M-31850

human HexA (IC50 = 6.0 µM); human HexB (IC50 = 3.1 µM); OfHex2 (Ki = 2.5 μM)

M-31850 对褶皱链霉菌 (SpHex) 和 Jack Bean Hex (JBHex) 表现出一定的活性（SpHex 和 JBHex 的 IC50 值分别 >500 μM 和 280 μM）[1]。 M-31850会导致经过缺陷处理的新生儿桑德霍夫病 (ISD) 细胞表现出经过 Mug 处理的细胞（Hex S 水平）的增加 [1]。与 DMSO 的存在相比，M-31850 在 44°C 下使 Tay-Sachs (ATSD) 细胞中突变 Hex A 的半衰期延长三倍以上。 M-31850是Hex的传统竞技倍数（Km上升，M-31850上升但不影响Vmax）； Ki 0.8 μM [1]。

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为了最终证明经抑制剂处理的细胞溶酶体中Hex A水平升高，用DMSO和经M-31850处理的成纤维细胞制备了富含溶酶体的组分（图4c）。这种方法以前曾用于在用铁葡聚糖胶体标记成纤维细胞后，通过磁色谱分离ER耗竭的溶酶体部分。溶酶体组分中的Hex（MUGS）和酸性磷酸酶（MUP）比活性增加了约十倍。更重要的是，核后上清液和溶酶体富集组分中的MUGS活性都增加了三倍，这与溶酶体中处理细胞中Hex A水平升高的假设一致。M-31850处理细胞的两个组分中溶酶体酸性磷酸酶的活性均未受到显著影响。成纤维细胞不合成显著水平的高级神经节苷脂，例如GM1神经节苷脂。因此，本研究中使用的ATSD和ASD细胞不储存可观量的GM2神经节苷脂。然而，我们的数据强烈暗示，合成更高神经节苷脂的患者细胞，即神经元，将从M-31850治疗中受益。[1]

这些结果验证了通过首先对Hex抑制性化合物进行HTS来鉴定新型PC的方法。已鉴定出的最强抑制剂M-22971、M-31850和M-45373是新颖的，在结构上与已知的人类Hex抑制剂不同，其中大多数是氮杂糖，例如亚氨基环醇衍生物。这些HTS衍生的抑制剂可以作为新的、更像药物的框架，可以使用高通量组合化学进一步优化。这种方法可以应用于萘酰亚胺衍生物，因为它们可以通过简单的单步方案很容易地合成。

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研究化合物M-31850作为Hex a[1]的PC的作用机制
对双萘二酰亚胺化合物M-31850的结合机制进行了更详细的研究，因为：；1）在所检测的HTS化合物的最低浓度下，它在细胞中具有活性，2）几种萘酰亚胺衍生物、Elinafide（LU79533）和阿司他丁已被评估或批准用于人体，3）和其他萘酰亚胺同系物可以很容易地合成。为了确认M31850以类似于NGT的方式作为PC发挥作用，即它在活性位点（或附近）结合并能够提高酶的稳定性，分析了该化合物对酶动力学和热变性的影响。与在DMSO存在下加热的酶相比，M-31850在44°C下将ATSD细胞中突变的Hex A的半衰期增加了两倍多（图4a）。它是Hex的经典竞争性抑制剂（Km增加，Vmax不受M-31850增加量的影响），Ki为0.8±0.1μM（图4b）。

来自二次筛选的所有单萘酰亚胺衍生物M-31860、M-31862和M-31867（表1和表3）的IC50值至少比双萘酰亚胺M-31850高100倍（表3）。所有这些衍生物都含有一个小的疏水基团，通过一个缺少仲胺的短烷基链与下面的萘酰亚胺N-连接。同样，单萘二酰亚胺BTB12933和5141402的抑制活性降低进一步强调了第二萘二酰胺部分的重要性。

仲胺基团在桥接两个萘酰亚胺部分的接头中的关键作用得到了强调，当它被化合物7916963中类似位置的醚键取代时，所有抑制活性都丧失了。该化合物的行为表明，M-31850中的仲胺可能与Hex a中未鉴定的残基形成氢键。尽管减少了十多倍，但化合物5141402的抑制活性表明，类似位置的羟基可以提供必要的氢原子。N-烷基胺接头对单萘二甲酰亚胺和双萘二甲酰胺衍生物5141402和M-31850的抑制活性的重要性让人想起最近描述的带有N-烷基胺部分的基于亚氨基环醇的Hex抑制剂。

化合物5141402的抑制活性减弱，缺乏第二萘酰亚胺，这表明它可能提供对高亲和力结合很重要的额外疏水接触。令人惊讶的是，LU79553的抑制活性降低了约8倍，因为它带有两个萘酰亚胺基团，胺在连接体中相对于萘酰亚胺基的位置与M-31850中的位置相同。这表明，为了有效地结合Hex A，两个萘酰亚胺基团必须适当间隔。Hex A中的第二个活性位点不是结合M-31850中第二个萘酰胺基团的位点的候选者，因为测量的两个活性位点之间的距离是M-31850中烷基胺连接体大小的2.5倍以上。然而，在Hex A的任一活性位点之外提出的疏水性苷元袋仍然是可能的候选者。

