2,3-苯并二氮杂卓）对AMPA[RS）-α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸诱导的瑞士小鼠癫痫发作和易感癫痫发作的DBA/2小鼠声音诱导的癫痫发作提供了有效的抗惊厥保护。在腹腔注射NBQX后5-30min和腹腔注射后5-15min观察到最大的抗惊厥作用。DBA/2小鼠服用GYKI 52466。NBQX（腹腔注射30分钟）和GYKI 52666（腹腔注射15分钟）对AMPA诱导的癫痫发作的保护作用的ED50值分别为23.6（11.6-48.0）和18.5（11.5-29.5）mumol/kg。DBA/2鼠在15分钟对声音诱导的癫痫的保护作用为31.3（24.9-39.4）mumol/kg（NBQX，腹腔注射）、37.8（21.2-67.4）mumol/kg（NBQX，静脉注射）13.7（11.5-16.5）mumol/kg（GYKI 52466，腹腔注射）。在DBA/2小鼠中，NBQX（15和30分钟，腹腔注射）的治疗指数（旋转棒性能受损和抗惊厥作用的ED50值之比）为6.6，GYKI 52466（15分钟，腹腔内注射）为2.0[2]。

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作用于非NMDA受体的兴奋性氨基酸拮抗剂NBQX（2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰苯并（F）喹喔啉）和GYKI 52466（1-（4-氨基苯基）-4-甲基-7,8-亚甲二氧基-5H-2,3-苯并二氮杂卓）对AMPA[RS）-α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸诱导的瑞士小鼠癫痫发作和易感癫痫发作的DBA/2小鼠声音诱导的癫痫发作提供了有效的抗惊厥保护。在腹腔注射NBQX后5-30min和腹腔注射后5-15min观察到最大的抗惊厥作用。DBA/2小鼠服用GYKI 52466。NBQX（腹腔注射30分钟）和GYKI 52666（腹腔注射15分钟）对AMPA诱导的癫痫发作的保护作用的ED50值分别为23.6（11.6-48.0）和18.5（11.5-29.5）mumol/kg。DBA/2鼠在15分钟对声音诱导的癫痫的保护作用为31.3（24.9-39.4）mumol/kg（NBQX，腹腔注射）、37.8（21.2-67.4）mumol/kg（NBQX，静脉注射）13.7（11.5-16.5）mumol/kg（GYKI 52466，腹腔注射）。在DBA/2小鼠中，NBQX（15和30分钟，腹腔注射）的治疗指数（旋转棒性能受损和抗惊厥作用的ED50值之比）为6.6，GYKI 52466（15分钟，腹腔内注射）为2.0[2]。

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双向RM-ANOVA比较性别和剂量表明，GYKI 52466在乙醇增强反应中产生了显著的剂量依赖性降低[F（4,44）="12，p < 0.0001] 但性别没有影响，也没有相互作用。计划多重比较显示，GYKI 52466（5.6和10 mg/kg）降低了雄性和雌性小鼠中乙醇增强反应的数量（图5B）。对获得的增强剂数量的分析也表明，GYKI 52466具有显著的剂量依赖性效应[F（4,44）="13，p < 0.0001] 这得到了性别内个体计划比较的支持（图5C）。有趣的是，对乙醇摄入量（g/kg）进行的RM-ANOVA研究发现，性别有显著影响[F（1,11）="13，p = 0.0041] GYKI 52466[F（4,44）=9.5，p < 0.0001]. 性别间的计划比较显示，只有GYKI 52466（10mg/kg）显著降低了两性的乙醇摄入量（图5D）。

由于雄性和雌性小鼠自我给药的基线水平不同，将乙醇增强反应的参数转换为百分比对照，以评估GYKI 52466的相对效果（图5E-G）。对图表的目视检查显示，雄性和雌性小鼠之间乙醇自我给药的变化程度相对相同。RM-ANOVA确定了GYKI 52466对乙醇增强反应的显著主效应[F（4,44）="12.26，p < 0.0001],乙醇增强剂的数量[F（4,44）=5.5，p = 0.0011],乙醇摄入量[F（4,44）=4.7，p = 0.0030] 总反应和增强剂呈剂量依赖性减少，但摄入量没有减少（图5E-G）。

