MG-262

Proteasome

蛋白酶体抑制剂抗血管生成作用的机制尚不清楚。在这里，我们报道了在发育中的鸡眼胶（由内皮细胞、周细胞和巨噬细胞组成的血管器官）的外植体培养中，可逆蛋白酶体抑制剂MG-262下调VEGF受体Flt-1（血管内皮生长因子受体1）的基因表达。此外，该抑制剂可阻止脂多糖（LPS）在巨噬细胞中诱导Flt-1，并下调LPS诱导后Flt-1的表达。MG-262也能下调人微血管内皮细胞中Flt-1基因的表达。有趣的是，编码具有抗血管生成特性的受体可溶性形式（sFlt-1）的Flt-1的转录本没有在相同程度上下调。在抑制蛋白酶体的作用下，眼膜中VEGF和Ang-2的表达略有下降，而其他血管生成分子如KDR或Ang-1的表达未见明显变化。由于最近的实验已经证明了抗Flt-1治疗在抑制肿瘤血管生成、视网膜血管生成、关节炎和动脉粥样硬化中的重要性（Luttun等[2002]:Nat Med 8:831-840），我们观察到MG262在微血管内皮细胞和巨噬细胞中下调Flt-1，这支持了蛋白酶体抑制剂作为血管生成和炎症治疗调节的潜在候选物的假设作用。[1]

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蛋白酶体抑制剂增加IL-8和AP-1荧光素酶活性[2]
为了确定蛋白酶体抑制剂对IL-8表达的基因调控作用，我们对四种蛋白酶体抑制剂MG132、aLLN、lactacystin和MG-262进行了报告基因检测。如图1所示，这四种蛋白酶体抑制剂以浓度依赖的方式增加IL-8启动子活性。MG-262是在0.1 nM-1 μM范围内实现IL-8刺激的最有效蛋白酶体抑制剂。而MG132和lactacystin在0.1 ~ 50 μM范围内的效价中等且相当。在测试的蛋白酶体抑制剂中，aLLN是刺激IL-8反应最弱的一种。MG-262， MG132和lactacystin分别为50 μM和50 μM，在最高浓度下的增产效果约为12 - 14倍，而aLLN为50 μM时的增产效果约为8倍。在这些浓度下，未见细胞毒性。然而，根据MTT试验的评估，将MG132、乳酸菌素和aLLN的浓度增加到100 μM会在24小时内导致细胞毒性（数据未显示）。

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蛋白酶体抑制剂抑制细胞因子诱导的κB报告细胞活性[2]
为了验证这些蛋白酶体抑制剂对NF-κB转录的抑制作用，我们进行了κ b荧光素酶报告基因实验。结果显示，虽然基础条件下的κB荧光素酶活性不受MG132、aLLN、lacystin或MG-262的影响，但两种有效的NF-κB诱导细胞因子IL-1β (10 ng/ml)和肿瘤坏死因子α (TNF-α) （50 ng/ml）的刺激被蛋白酶体抑制剂的存在所拮抗（数据未显示）。MG132对细胞因子诱导的NF-κB活化的IC50值为0.1 ~ 0.3 μM， aLLN和lactacystin的IC50值为1 μM， MG262的IC50值为1 ~ 3 nM。

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蛋白酶体抑制剂的ros依赖性作用[2]
由于一些报道表明AP-1转录因子是ROS的靶标，我们接下来想要解决ROS在蛋白酶体抑制剂作用中的作用。解决这个问题的另一个原因是最近发现乳糖蛋白酶可以导致NT-2和SK-N-MC细胞系的显著氧化损伤。图3显示，当抗氧化剂NAC（3或10 mM）或GSH（5或30 mM）预处理15 min时，蛋白酶体抑制剂引起的IL-8和AP-1报告活性的增加程度明显减弱。这一结果提示ROS作为中介参与了蛋白酶体抑制剂诱导的信号通路。为了验证这一建议，我们使用荧光剂DCFH-DA测量细胞内ROS含量。当检测这些蛋白酶体抑制剂对IL-8和AP-1产生最大和类似刺激的浓度时（MG132、aLLN和lactacystin的浓度为10 μM，MG-262的浓度为0.1 μM），图4所示的结果表明，暴露于蛋白酶体抑制剂后，细胞内ROS的增加具有时间依赖性。在培养3 h内，MG132、lactacystin和MG-262对ROS产生的影响呈现双相特征，在5 min达到峰值，随后逐渐下降，在1 h左右重新诱导。5 min快速刺激的效果为MG-262>lactacystin>MG132, aLLN，而1 h时的效果为MG132>MG262, lactacystin>aLLN。当检测0.1 μM和1 μM的MG132、aLLN和lactacystin，以及0.01 μM的MG262时，5 min的ROS产量也增加了40-80%（数据未显示）。

