Hellebrigenin   中文名称: 嚏根草配基

Na⁺/K⁺-ATPase complexes: The document mentions that hellebrigenin, like other bufadienolides, possesses higher binding affinity and inhibition for α1β1 than for α2β1 and α3β1 Na⁺/K⁺-ATPase complexes. [1]
Akt: Hellebrigenin inhibits Akt expression and phosphorylation (at Thr308 and Ser473). This is not a direct binding target but a downstream effect. [1]

HepG2细胞的细胞毒性：Hellebrigenin以剂量和时间依赖的方式显著降低HepG2细胞的活力。处理24小时、48小时和72小时后，IC50值分别为0.40 ± 0.05 μmol/L、0.13 ± 0.01 μmol/L和0.10 ± 0.01 μmol/L。[1]
克隆形成抑制：Hellebrigenin处理（62.5、125和400 nmol/L，处理12小时）导致HepG2细胞在10天内形成的克隆数量呈剂量依赖性减少。[1]
细胞周期分析：PI染色流式细胞术分析显示，hellebrigenin诱导HepG2细胞浓度和时间依赖性地积累在G2/M期。 [1]
DNA损伤（彗星试验）：用hellebrigenin（62.5和125 nmol/L，处理48小时）处理后，彗星试验结果显示DNA损伤显著，表现为彗星尾长度、彗星尾DNA百分比和Olive尾矩的增加（P < 0.001）。[1]
DNA损伤免疫荧光：共聚焦显微镜显示，在hellebrigenin处理的细胞中，p-H2AX（Ser¹³⁹）积累，p-H2AX是DNA双链断裂的敏感标志物。[1]
细胞凋亡检测（Hoechst 33258）：用hellebrigenin（62.5、125和250 nmol/L，处理48小时）处理后，HepG2细胞表现出早期凋亡的形态学特征，表现为核浓缩产生的明亮蓝色荧光。 [1]
细胞凋亡定量（Annexin V-FITC/PI）：流式细胞术结果显示，经海勒布里金宁处理后，细胞凋亡率呈浓度依赖性增加，从2.4%增至17.9%；呈时间依赖性增加，从1.9%增至15.3%。[1]
线粒体膜电位（ΔΨm）：JC-1染色实验表明，海勒布里金宁处理导致ΔΨm显著下降，呈浓度依赖性下降，从99.8%降至63.8%；呈时间依赖性下降，从99.5%降至62.4%。[1]
蛋白质印迹分析：海勒布里金宁处理调节了多种参与细胞周期、DNA损伤反应和细胞凋亡的蛋白质的表达。这包括上调 p-ATM (Ser¹⁹⁸¹)、p-Chk2 (Tyr⁶⁸)、p-CDK1 (Tyr¹⁵)、细胞周期蛋白 B1、Bax、裂解型 caspase-9、裂解型 caspase-3 和裂解型 PARP。它还导致 p-CDC25C (Ser²¹⁶) 下调、Bax 易位至线粒体以及细胞色素 c 从线粒体释放到胞质溶胶。此外，海勒布里金显著下调了总 Akt 及其磷酸化形式 p-Akt (Thr³⁰⁸) 和 p-Akt (Ser⁴⁷³)。 [1] Akt 沉默（siRNA）实验：用 Akt siRNA（100 nmol/L）转染可显著阻断 G2/M 期细胞周期阻滞，但增强 hellebrigenin 诱导的细胞凋亡，表现为亚 G1 期细胞比例增加和 PARP 裂解。[1] Akt 激活（hIGF-I）：用 Akt 激活剂 hIGF-I（100 ng/mL）预处理可显著减弱 hellebrigenin 诱导的细胞毒性。[1]