根据表2中萘酰亚胺衍生物的抑制活性，以及M-31850是一种竞争性抑制剂的事实，提出了以下结合模型。其中一个萘酰亚胺基团直接结合在Hex A的底物结合袋中，而第二个萘酰胺部分结合到次级疏水贴片，例如苷元结合位点。两个萘酰亚胺基团之间需要适当大小的连接体来跨越这两个位点，并且还必须能够与Hex a表面上的酸性受体残基形成稳定的氢键。

对化合物M-31850进行了更详细的评估，部分原因是它与LU79553（Elinafide）非常相似，LU79553之前因其DNA嵌入能力和对拓扑异构酶I的抑制活性而在I期临床试验中被评估为实体瘤化疗药物。尽管Elinafides因其治疗剂量的毒性而没有在临床试验中进一步进行，但这些结果表明，使用抑制性化合物作为种子在试验或FDA批准的药物中进行鉴定是有用的。由于HTS筛查的目标是识别更多类似药物的PC，因此Elinafide等化合物有望加快治疗ATSD的治疗方法的开发。

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萘酰亚胺M-31850与OfHex2结合的对称二元体机制[2]
抑制活性测试表明，M-31850是一种针对OfHex2的竞争性抑制剂，Ki值为2.5μM。然而，低LE值（0.21）表明M-31850与OfHex2之间的结合不够有效。为了研究M-31850与OfHex2相互作用的机制，使用HsHex作为模板，使用OfHex2的同源模型结构进行分子对接。分子对接研究表明，M-31850的一个萘酰亚胺基团位于活性口袋中，连接体中的仲胺与残基E345的侧链形成氢键。第二组萘酰亚胺在狭窄的外袋区堆积不良。如图2所示，第二萘酰亚胺基萘的酰亚胺环和一个芳环在口袋外位置与残基H285的咪唑基以约35°的二面角堆叠，而萘基的另一个芳基远离口袋外位置。口袋外位点的结合效率低下可能是由于萘酰亚胺基团过大或仲胺和第二萘酰亚胺基之间的连接体缺乏灵活性造成的。因此，第二萘酰亚胺基团最好被较小的基团取代，并通过适当长度的N-烷基胺连接体共轭。

对于化合物的一级和二级筛选，如上所述，在Analyst HT荧光计上连续监测酶活性。使用一系列MUG底物（1.6 mM–0.003 mM）和酶浓度（1–0.01 mg/ml）建立稳态动力学参数。除了在405nm处测量吸光度外，使用比色底物pNP-GlcNAc和MUG终点测定所述的条件也证实了MU发射最大值附近荧光（M-31850和衍生物）或淬灭（M-22971）的化合物的抑制活性。[1]

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右旋糖酐铁标记溶酶体的纯化[1]
溶酶体组分由经DMSO或M-31850（1 mM）处理五天的ATSD成纤维细胞制备，然后用右旋糖酐铁胶体标记，随后如前所述通过磁色谱法纯化。如所述，分别使用底物MUP和MUGS对溶酶体、酸性磷酸酯酶和Hex A进行荧光监测。

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抑制活性和配体效率分析[2]
昆虫GH20酶OfHex2是按照Liu等人的描述制备的。粘质沙雷氏菌的细菌己糖胺酶和另一种昆虫己糖酰胺酶OfHex1是按照Liu等的描述制得的。绿色木霉、剑麻和智人的GH20己糖胺酶类购自Sigma-Aldrich。使用人工底物pNP-GlcNAc评估所有合成的化合物对己糖胺酶的抑制活性。在Britton-Robinson缓冲液（OfHex2，pH 6.0；OfHex1、TvHex和SmHex，pH 7.0；HsHex和CeHex，pH4.5）、终浓度为20%的乙醇、酶、化合物和pNP-GlcNAc的存在下，在25°C下将测定成分在最终体积为60μl的环境中孵育30分钟。然后加入60μl 0.5M Na2CO3溶液停止酶反应。通过Dixon图，在恒定浓度（0.2和0.5 mM）的底物下改变化合物的浓度，获得抑制常数（Ki[μM]）。配体效率值计算如下：LE=-1.35 log（Ki）/N，其中N是重原子的数量。

[1]. High-throughput screening for human lysosomal beta-N-Acetyl hexosaminidase inhibitors acting as pharmacological chaperones. Chem Biol. 2007 Feb;14(2):153-64.
[2]. Exploring unsymmetrical dyads as efficient inhibitors against the insect β-N-acetyl-D-hexosaminidase OfHex2. Biochimie. 2014 Feb;97:152-62.