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GA增强蛋白酶体抑制剂诱导的恶性细胞的细胞活力抑制[3]
为了验证我们的假设，并确定GA是否能使癌细胞对蛋白酶体抑制剂的治疗敏感，我们首先测试了不同浓度的单用藤黄酸对人类白血病K562和小鼠肝癌H22细胞活力的影响。结果显示，即使在最大剂量下，GA作为单一药物对两种细胞系的细胞活力的抑制作用也不到20%（图1B和C）。然而，当两种细胞系分别用不同剂量的蛋白酶体抑制剂MG262（含或不含0.4µM GA）处理48小时时，细胞活力的抑制作用显著增加，例如，用6.25 nM MG-262单独处理时，细胞活力的抑制作用从5%增加到与GA联合处理时的82% （K562细胞，图1D）。在相同的处理条件下处理H22细胞时，GA的加入使MG262对细胞活力/增殖的抑制作用从11%提高到73%（图1E）。GA还与另一种蛋白酶体抑制剂MG132在K562和H22细胞系中进行了组合试验，观察到类似的协同效应（图1F和G）。对联合指数（CI）进行分析，CI值均小于1 (CI < 1)，说明GA与蛋白酶体抑制剂在抑制癌细胞活力方面具有协同作用（图1H和图1）。

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GA能使恶性细胞对蛋白酶体抑制剂诱导的凋亡细胞死亡敏感[3]
我们和其他人已经报道了蛋白酶体活性的抑制，特别是乳糜蛋白酶样活性的抑制，与恶性细胞凋亡的诱导有关。为了确定GA是否对蛋白酶体抑制剂诱导的细胞凋亡有协同作用，在GA存在或不存在的情况下，用MG-262或MG132处理H22和K562细胞，然后用Annexin V凋亡实验进行流式细胞术分析。结果显示，这些恶性细胞，特别是K562细胞，联合处理显著增加了膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）染色细胞的数量（图2A和B），表明联合处理比单独处理诱导更多的细胞死亡。

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GA对蛋白酶体抑制剂诱导的细胞凋亡和抗肿瘤活性协同作用的潜在机制[3]
我们的体外和体内研究结果表明，GA和蛋白酶体抑制剂联合治疗可协同抑制恶性培养物和动物模型中生长的肿瘤细胞的生长。为了探索其中的潜在机制，我们用0.4µM GA、25 nM MG-262、不同浓度MG132作为单一药物或它们的组合（GA + MG132或GA + MG-262）处理K562细胞12或24小时，然后用Western分析测量caspase激活和PARP切割。经过12小时的处理，GA +任一蛋白酶体抑制剂，而不是单独的GA或蛋白酶体抑制剂，可以诱导PARP的裂解以及caspases 8和caspases 9的裂解/激活（图4A，左图）。在处理24小时的细胞中观察到类似的结果（图4A，右图）。这些发现表明GA能够通过caspase依赖途径增强蛋白酶体抑制剂诱导的细胞凋亡。