对最高剂量GYKI 52466后乙醇增强反应的时间模式进行了分析。对5分钟箱中收集的原始反应总量进行双向RM-ANOVA，包括时间（0-60分钟）和GYKI 52466（0或10分钟） mg/kg）作为受试者因素。对于男性，GYKI 52466具有显著的主效应[F（1,4）=9.124，p = 0.039] 但没有时间的影响，也没有交互作用，这表明在整个会话过程中，响应总数一直在减少。对于女性来说，GYKI 52466的效果显著[F（1,7）=39.78，p = 0.0004] 时间[F（11,77）=2.876，p = 0.0033] 但没有相互作用，表明响应随时间持续减少。乙醇增强反应总量在图5H中以图形方式表示为累积分布，以可视化GYKI 52466对持续操作行为速率的影响，这对于评估乙醇增强功能的改变至关重要。

最后，为了研究AMPAR抑制的潜在非特异性运动效应，在GYKI 52466（0、5.6和10 mg/kg，IP）在单独的行为测试中。双向RM方差分析发现，在1小时内对自发运动活动没有影响 h会话（图5I）。由于男性组的n值较低，我们进行了二次分析，将性别作为一个因素，并对GYKI 52466对旷场运动活动的影响进行了RM单因素方差分析。同样，我们发现对1没有影响 h露天场地的运动活动[4]。

在此之后，60 μl抗GluR2，3 ng μl−1用于GluA2FRET纯化 或60 μl 2.4的抗TARPγ2 ng μl-1用于GluA2-γ2FRET在1×PBS中的纯化，通过腔室施加两次，并孵育20 然后用1×PBS洗涤。BSA（0.1毫克 ml−1）被引入腔室并孵育15分钟 分钟，然后用1×PBS洗涤。使用原位免疫沉淀法，通过施加50 µl样品通过腔室三次，孵育20分钟 那么，90 µl氧气清除溶液缓冲系统（ROXS）被应用于含有1 mM甲基紫精，1 mM抗坏血酸、0.01%w/w吡喃糖氧化酶、0.001%w/v过氧化氢酶、3.3%w/w葡萄糖、1 mM DDM和0.2 mM CHS在pH 7.4的PBS中。对于CTZ条件，1 mM谷氨酸和100 μM CTZ被引入到ROXS中。在GYKI 52466处理条件下，1 mM谷氨酸和100 μM的GYKI 52466被引入到ROXS中。[3]

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电生理学： 对于含有eGFP用于细胞检测的GluA2-γ2EM的电生理测量，1 使用Lipofectamine 2000将μg DNA转染到3cm培养皿中的HEK293T细胞中。膜片钳记录时间为24-48小时 h后用火焰抛光硼硅酸盐玻璃转染。1-4支移液管 MΩ电阻内充溶液：110 mM CsF，30 mM氯化铯，4 mM氯化钠，0.5 mM氯化钙，10 mM HEPES和5 mM EGTA（用CsOH调节至pH 7.4）。细胞外溶液由150 mM氯化钠，3 mM氯化钾，2 mM氯化钙和10 用NaOH将mM HEPES调节至pH 7.4。使用SF-77B灌注快速步骤将外部溶液局部应用于提升的细胞或贴片。抑制浓度-反应测定，100 μM CTZ在细胞外缓冲液中预孵育至少30-60 s、 以及相应的GYKI 52466浓度。对于通道激活，1 100 mM谷氨酸 μM CTZ和相应的GYKI 52466浓度施加500 在每种条件下获得2-10次扫描进行平均之前，允许ms和记录达到平衡。剩余电流的平均值是使用200到500之间的范围获得的 应用Glu后的ms，用于抑制浓度-反应分析。使用Axopatch 200B放大器在-60℃下进行记录 mV保持电位，在2时采集 使用pCLAMP10软件。使用Clampfit 11软件分析单个膜片钳迹线和IC50的平均剩余电流。使用Levenberg-Marquardt迭代算法，使用OriginPro 2023b进行非线性曲线拟合，分析抑制浓度-反应结果。实验数据符合以下方程式[3]。