泰-萨克斯病和桑德霍夫病的成人型是由于β-己糖胺酶A (Hex) 活性低于正常水平的约10%所致，这是由于不稳定的突变酶向溶酶体的转运减少所致。Hex的碳水化合物类竞争性抑制剂在患者细胞中发挥药理学伴侣(PC)的作用，促进酶从内质网转运，从而使溶酶体中突变Hex蛋白的含量和活性提高3至6倍。为了筛选具有药物潜力的PC候选物，我们开发了一种基于荧光的实时酶活性检测方法，并筛选了Maybridge公司包含50,000种化合物的化合物库，以寻找纯化Hex的抑制剂。三种结构不同的微摩尔级竞争性抑制剂，即双萘酰亚胺、硝基茚满-1-酮和吡咯并[3,4-d]哒嗪-1-酮，被鉴定出来，它们能特异性地提高患者成纤维细胞中溶酶体Hex蛋白的含量和活性。这些结果验证了筛选抑制剂化合物作为鉴定PC（潜在致病因素）的一种方法。[1]

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来自玉米螟(Ostrinia furnacalis (Guenée))的GH20 β-N-乙酰-D-己糖胺酶OfHex2是开发环保型杀虫剂的潜在靶标。尽管碳水化合物类β-N-乙酰-D-己糖胺酶抑制剂已被广泛研究，但由于成本低廉且易于合成，高效的非碳水化合物抑制剂更具吸引力。基于OfHex2催化结构域的分子建模分析，我们设计并评估了一系列新型萘酰亚胺骨架化合物，这些化合物通过烷基胺间隔基与小芳香基团连接，并作为OfHex2的高效竞争性抑制剂。其中活性最强的化合物含有萘酰亚胺和苯基，并通过N-烷基胺连接基连接，其Ki值为0.37 μM，比目前报道的最强效的非碳水化合物抑制剂M-31850低6倍。本文中简便的合成方法以及推测的结合模型，有利于进一步的结构优化，从而开发针对GH20 β-N-乙酰-D-己糖胺酶的抑制剂。[2] 由于HsHex活性口袋的残基在OfHex2中保守，我们推测萘酰亚胺衍生物可能作为OfHex2的抑制剂。对M-31850与OfHex2的结合亲和力分析证实，M-31850是OfHex2的竞争性抑制剂。配体效率（LE）值结合了结合自由能和重原子数量，是指导化合物优化的重要指标。M-31850的LE值较低，表明其效率仍有提升空间。分子对接研究表明，M-31850效率低是由于萘酰亚胺基团过大，与口袋外侧的小疏水腔（称为外口袋位点）结合所致。因此，提高外口袋位点的结合效率可能是提高抑制剂结合亲和力的途径之一。
为了提高配体效率，我们合成了一系列新型衍生物，用小芳环取代M-31850中的一个萘酰亚胺基团，得到新的不对称二元体。为了提高活性口袋外结合基团的结合亲和力，我们对芳香环的大小和连接基团的长度进行了优化。酶学测试和效率分析表明，这些新型非对称二元体是OfHex2的竞争性抑制剂，与M-31850相比，它们具有更高的配体效率和更好的抑制活性。结构-活性关系分析和分子对接研究构建了这些抑制剂与OfHex2的结合模型。色氨酸荧光测定表明，萘酰亚胺与活性口袋中色氨酸残基之间的堆积相互作用增强了竞争性抑制作用。[2]

C28H21N3O4

463.493

463.153

C, 72.56; H, 4.57; N, 9.07; O, 13.81

281224-40-6

281224-40-6

342139

Typically exists as solid at room temperature

1.4±0.1 g/cm3

715.0±45.0 °C at 760 mmHg

386.2±28.7 °C

0.0±2.3 mmHg at 25°C

1.729

2.12

86.8

1

5

6

35

759

0

O=C1C2=C([H])C([H])=C([H])C3C([H])=C([H])C([H])=C(C(N1C([H])([H])C([H])([H])N([H])C([H])([H])C([H])([H])N1C(C4=C([H])C([H])=C([H])C5C([H])=C([H])C([H])=C(C1=O)C4=5)=O)=O)C2=3

UPLUIYHKSADQOZ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C28H21N3O4/c32-25-19-9-1-5-17-6-2-10-20(23(17)19)26(33)30(25)15-13-29-14-16-31-27(34)21-11-3-7-18-8-4-12-22(24(18)21)28(31)35/h1-12,29H,13-16H2

2,2'-(azanediylbis(ethane-2,1-diyl))bis(1H-benzo[de]isoquinoline-1,3(2H)-dione)

M 31850; M31850; 281224-40-6; M-31850; 2,2'-(Azanediylbis(ethane-2,1-diyl))bis(1H-benzo[de]isoquinoline-1,3(2H)-dione); NSC377607; 2-(2-{[2-(1,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-benzo[de]isoquinolin-2-yl)ethyl]amino}ethyl)-2,3-dihydro-1H-benzo[de]isoquinoline-1,3-dione; 2-[2-[2-(1,3-dioxobenzo[de]isoquinolin-2-yl)ethylamino]ethyl]benzo[de]isoquinoline-1,3-dione; CHEMBL2333316; SCHEMBL4408773; M-31850

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~5 mg/mL (~10.79 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。