| 规格 | 价格 | |
|---|---|---|
| 500mg | ||
| 1g | ||
| Other Sizes |
| 靶点 |
Microtubule; tubulin polymerization
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|---|---|
| 体外研究 (In Vitro) |
在这项研究中，设计、合成和评估了与Combretastatin a-4和异Combretasttatin a-4相关的各种原始配体，这些配体能够抑制微管蛋白聚合成微管。我们的先导化合物15d具有喹唑啉作为a环和2-取代吲哚作为B环，通过N-甲基连接体分离，对9个人癌症细胞系显示出显著的亚纳摩尔水平的细胞毒性（IC50＜1nM）。[1]
在这项工作中，设计并合成了一系列具有苯基或吡啶连接体的异康布他汀a-4（isoCA-4）的环状桥联类似物。所需类似物的合成是通过形成硝基乙烯基中间体，然后进行Cadogan环化来进行的。构效关系（SAR）研究表明，喹哪啶作为环A，吡啶作为接头，吲哚作为环B在同一分子中的组合对细胞毒性活性起着关键作用。在所有测试的化合物中，化合物42对一组癌症细胞系显示出最高的抗增殖活性，平均IC50值为5.6nM。此外，化合物42对MDR1过表达的K562R细胞系显示出高抗增殖活性；因此，它的活性分别比参比化合物isoCA-4和CA-4高1.5倍和12倍。此外，42对结肠癌细胞（HT-29）显示出很强的抗增殖活性，结肠癌细胞对康布他汀a-4和异CA-4具有抗性，发现其活性比天然CA-4高8000倍。化合物42在体外和细胞内均能有效抑制微管蛋白聚合，并诱导细胞周期阻滞在G2/M期。接下来，我们证明化合物42通过线粒体功能障碍剂量依赖性地引起胱天蛋白酶诱导的K562细胞凋亡。最后，与参考化合物相比，我们评估了化合物42在人类非癌症细胞中的作用。我们证明，在静止的外周血淋巴细胞（PBL）中，42的细胞毒性比isoCA-4低73倍。总之，这些结果表明，化合物42是一种有前景的微管蛋白抑制剂，值得进一步研究[2]。 |
| 酶活实验 |
CH化合物与大鼠和人肝微粒体的孵育[1]
以20mg/mL的蛋白质浓度提供大鼠肝微粒体（RLM）和人肝微粒剂（HLM）。以1mg/mL的最终蛋白质浓度对10mM缓冲液（pH 7.4）中的微粒体悬浮液进行孵育。在37°C预热后，在由0.6 mM NADPNa4、6.4 mM葡萄糖-6-磷酸和2 U/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成的NADPH生成系统存在的情况下，通过添加最终浓度为100μM的底物（占总孵育体积的2%）开始孵育，并在37°C.下摇动溶液。在0、1、3、6、24、48、72、96小时（最多144小时）的孵育时间后，将50μL等分试样（一式三份）放入含有100μL内标溶液（isoCA-4，2500 ng/mL乙腈）的聚丙烯管中，并与1 mL乙酸乙酯混合以停止反应。在13000 rpm下离心4分钟后，在40°C下真空离心蒸发回收的有机相，将残渣溶解在0.1 mL乙腈中，并通过HPLC-MS/MS进行分析。 微管蛋白结合试验[1] 按照Shelanski程序分离猪脑微管蛋白。将微管蛋白溶解在0.1 M MES缓冲液、1.5 mM GTP、1 mM EGTA、1 mMβ-ME、1 mM MgCl2、pH 6.7缓冲液中，并在TLA-100.3转子（Beckman Optima TLX离心机）中以50000 rpm离心30分钟。然后将微管蛋白稀释至1.5 mg/mL。含有配体或DMSO（阴性对照）的样品在20°C下孵育30分钟，然后在冰上冷却10分钟。由于温度从4°C变化到37°C引起的浑浊，通过450 nm处的紫外吸光度增加来评估微管蛋白聚合。当达到稳定的吸光度值并保持至少20分钟时，将温度切换回4°C，以确定是否恢复到初始吸收值，以确认该过程的可逆性。每个实验的微管蛋白组装程度计算为稳定平台（37°C时的吸光度）和曲线初始基线（4°C时吸光度）之间的振幅差。在相同条件下但没有配体的对照实验被视为100%微管蛋白聚合。通过测量不同配体浓度下微管蛋白聚合抑制活性来确定微管蛋白聚合的IC50值。将获得的溶液中总配体与总微管蛋白的摩尔比值拟合为单指数曲线，并使用Graphpad Prism 7.0软件从三个独立实验的最佳拟合曲线计算微管蛋白聚合抑制的IC50值。 |
| 细胞实验 |
细胞周期分析[1]