动物/疾病模型： 测试雄性和雌性 DBA/2 小鼠对声音诱发癫痫发作的反应[2]
剂量： 1.76-13.2 mg/kg
给药途径： 腹腔注射 (ip)；1.76-13.2 mg/kg；一次
实验结果： 观察到腹腔注射后（5-15 分钟）抗惊厥作用最强。

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GYKI 52466 对操作性酒精自我给药的影响[4]
有酒精自我给药史的雄性和雌性小鼠（n = 16；每组 n = 8）习惯于注射 0.9% 生理盐水。注射在操作性条件反射训练开始前30分钟进行，两次注射之间至少间隔3次操作性条件反射训练。最初，进行习惯化注射，直至注射后的自我给药行为稳定（4-6次注射）。一旦反应稳定，采用平衡设计，分别腹腔注射给予赋形剂和4种剂量的GYKI 52466二盐酸盐（0.3、1.0、5.6和10.0 mg/kg）。每只动物每周最多注射两次，以确保给药后反应恢复至基线水平。

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运动功能测试 + GYKI 52466 剂量效应曲线 [4]
在进行操作性自我给药后，使用计算机控制的开放式场地箱（27 cm × 27 cm × 20 cm）测试小鼠对 GYKI 52466 的非特异性运动功能的影响，方法如前所述（Riday 等，2012；Agoglia 等，2015b；Faccidomo 等，2015；Stevenson 等，2019；Faccidomo 等，2020）。使用两组 16 个脉冲调制红外光束记录小鼠的 XY 轴运动，每 60 秒评估一次小鼠的位置，以量化其运动距离（厘米）。有乙醇自我给药史的雄性和雌性小鼠在开放式场地装置中适应 2 小时。一周后，小鼠被注射药物，放回笼中休息30分钟，然后放入旷场装置中1小时。采用平衡设计，分别给予小鼠赋形剂和两种剂量的GYKI 52466（5.6和10.0 mg/kg，腹腔注射），两次测试间隔至少1周。由于两个旷场装置出现技术问题，两只雄性小鼠的数据被排除在最终分析之外。因此，对GYKI 52466进行了二次分析，合并了雄性和雌性小鼠的数据。

GYKI 52466溶解于0.9%氯化钠溶液中，用于小鼠腹腔注射（IP），剂量分别为（0.0、0.3、1.0、5.6和10 mg/kg）。

[1]. GYKI 52466, a 2,3-benzodiazepine, is a highly selective, noncompetitive antagonist of AMPA/kainate receptor responses. Neuron. 1993 Jan;10(1):51-9.

[2]. The anticonvulsant effect of the non-NMDA antagonists, NBQX and GYKI 52466, in mice. Epilepsy Res. 1991 Jul;9(2):92-6.

[3]. Allosteric competition and inhibition in AMPA receptors. Nat Struct Mol Biol. 2024 Nov;31(11):1669-1679.

[4]. Distinct sex differences in ethanol consumption and operant self-administration in C57BL/6J mice with uniform regulation by glutamate AMPAR activity. Front Behav Neurosci. 2025 Jan 22:18:1498201

