K252c   中文名称: 孢菌素甙元

PKC; staurosporine analog

蛋白激酶抑制剂的抗病毒活性[3]
我们研究了不同的蛋白激酶抑制剂（PKIs）对HCMV的抗病毒作用。所用PKI的结构如图1所示。使用三种HCMV毒株通过焦点还原试验测试PKI的抗病毒活性。结果列于表1中。吲哚咔唑衍生物K252a、K252c和Gö6976对HCMV实验室菌株AD169表现出明显的抗病毒作用，IC50值在纳摩尔范围内，明显低于GCV的IC50。相比之下，丝氨酸/苏氨酸激酶的其他抑制剂Gö6850（双吲哚马来酰亚胺I）、异喹诺酮磺酰胺H-7和roscovitine（细胞周期蛋白依赖性激酶cdk2a的强抑制剂）显示出较弱的抗病毒活性，IC50值在微摩尔范围内。同样，酪氨酸激酶的氧黄酮抑制剂（genisteine、槲皮素）仅提供微弱的抗病毒活性。Gö6976、K252a和K252c也被证明对HCMV患者分离株（A6245）和含有氨基酸交换H520-Q的GCV抗性菌株（HCMV-6）有效（Hanson等人，1995）。与AD169的相应值相比，这些菌株的IC50值在两倍范围内仅显示出微小差异。为了测试有效吲哚咔唑的病毒选择性，我们还对单纯疱疹病毒进行了抑制试验。然而，没有观察到抗病毒作用（表1）。这些数据表明，Gö6976、K252a和K252c是HCMV复制的强效特异性抑制剂。在另一系列实验中，我们通过测定药物作用下病毒产量的减少来研究吲哚咔唑的抗病毒活性。Gö6976和K252c以剂量依赖的方式将感染MOI为1或更高的细胞培养物的病毒产量降低了至少三个数量级（图2），但并没有完全消除病毒复制。只有K252a在浓度>500 nM时完全丧失了病毒产量。使用其他PKI没有实现病毒产量的降低。 此外，我们还确定了PKI对增殖HEL细胞的抑制作用。为此，HEL细胞以低密度（2000个细胞/0.28 cm2孔）接种，并在PKI存在下增殖5天。结果也总结在表2中，表明与细胞毒性相比，PKI具有更明显的抗增殖作用。使用吲哚咔唑Gö6976和K252c，融合细胞和增殖细胞的CC50比抑制HCMV复制所需的相应剂量高20-200倍，表明这些化合物的治疗指数是合理的。对于K252a，观察到的细胞毒性也是中等的，然而，K252a在剂量>500 nM时表现出明显的抗增殖作用。这一结果也可能解释了在高浓度范围内观察到的HCMV复制的完全消除。由于已经表明，罗斯科维汀对cdk2的抑制导致HCMV复制的完全抑制（Bresnahan等人，1997），因此似乎可以合理地假设K252a的作用至少部分是由与细胞激酶的相互作用引起的，从而导致处理细胞中的细胞周期停滞。