将指数生长的癌症K562与不同浓度（0.5和1nM）的15d或单独在DMSO中孵育24小时。如前所述，通过FC500流式细胞仪上的流式细胞术测定细胞周期谱。 线粒体膜电位测定[1] 凋亡的标志之一是线粒体膜电位（ΔΨm）的丧失。通过5,5′，6,6′-四氯-1,1′，3,3′-四乙基苯并咪唑基碳环九碘化物/氯化物（JC-1）检测线粒体电位的变化，JC-1是一种阳离子染料，在线粒体中表现出电位依赖性积累，其荧光发射从红色（590 nm）转变为绿色（525 nm）。简而言之，K562细胞用不同浓度的吲哚15d处理48小时。处理后，将细胞重新悬浮在含有2μM终浓度JC-1探针的1 mL PBS中，并在37°C下孵育15分钟。在FC500流式细胞仪上对细胞进行分析。 菌落形成分析[1] 对于集落形成试验，将人慢性髓系白血病K562细胞在罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基中培养，补充10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液（100×）。伊马替尼耐药K562（K562IR）细胞是韩国首尔天主教大学赠送的礼物，在RPMI 1640培养基中培养，该培养基含有25 mM HEPES，并补充了10%（v/v）FCS和1%（v/v）抗生素-抗真菌剂。K562IR细胞用1μM伊马替尼培养，每次实验前洗涤三次。细胞在37°C和5%的CO2的加湿气氛中保持。Mycarert™每30天进行一次支原体检测，解冻后三个月内使用细胞。对于集落形成试验，计数103个K562或K562IR细胞，并在添加了10%FBS的半固体甲基纤维素培养基中生长，在没有或存在指定浓度15d的情况下。在培养10天后，通过添加1mg/mL的3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）试剂检测菌落，并使用Image J 1.8.0软件进行分析。除非另有说明，否则三个独立实验的数据表示为平均值±标准差，并使用双向方差分析（方差分析）进行显著性估计，然后使用GraphPad Prism 8软件进行Tukey多重比较检验。当p<0.05时，p值被认为具有统计学意义。图例表示如下：*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。 |
| 参考文献 |
[1]. Anticancer properties of indole derivatives as IsoCombretastatin A-4 analogues. Eur J Med Chem . 2021 Nov 5:223:113656.
[2]. Cyclic bridged analogs of isoCA-4: Design, synthesis and biological evaluation. Eur J Med Chem . 2021 Jan 1:209:112873. |
| 其他信息 |
总体而言，我们高效合成了多种具有吡啶并吲哚、噁嗪并吲哚和吲哚核结构的异构CA-4类似物。在合成的26种化合物中，绝大多数表现出优异的细胞毒性，可与CA-4和异构CA-4作为参考化合物相媲美。化合物15d，其A环为喹唑啉，B环为2-取代吲哚，并通过N-甲基连接，被证明是这些不同系列化合物中最具潜力的。吲哚-喹唑啉化合物15d对9种人类癌细胞系表现出优异的细胞毒性，其浓度低于纳摩尔级，这在以往的研究领域尚属首次。此外，该化合物对耐阿霉素的K562R慢性粒细胞白血病细胞系也表现出显著的疗效。这种化合物在经典的微摩尔浓度下即可抑制微管蛋白组装成微管，并表现出非常优异的代谢稳定性，使其成为一种极具潜力的候选药物。细胞周期研究表明，化合物 15d 在 0.5 nM 的极低浓度下即可阻滞细胞周期于 G2/M 期，而在此浓度下，15d 还会导致严重的线粒体功能障碍。有趣的是，吲哚类化合物 15d 能够以剂量依赖的方式显著降低 K562 和 K562IR 细胞克隆的数量、总表面积和平均大小。此外，分子对接研究表明，化合物 15d 与 β-微管蛋白结合时，通过形成 3 个稳定的氢键，呈现出与 isoCA-4 相似的取向。从治疗角度来看，需要注意的是，化合物 15d 的细胞毒性过大，不适用于体内治疗。因此，由于该化合物具有极高的细胞毒性（IC50 ≪ 1 nM），可将其作为抗体药物偶联物（ADC）策略中的有效载荷，正如最近报道的CA-4所示。此外，如我们实验室对isoCA-4的研究所示，15d也可被包封于角鲨烯纳米颗粒中以提高疗效，或用于脂质体制剂。目前，实验室正在进行进一步的研究，以确定该化合物的全部开发潜力。[1]