GYKI 52466 是一种苯二氮卓类药物。兴奋性神经传递主要由 α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸 (AMPA) 亚型离子型谷氨酸受体 (AMPAR) 介导。负性变构调节剂是潜在的治疗药物，它们抑制 AMPAR 的激活，并能与正性变构调节剂竞争，通过尚未明确的机制控制 AMPAR 的功能。本文表明，变构抑制使 AMPAR 进入一种独特的状态，这种状态既阻止了激活，也阻止了正性变构调节。我们利用冷冻电镜捕获了与谷氨酸结合的 AMPAR，同时负性变构调节剂 GYKI 52466 和正性变构调节剂环噻嗪竞争控制 AMPAR。 GYKI 52466 与离子通道环结合，通过将配体结合域与离子通道解偶联来抑制 AMPAR。配体结合域的重排破坏了环噻嗪结合位点，从而阻止了正向调节。我们的数据为理解 AMPAR 的变构作用以及合理设计靶向 AMPAR 的神经系统疾病治疗药物提供了框架。[3]

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引言：在临床前研究中将性别作为生物学变量 (SABV) 考虑，可以加深对酒精使用障碍 (AUD) 神经生物学的理解。然而，性别差异背后的行为和神经机制仍不清楚。本研究旨在通过评估乙醇 (EtOH) 的强化作用及其在雄性和雌性小鼠中受谷氨酸 AMPA 受体活性调控的情况，阐明乙醇摄入中的 SABV。
方法：在笼内，分别在持续和限制摄入条件下评估 C57BL/6J 小鼠（雄性和雌性）的乙醇摄入量。本研究评估了对乙醇镇静作用的急性敏感性和血液清除率作为潜在的调节因素。采用操作性条件反射自我给药实验测量了小鼠摄入乙醇的动机。通过测试谷氨酸AMPA受体拮抗剂对操作性条件反射乙醇自我给药的影响，研究了乙醇强化作用神经调节的性别差异。
结果：雌性C57BL/6J小鼠在持续和限制性摄入条件下均表现出乙醇摄入量随时间增加的趋势。尽管清除率相似，但雌性小鼠对乙醇镇静作用的敏感性较低，且在乙醇给药（4 g/kg）后血液浓度也较低。与雄性小鼠相比，雌性小鼠在30天的基线期内表现出更高的操作性条件反射乙醇自我给药率和渐进比率任务表现。 AMPAR拮抗剂GYKI 52466（0-10 mg/kg，腹腔注射）呈剂量依赖性地降低了雌雄小鼠的乙醇强化按压杠杆行为，且效力和效能无差异。
讨论：这些发现证实，在笼养条件下，雌性C57BL/6J小鼠的乙醇摄入量高于雄性，且急性镇静作用减弱，这可能导致其乙醇摄入量更高。雌性小鼠表现出更高的操作性乙醇自我给药行为和动机，表明乙醇强化效能更高。GYKI 52466相对效应无性别差异，提示雌雄小鼠的乙醇强化作用均需要AMPA受体活性。[4]

C17H15N3O2

293.3199

329.093

C, 69.61; H, 5.15; N, 14.33; O, 10.91

102771-26-6

GYKI 52466 dihydrochloride;2319722-40-0;GYKI 52466 hydrochloride;192065-56-8

3538

Typically exists as solid at room temperature

472.8ºC at 760 mmHg

239.7ºC

4.15E-09mmHg at 25°C

3.021

69.2

1

5

1

22

482

0

CC1CC2C=C3OCOC3=CC=2C(C2C=CC(N)=CC=2)=NN=1

LFBZZHVSGAHQPP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H15N3O2/c1-10-6-12-7-15-16(22-9-21-15)8-14(12)17(20-19-10)11-2-4-13(18)5-3-11/h2-5,7-8H,6,9,18H2,1H3

4-(8-methyl-9H-[1,3]dioxolo[4,5-h][2,3]benzodiazepin-5-yl)aniline

Gyki-52466; 102771-26-6; GYKI 52466; 4-(8-Methyl-9H-1,3-dioxolo(4,5-h)(2,3)benzodiazepin-5-yl)benzenamine; GYKI-2466; 471V8NZ5X3; 4-(8-Methyl-9H-1,3-dioxolo[4,5-h][2,3]benzodiazepin-5-yl)benzenamine; 1-(p-Aminophenyl)-4-methyl-7,8-methylenedioxy-5H-2,3-benzodiazepine hydrochloride;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。