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蛋白激酶抑制剂对HCMV编码蛋白激酶pUL97[3]的影响
由于HCMV编码功能性蛋白激酶pUL97，我们研究了PKI对该酶的影响。我们之前已经证明，重组痘苗病毒（rVV）中人巨细胞病毒UL97蛋白的表达是研究所有已知pUL97功能的合适系统，如pUL97依赖性自磷酸化和pUL97依存性GCV磷酸化（Michel等人，1998）。此外，rVV的使用允许在没有其他HCMV基因产物的情况下分析pUL97的功能。为了确定PKIs对pUL97功能的细胞内抑制作用，我们研究了不同PKIs对rVV感染细胞中pUL97依赖性GCV磷酸化的影响。pUL97依赖性GCV磷酸化被所有测试的吲哚咔唑强烈抑制（Gö6976，K252a，K252c），而丝氨酸/苏氨酸激酶的另一种抑制剂双吲哚马来酰亚胺I（Gö6850）显示出较弱的抑制作用。其他PKI不能抑制GCV磷酸化。表4总结了PKI抑制pUL97依赖性GCV磷酸化的IC50值。PKIs对pUL97依赖性GCV磷酸化的抑制具有强烈的剂量依赖性（图3（A））。为了排除PKI对本试验中pUL97定量表达的任何影响，每次抑制实验都伴随着蛋白质印迹分析，以监测pUL97的表达。使用吲哚咔唑Gö6976、K252a和K252c，未检测到对pUL97表达的影响（图3（B））。有趣的是，吲哚咔唑浓度的增加导致pUL97电泳迁移率的变化，最终出现迁移速度稍快的pUL97条带。这些结果与Michel等人（1999）报告的数据一致，他们在表达自磷酸化缺陷的UL97突变体时观察到pUL97电泳模式的类似差异。此外，van Zeijl等人（1997）已经证明，去磷酸化形式的pUL97在SDS凝胶中的迁移速度略快于磷酸化pUL97。总之，我们推测pUL97电泳模式的剂量依赖性差异可能反映了pUL97自磷酸化的细胞内抑制。因此，我们研究了PKIs对体外pUL97自磷酸化的影响。通过磷酸成像定量测定了pUL97自磷酸化的抑制作用，PKI对pUL97自身磷酸化的影响也总结在表4中。与pUL97依赖性GCV磷酸化类似，所有测试的吲哚咔唑（Gö6976、K252a、K252c）都是pUL97自磷酸化的强抑制剂，呈剂量依赖性。然而，应该指出的是，体外对pUL97自磷酸化的抑制似乎比上述电泳迁移率差异所预期的要强烈得多。因此，我们不能排除存在其他因素影响PKI和pUL97的细胞内相互作用。

酶测定。[4]
测试激酶抑制剂对β-内酰胺酶、α-胰凝乳蛋白酶和MDH的抑制作用。除非另有说明，否则在25°C下，在pH 7.0的50 mM磷酸钾（KPi）缓冲液中进行测定。抑制剂的储备通常在二甲亚砜（DMSO）中以10mM的浓度制备。在任何测定中，DMSO的含量均不超过5%，并控制了DMSO的影响。在HP8453分光光度计上监测所有反应。
对于大多数β-内酰胺酶检测，抑制剂和1 nM酶孵育5分钟，用200μM硝基头孢引发反应。硝基头孢在DMSO中制备为20mM储备。对于不孵育的β-内酰胺酶测定，将抑制剂和200μM硝基头孢混合，用1 nM酶引发反应。对于β-内酰胺酶增加10倍的检测，将抑制剂和10 nM酶孵育5分钟，用100μM头孢噻吩G酯引发反应。在265nm处监测头孢噻吩G酯的水解，在482nm处监测硝基头孢烯的水解。
对于胰凝乳蛋白酶测定，抑制剂和28 nM酶孵育5分钟，用200μM琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺引发反应。琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺在DMSO中制备为20mM储备。在410nm处监测反应进展。对于MDH测定，抑制剂和2 nM酶孵育5分钟，用200μM草酰乙酸和200μM NADH引发反应；在340nm处监测进展。在50mM KPi缓冲液中分别制备了29-草酰乙酸和NADH作为20mM储备，NADH储备含有2mM DTT。
使用PanVera Z'-lyteβ试剂盒和ISS的PC1荧光计测试了五种先前显示为混杂酶抑制剂的化合物15对Abl1激酶的抑制作用（表4）。将抑制剂溶解在DMSO中至10mM。将1.2 nM Abl1激酶与2μM肽底物混合，然后与抑制剂一起孵育5分钟。反应由10μM ATP引发。1小时后，加入440nM胰凝乳蛋白酶以裂解未磷酸化的肽。该肽含有香豆素标记（FRET供体）和荧光素标记（FRET受体）。这些标记之间的FRET被蛋白水解破坏，而磷酸化肽在400nm激发后没有被切割并保留FRET。30未磷酸化肽与磷酸化肽的比率计算为香豆素发射（445 nm）与荧光素发射（520 nm）的比率。30发射和激发带宽为8 nm。所有孵育和反应都在室温下进行，没有反应混合物含有超过5%的DMSO。