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原代细胞泛素/蛋白酶体系统的监测[5]
为了研究UbG76V-GFP转基因的功能，我们建立了来自不同组织的原代细胞培养物，并用不同类别的蛋白酶体抑制剂处理它们：(i)可逆肽醛抑制剂MG-132（参考文献34，ii）可逆肽硼酸盐抑制剂MG-262（参考文献35，iii）不可逆肽乙烯基磺酮抑制剂Z-L3-VS（参考文献36）和（iv）不可逆天然化合物抑制剂epoxomicin20。虽然肽硼酸盐和肽醛都是可逆抑制剂，但肽硼酸盐由于其较慢的解离速率而更有效。
UbG76V-GFP小鼠的原代成纤维细胞、心肌细胞和神经元对10 μM MG-132、0.5 μM MG-262、10 μM Z-L3-VS或0.5 μM环氧霉素的处理有反应，荧光显微镜观察到UbG76V-GFP报告基因明显积累（图2a，数据未显示）。UbG76V-GFP的积累在细胞质和细胞核中都很明显，后者的信号稍强。通过流式细胞术定量的GFP荧光发射显示，与未处理的对照组相比，0.5 μM环氧霉素处理的原代成纤维细胞增加了约10倍（图2b）。在用环氧霉素处理5小时后，已经可以观察到GFP荧光的适度增加，并在处理15小时后进一步增加到10倍（图2c）。MG-132、MG-262和环氧霉素抑制剂的滴定表明，UbG76V-GFP的积累是剂量依赖性的（图2d）。

监测体内泛素/蛋白酶体系统[5]
为了评估报告基因在体内的功能，我们给UbG76V-GFP/1小鼠腹腔注射抑制剂MG-132 （10 μmol/kg体重）、环氧霉素或MG-262（均为1 μmol/kg体重）或仅用载体（60%二甲亚砜（DMSO））。根据在原代培养和稳定转染体中观察到的荧光积累动力学31、38,20 h后处死动物，用荧光显微镜检查肝脏、肺、脑、胰腺、肾脏、脾脏和小肠。用环氧霉素和MG-262处理的小鼠肝脏中只检测到荧光细胞，而用MG-132和仅用载药处理的小鼠肝脏中未检测到荧光细胞（图3a）。用环氧霉素和MG-262处理的动物肝脏中检测到相似水平的荧光，但荧光细胞的分布明显不同。MG-262处理导致GFP在分布在整个肝脏的绝大多数肝细胞中积累，而在环氧霉素处理的动物中，荧光细胞主要分布在肝脏边缘和肝叶内的小范围内。中心位置的阳性细胞位于肝三联体周围，其中包含门静脉，而中心静脉周围区域的GFP呈阴性（图3b）。使用gfp特异性抗体的免疫组织化学也证实了门静脉周围细胞中更明显的UbG76V-GFP积累（图3c）。这种高度敏感的免疫染色证实了仅用载体处理的转基因小鼠肝三联体周围的肝细胞中完全没有UbG76V-GFP（图3d）。

对不同抑制剂处理的小鼠肝脏溶出物中蛋白酶体的凝乳胰蛋白酶样活性的分析证实了UbG76V-GFP荧光所显示的化合物对蛋白酶体作用的相对效力：MG-262注射后小鼠具有强抑制作用，注射环氧霉素后小鼠具有适度抑制作用，注射MG-132后无抑制作用（图4）。肾脏和脾脏裂解物中的蛋白酶体活性受到类似程度的抑制，尽管这些组织中的活性比肝脏中的活性更高，证实肝脏是腹腔注射蛋白酶体抑制剂后的主要效应部位。

在下一组实验中，给UbG76V-GFP/1小鼠注射1或5 μmol/kg体重MG-262。肝脏中可见明显的剂量依赖性GFP荧光增加（图5a，b）。此外，尽管低剂量的抑制剂不会引起小肠中GFP的积累（图5c），但在高剂量处理后检测到明亮的荧光（图5d）。在胰腺（数据未显示，图5e， 5 μmol/kg）和肾脏（数据未显示，图5f， 5 μmol/kg）中也观察到UbG76V-GFP的类似剂量依赖性积累，而在肺（图5g）和脾（图5h）中，只有一小部分细胞在较高浓度下呈荧光。在大脑、心脏和骨骼肌中没有检测到荧光细胞。在MG-262处理动物的肝脏、肾脏和脾脏的裂解物中观察到蛋白酶体的凝乳胰蛋白酶样活性呈剂量依赖性降低（图4）。有趣的是，在<强>MG-262处理的动物的肾脏和脾脏中观察到非常相似的抑制水平，尽管这些器官显示出不同程度的泛素/蛋白酶体系统功能损伤，与肾脏中报告蛋白的系统性积累相比，脾脏中只有少数受影响的细胞。值得注意的是，在高剂量MG-262治疗后，检测到明显的毒性迹象，包括体温过低、无反应性和体重减轻，而低剂量MG-262治疗没有明显的效果。