细胞活力检测（MTT）：将HepG2细胞（5000个/孔）接种于96孔板中，并用不同浓度的hellebrigenin（8 nmol/L至1000 nmol/L）处理24、48和72小时。处理后，加入MTT溶液（5 mg/mL）孵育4小时。将生成的甲臜晶体溶解于DMSO中，并在570 nm处测定吸光度。细胞活力以相对于对照组（0.2% DMSO）的百分比表示。[1]
克隆形成实验：将HepG2细胞（300个/孔）与hellebrigenin（62.5、125和400 nmol/L）孵育12小时。然后更换新鲜培养基，继续培养10天以观察克隆形成。将细胞克隆用甲醇在-20°C固定30分钟，并用1%结晶紫染色。[1]
细胞周期分析：将HepG2细胞（300,000个/孔）用hellebrigenin（62.5、125和250 nmol/L，处理48小时；或125 nmol/L，处理24、36和48小时）处理。将细胞用75%乙醇在4°C固定过夜，然后在37°C避光条件下用PI（0.2 mg/mL）孵育15分钟。通过流式细胞仪分析PI荧光，并使用软件确定细胞周期分布。[1]
彗星试验：将HepG2细胞（300,000个/孔）用hellebrigenin（62.5和125 nmol/L）处理48小时。将细胞与彗星琼脂糖混合，并转移至彗星载玻片上。载玻片在4°C的裂解缓冲液中孵育过夜，然后进行碱性电泳（40 V），持续30分钟。固定并风干后，用Vista Green DNA染料对细胞进行染色。拍摄彗星照片，并使用图像分析软件评估每个样本至少20个细胞的彗尾长度、彗尾DNA含量百分比和橄榄尾矩等参数。[1]
p-H2AX免疫荧光：用hellebrigenin（62.5和125 nmol/L，处理48小时）处理HepG2细胞，然后用4%甲醛固定，并用0.1% Triton X-100透化。封闭细胞后，与p-H2AX（Ser¹³⁹）一抗孵育，随后与Alexa Fluor 647标记的二抗孵育，最后进行DAPI染色。使用激光扫描共聚焦显微镜采集图像。 [1]
细胞凋亡检测（Hoechst 33258）：将HepG2细胞（5000个/孔）用不同浓度的hellebrigenin（62.5、125和250 nmol/L）处理48小时。然后将细胞在黑暗中与Hoechst 33258（10 μg/mL）孵育30分钟。用PBS洗涤后，在荧光显微镜下观察细胞，激发波长为350 nm，发射波长为460 nm。[1]
细胞凋亡定量（Annexin V-FITC/PI）：收集用hellebrigenin处理的HepG2细胞，并按照制造商的说明书使用Annexin V-FITC/PI染色试剂盒进行染色。然后通过流式细胞术分析染色后的细胞，以定量早期和晚期凋亡细胞的百分比。 [1]
线粒体膜电位测定 (JC-1)：将 HepG2 细胞（300,000 个/孔）用 hellebrigenin（62.5、125 和 250 nmol/L，处理 24 小时）处理。然后用 JC-1（10 μmol/L）在黑暗中染色 30 分钟。使用流式细胞仪检测 JC-1 荧光（红色代表聚集体，绿色代表单体）。[1]
蛋白质印迹分析：将细胞（2,000,000 个/皿）用 hellebrigenin（62.5 和 125 nmol/L，处理 48 小时；或 125 nmol/L，处理 24 和 48 小时）处理。制备总蛋白裂解物以及胞质和线粒体组分。同时制备核提取物。使用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白（50 μg）进行 SDS-PAGE 电泳分离，并将蛋白转移至 PVDF 膜上。封闭膜后，用特异性一抗进行免疫印迹分析。使用增强型化学发光底物显色。[1]
Akt siRNA 干扰：将汇合度约为 60% 的 HepG2 细胞（2,000,000 个/皿）用脂质体转染试剂转染人 Akt siRNA 双链（100 nmol/L）。36 小时后，收集细胞，通过 Western blot 验证 Akt 敲低。然后将转染细胞暴露于 hellebrigenin 48 小时，随后分析细胞活力、细胞周期分布和凋亡诱导情况。[1]

该文件指出，蟾蜍二烯内酯类化合物（包括海勒布里苷）已知具有强心作用和心脏毒性，这主要归因于其对Na⁺/K⁺-ATP酶的抑制以及随后导致的细胞内钙离子水平升高。这是一种普遍的类化合物效应，本研究并未获得海勒布里苷的具体毒性数据。[1]

[1]. Hellebrigenin induces cell cycle arrest and apoptosis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells through inhibition of Akt. Chem Biol Interact. 2014 Aug 5;219:184-94.

据报道，在有相关数据的蟾蜍（Bufo gargarizans）、蟾蜍（Bufo bufo）和其他生物体中均发现了赫勒布里苷元。

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背景：赫勒布里苷元是一种蟾蜍二烯内酯，属于强心甾类化合物，存在于蟾蜍的皮肤分泌物以及嚏根草属和伽蓝菜属植物中。它最初是从传统中药蟾蜍毒液中分离得到的。[1]
已知的抗癌活性：既往研究表明，赫勒布里苷元对多种癌细胞系具有活性，包括HL-60、HCT-8、A549、Hsa83、MCF-7、PC-3、KB和HeLa细胞。此外，据报道，它还能克服癌细胞中ABCB1或ABCC1介导的多药耐药性和凋亡抵抗。 [1]
作用机制：本研究首次报道了海勒布里金宁可诱导DNA双链断裂，进而激活ATM-Chk2通路，最终导致G2/M期细胞周期阻滞。它还能触发线粒体凋亡通路，其特征是Bax易位、线粒体膜电位丧失、细胞色素c释放和caspase激活。该研究进一步证实，Akt抑制参与了海勒布里金宁诱导的细胞周期阻滞和凋亡的调控。[1]
治疗潜力：研究结果支持海勒布里金宁作为肝癌化疗药物的潜力。然而，作者指出，应注意其潜在的心脏毒性，可能需要结构修饰或控释制剂等策略来提高其安全性和有效性。[1]

C24H32O6

416.5073

416.22

465-90-7

259577

White to off-white solid powder

1.419g/cm3

626.3ºC at 760 mmHg

175 °C

215ºC

1.675

2.535

107.97

3

6

2

30

834

8

C[C@]12CC[C@H]3[C@H]([C@]1(CC[C@@H]2C4=COC(=O)C=C4)O)CC[C@]5([C@@]3(CC[C@@H](C5)O)C=O)O

TVKPTWJPKVSGJB-XHCIOXAKSA-N

InChI=1S/C24H32O6/c1-21-8-5-18-19(6-10-23(28)12-16(26)4-9-22(18,23)14-25)24(21,29)11-7-17(21)15-2-3-20(27)30-13-15/h2-3,13-14,16-19,26,28-29H,4-12H2,1H3/t16-,17+,18-,19+,21+,22-,23-,24-/m0/s1

(3S,5S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,5,14-trihydroxy-13-methyl-17-(6-oxopyran-3-yl)-2,3,4,6,7,8,9,11,12,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-10-carbaldehyde

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。