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动态光散射（DLS）。[4]
化合物通常溶解在DMSO中至10mM，并用过滤的50mM KPi稀释。使用Brookhaven Instrument Corporation的光学系统，在514.4nm下用3W氩离子激光器分析所有化合物。大多数化合物在没有潜伏期的情况下进行了分析；槲皮素在室温下孵育30分钟，在此期间散射强度增加。所有实验的激光功率和积分时间都是可比的。平均粒径的计算是通过400通道BI9000AT数字自相关器的累积量分析工具进行的，最后八个通道用于基线计算。探测器角度为90°。每个直径和强度值代表25°C下的四个或更多独立测量值。

细胞活力和增殖分析[2]
使用中性红细胞毒性试验测定PKI的细胞毒性。简而言之，在MEM中制备相应药物的连续两倍稀释液，并将100μl稀释的药物加入96孔微量滴定板中的融合HEL细胞中。在药物存在下，将平板在37°C下孵育5天后，取出MEM，用400μl PBS洗涤细胞，用100μl 0.1%中性红PBS孵育3小时。去除染料溶液，用400μl PBS再次洗涤细胞。为了提取染料，加入200μl含有50%甲醇和1%乙酸的溶液，并在室温下孵育15分钟。使用ELISA读数器在550nm的波长和690nm的参考波长下测定中性红色染料的OD。通过回归分析计算CC50。为了分析细胞增殖，以2×103个细胞/孔的密度接种细胞。允许细胞粘附，并精确地如上所述确定活细胞的数量。

[1]. Structure-activity relationships in a series of substituted indolocarbazoles: Topoisomerase I and protein kinase C inhibition and antitumoral and antimicrobial properties J. Med. Chem. 39(22), 4471-4477 (1996).

[2]. Two indolocarbazole alkaloids with apoptosis activity from a marine-derived actinomycete Z2039-2 Arch. Pharm. Res. 30(3), 270-274 (2007).

[3]. Indolocarbazoles exhibit strong antiviral activity against human cytomegalovirus and are potent inhibitors of the pUL97 protein kinase Antiviral Res. 48(1), 49-60 (2000).

[4]. Kinase inhibitors: Not just for kinases anymore Journal of Medicinal Chemistry 46, 1478-1483 (2003).

K252c 是一种吲哚咔唑类化合物。
据报道，6,7,12,13-四氢-5H-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5-酮存在于诺卡氏菌属、长孢链霉菌属以及其他有相关数据的生物体中。

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合成了一系列与星形孢菌素、瑞贝卡霉素及其相应苷元结构相关的化合物，并测试了它们对蛋白激酶C和拓扑异构酶I、II的活性，以及它们对小鼠B16黑色素瘤细胞和P388白血病细胞的体外抗肿瘤活性。我们还检测了这些化合物对革兰氏阴性菌（大肠杆菌）、酵母菌（白色念珠菌）和三种革兰氏阳性菌（蜡样芽孢杆菌、沙特尔链霉菌和灰色链霉菌）的抗菌活性。为了避免蛋白激酶C抑制剂常见的副作用，我们在马来酰亚胺氮原子上引入取代基，和/或在与吲哚氮原子相连的糖基上引入取代基，从而获得对拓扑异构酶I具有特异性且对蛋白激酶C活性极低的抑制剂。正如预期的那样，这些化合物对拓扑异构酶II的抑制效果不佳，其中一些化合物对拓扑异构酶I表现出很强的活性。通常，脱氯化合物对纯化的拓扑异构酶I和蛋白激酶C的活性均高于氯代类似物。然而，在细胞增殖抑制试验中却得到了相反的结果。这些结果表明，在缺乏氯残留或细胞内碳-氯键断裂的情况下，细胞膜通透性不足。[1]