转染及报告基因测定[2]
转染实验中，将5×105 HEK293细胞接种到六孔板中。次日用磷酸钙沉淀法转染细胞。将DNA与33.4 μl 0.1×TE缓冲液，12.6 μl 1m CaCl2在每个孔中预混，然后与46 μl 2×Hanks '平衡盐溶液缓慢混合25 s。室温下将混合物孵育25分钟，加入每个孔中。孵育24小时后，转染完成，用指定浓度的蛋白酶体抑制剂孵育细胞。再孵育24小时后，取出培养基，用冷磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞一次。制备裂解液，每孔加入报告细胞裂解缓冲液100 μl，从培养皿中刮取细胞。在13000 rpm离心30 s后收集上清。等量细胞裂解液（5 μl），含等量蛋白质（10-20 μg），置于不透明黑色96孔微孔板的孔中。在所有样品中加入等体积的荧光素酶底物，在微孔板发光计中测量发光。将荧光素酶活性值归一化为共转染β-半乳糖苷酶表达载体监测的转染效率，并表示在存在每种蛋白酶体抑制剂的情况下，荧光素酶活性相对于没有刺激的对照细胞的活性所测得的百分比。

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流式细胞术检测ROS形成[2]
2 ',7 ' -二氯二氢荧光素二醋酸酯（DCFH-DA）作为细胞内活性氧（ROS）形成的指标。用DCFH-DA （50 μM）预处理细胞30 min，然后在不同时间段添加不同浓度的蛋白酶体抑制剂。一旦生成ROS， DCFH氧化产物，流式细胞仪检测DCF荧光。通过FL1-H计数来评估荧光，其平均值代表化合物诱导ROS形成的能力。

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MTS试验[3]
用MTS法测定化合物对细胞活力的影响。MTS四氮唑化合物被细胞生物还原成可溶于组织培养基的彩色甲酸产物。这种转化可能是由代谢活跃细胞中的NADPH或脱氢酶产生的NADH完成的。收集指数生长的细胞，以2500个/孔的速度在96孔板中播种。孵育6小时后，加入化合物或DMSO作为未处理的对照，连续孵育48小时。每孔中加入20微升MTS，继续孵育3小时。在490 nm处用酶标仪测量吸光度。抑制率（IR）(%) =[1 -（实验孔吸光度-空白孔吸光度）/（未处理对照孔吸光度-空白孔吸光度）]× 100%。

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流式细胞术检测细胞死亡[3]
凋亡细胞死亡采用Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）双染色，然后采用流式细胞术检测。简单地说，收集培养的K562和H22细胞，用冷PBS洗涤，用结合缓冲液重悬，然后在4°C下，Annexin V- FITC孵育15分钟，PI染色15分钟。30min内用流式细胞术分析染色细胞。

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细胞死亡的形态学特征[3]
K562或H22细胞按描述处理。为了监测活培养条件下细胞死亡发生率的时间变化，在细胞培养基中加入丙啶（PI），在所需的顺序时间点，用配备数码相机 的倒置荧光显微镜对培养皿中的细胞进行成像。PI不能进入正常活细胞，但垂死或死亡的细胞失去了细胞膜的完整性，PI可以进入细胞核，结合双链DNA，从而对垂死或死亡的细胞进行阳性染色。

荧光分析和冰冻切片的免疫组织化学染色。[5]
成年转基因小鼠腹腔注射200 μl载体（60% DMSO）或环氧霉素（Affinity）、MG-132（羧苄基亮氨酰亮氨酰亮氨醛）、MG-262和Z-L3-VS（羧苄基亮氨酰亮氨酰亮氨酸乙烯砜）。注射20小时后取出组织，用4%多聚甲醛固定过夜，然后浸入梯度蔗糖溶液中。免疫组织化学分析中，将10 μm厚的冰冻切片用4%多聚甲醛固定，并用3% H2O2处理30分钟。切片用山羊血清封闭，并在4℃下与多克隆抗GFP抗体孵育过夜。洗涤后，加入生物素标记的抗兔IgG二抗，于20℃孵育30分钟，然后将切片与亲和素-生物素-过氧化物酶复合物孵育30分钟，并用二氨基联苯胺染色。