在这项工作中，我们设计并合成了一系列异康布瑞他汀A-4的环桥类似物（CBA）衍生物，其中A环为不同的芳基或杂芳基环，B环为吲哚。构效关系（SAR）研究发现，最佳组合的结构为：（i）喹啉核作为A环；（ii）通过吡啶连接；（iii）吲哚核作为B环。在这些新型化合物中，喹啉基-吡啶基-吲哚 (QnPyInd) 42 尤为引人注目，它对七种人类癌细胞系表现出良好的抗增殖活性。此外，这种新型三杂环衍生物 42 对 PGP 过表达的多药耐药白血病细胞 (K562-R) 以及高度耐药和 CA-4 的 HT-29 细胞均表现出较高的细胞毒活性；鉴于 Pgp 的表达通常与临床化疗耐药相关，这一结果意义重大。化合物 42 直接靶向微管蛋白，这体现在其体外抑制纯微管蛋白聚合的能力上。有趣的是，尽管其解聚微管的活性在体外和细胞内均不如 CA-4 和 isoCA 显著，但化合物 42 的细胞毒活性至少与 CA-4 和 isoCA 相当。尽管我们不能完全排除化合物 42 具有除微管蛋白以外的其他靶点，但我们的结果支持以下结论：这种微管解聚活性足以触发细胞周期阻滞和细胞凋亡。最后，我们证明了化合物 42 在人类非癌细胞中的细胞毒性与参考化合物相比，并且其在静止期外周血淋巴细胞 (PBL) 中的细胞毒性远低于 isoCA-4。[2] |
| 分子式 |
C18H20O5
|
|---|---|
| 分子量 |
316.348405838013
|
| 精确质量 |
316.131
|
| 元素分析 |
C, 68.34; H, 6.37; O, 25.29
|
| CAS号 |
1067880-31-2
|
| PubChem CID |
24996163
|
| 外观&性状 |
Typically exists as solid at room temperature
|
| LogP |
4.1
|
| tPSA |
57.2
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
1
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
5
|
| 可旋转键数目(RBC) |
6
|
| 重原子数目 |
23
|
| 分子复杂度/Complexity |
372
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
|
| SMILES |
COC1=C(C=C(C=C1)C(=C)C2=CC(=C(C(=C2)OC)OC)OC)O
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| InChi Key |
CNGKIRSNRQSORA-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C18H20O5/c1-11(12-6-7-15(20-2)14(19)8-12)13-9-16(21-3)18(23-5)17(10-13)22-4/h6-10,19H,1H2,2-5H3
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| 化学名 |
2-Methoxy-5-[1-(3,4,5-trimethoxyphenyl)ethenyl]-phenol
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| 别名 |
isoCA-4; Isocombretastatin A4; isoCA-4; Isocombretastatin A4; 1067880-31-2; 2-methoxy-5-[1-(3,4,5-trimethoxyphenyl)ethenyl]phenol; 2-Methoxy-5-[1-(3,4,5-trimethoxyphenyl)ethenyl]-phenol; CHEMBL498271; SCHEMBL12635489; Isocombretastatin A-4; Isocombretastatin A 4
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 3.1611 mL | 15.8053 mL | 31.6106 mL | |
| 5 mM | 0.6322 mL | 3.1611 mL | 6.3221 mL | |
| 10 mM | 0.3161 mL | 1.5805 mL | 3.1611 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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