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对海洋来源放线菌Z(2)039-2发酵液的乙酸乙酯提取物进行生物活性导向分级分离，分离得到两种已知的吲哚咔唑生物碱，K252c (1) 和 arcyriaflavin A (2)。化合物1和2对K562细胞系表现出中等的细胞毒活性，分别在10 μM和100 μM浓度下诱导细胞凋亡。这是关于吲哚咔唑生物碱对K562癌细胞具有显著凋亡诱导作用的首篇报道。[2]我们分析了一系列蛋白激酶抑制剂（PKI），发现某些吲哚咔唑类化合物（Gö6976、K252a、K252c）对GCV敏感和耐药的人巨细胞病毒（HCMV）毒株具有高效的抑制作用，但对单纯疱疹病毒无效。抗病毒活性通过病灶减少试验测定（IC50范围为0.009至0.4 μM）。其他丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂（Gö6850、H-7、roscovitine）则无效。纳摩尔浓度的吲哚咔唑类化合物可使感染后5天的病毒产量降低三个数量级。这些化合物在感染后24小时内添加时完全有效，但在感染后72小时内活性降低。在增殖细胞和非增殖细胞中进行的细胞毒性试验表明，这些化合物的有效抗病毒浓度显著低于抗增殖剂量（IC₅₀/CC₅₀范围为6.5至390）或细胞毒性剂量（IC₅₀/CC₅₀范围为72.5至1000）。使用重组痘苗病毒研究了PKI对病毒编码蛋白激酶pUL97的影响。吲哚咔唑类化合物强烈抑制pUL97的自身磷酸化（IC₅₀范围为0.0012至0.013 μM）和pUL97依赖的更昔洛韦磷酸化（IC₅₀范围为0.05至0.26 μM）。其他丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂对pUL97的这些功能仅表现出微弱（Gö6850）或无影响（H-7、roscovitine），而氧代黄酮酪氨酸激酶抑制剂则完全无效。[3]激酶抑制剂广泛用作生物试剂和药物设计的先导化合物。然而，由于其缺乏特异性，它们的应用常常受到限制。虽然结合保守的ATP位点可以解释其部分非特异性，但有些化合物会抑制已知不与ATP结合的蛋白质。研究发现，高通量筛选得到的非特异性化合物可能以聚集体的形式发挥作用。为了探究这种机制是否可以解释广泛使用的非特异性激酶抑制剂的作用，我们研究了15种此类化合物。这八种化合物，即罗特林、槲皮素、K252c、双吲哚基马来酰亚胺I、双吲哚基马来酰亚胺IX、U0126、靛玉红和靛蓝，能够抑制三种不同的非激酶。抑制作用具有时间依赖性，且对酶浓度敏感；通过光散射实验，这些化合物形成直径为100-1000 nm的颗粒。这些观察结果表明，这八种激酶抑制剂至少在微摩尔浓度下具有非特异性，并以聚集体的形式发挥作用。因此，应谨慎解读使用这些化合物在微摩尔或更高浓度下对特定酶的抑制结果。

C20H13N3O

311.336724042892

311.106

C, 77.16; H, 4.21; N, 13.50; O, 5.14

85753-43-1

3815

White to off-white solid powder

4.527

60.68

3

1

0

24

551

0

O=C1C2C3=C(C4=C(C=2CN1)C1C(=CC=CC=1)N4)NC1C3=CC=CC=1

MEXUTNIFSHFQRG-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H13N3O/c24-20-17-12(9-21-20)15-10-5-1-3-7-13(10)22-18(15)19-16(17)11-6-2-4-8-14(11)23-19/h1-8,22-23H,9H2,(H,21,24)

3,13,23-triazahexacyclo[14.7.0.02,10.04,9.011,15.017,22]tricosa-1,4,6,8,10,15,17,19,21-nonaen-12-one

SD 1825; K-252c; K252C; 632-917-2; 85753-43-1; Staurosporine aglycone; staurosporinone; 6,7,12,13-tetrahydro-5H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5-one; HAJ5XS5HPF; K252c; staurosporine aglycone

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。