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蛋白酶体活性测定。[5]
小鼠腹腔注射指定量的蛋白酶体抑制剂或DMSO，20小时后处死。将肝脏、肾脏和脾脏组织在含有50 mM Tris pH 7.5、5 mM MgCl2、1 mM二硫苏糖醇和250 mM蔗糖的缓冲液中匀浆，并在4℃下以14,000g离心10分钟。裂解液中的胰凝乳蛋白酶样活性通过荧光定量法测定荧光底物 suc-LLVY-AMC 的水解来确定，如前所述31。非蛋白酶体胰凝乳蛋白酶样活性通过在 1 μM MG-262 存在下测量 suc-LLVY-AMC 的水解来确定。

[1]. Down-regulation of Flt-1 gene expression by the proteasome inhibitor MG262. J Cell Biochem. 2003 Aug 15;89(6):1138-47.

[2]. Proteasome inhibitors stimulate activator protein-1 pathway via reactive oxygen species production. FEBS Lett. 2002 Aug 28;526(1-3):101-5.

[3]. Gambogic acid enhances proteasome inhibitor-induced anticancer activity. Cancer Lett. 2011 Feb 28;301(2):221-8.

[4]. A novel transgenic mouse model reveals deregulation of the ubiquitin-proteasome system in the heart by doxorubicin. FASEB J. 2005 Dec;19(14):2051-3.

[5]. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat Biotechnol. 2003 Aug;21(8):897-902.

本报告探讨了蛋白酶体抑制剂（MG132、aLLN、乳胞素和MG-262）对白细胞介素-8 (IL-8) 诱导的影响。在HEK293细胞中，蛋白酶体抑制剂可浓度依赖性地增加IL-8启动子和激活蛋白-1 (AP-1) 的活性，但抑制细胞因子诱导的核因子 (NF)-κB 活化。N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽、二苯碘鎓、鱼藤酮和抗霉素A可减弱蛋白酶体抑制剂对IL-8启动子和AP-1的刺激作用。使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯进行的荧光分析进一步证实了蛋白酶体抑制剂诱导活性氧 (ROS) 生成的能力。这些结果表明，蛋白酶体抑制剂产生的活性氧（ROS）会导致AP-1激活，即使在NF-κB未激活的情况下，AP-1仍能反式激活IL-8基因表达。[2]蛋白酶体抑制已成为一种新型的抗癌治疗方法。许多天然化合物，例如藤黄酸，已在体外和体内作为抗癌药物进行了测试，用于癌症的预防和治疗。然而，藤黄酸与蛋白酶体抑制剂联合治疗恶性细胞时是否具有化疗增敏作用仍不清楚。为了研究这种作用，我们用藤黄酸、蛋白酶体抑制剂（MG132或MG-262）或二者联合处理人白血病K562细胞、小鼠肝癌H22细胞和H22细胞同种异体移植瘤，然后检测细胞活力、凋亡诱导和肿瘤生长抑制情况。我们首次报道：(i) 天然产物藤黄酸与蛋白酶体抑制剂MG132或MG-262联用，在同种异体移植动物模型中对恶性细胞和肿瘤的生长具有协同抑制作用；(ii) 接受该联合治疗的动物未观察到明显的全身毒性。因此，本研究结果表明，天然产物藤黄酸是与蛋白酶体抑制剂联用的理想候选药物，代表了一种极具吸引力的抗癌策略。[3] 泛素-蛋白酶体系统 (UPS) 介导的蛋白水解负责降解大多数细胞蛋白，从而在维持细胞稳态和调节多种细胞功能方面发挥着至关重要的作用。UPS功能障碍与多种疾病的发病机制有关，包括神经退行性疾病、肌营养不良症和部分心肌病。然而，监测体内泛素-蛋白酶体系统（UPS）的功能变化仍然是一个挑战，这阻碍了对UPS病理生理机制的阐明。我们近期构建了一种新型转基因小鼠模型，该模型可普遍表达UPS的替代蛋白底物。本研究验证了该模型适用于监测几乎所有主要器官中UPS蛋白水解功能的体内变化。我们还建立了源自成年转基因小鼠的原代细胞培养模型，并测试了其在探究UPS参与发病机制方面的应用。应用这些新建立的体内和体外方法，我们在本研究中证实，阿霉素可增强心脏和培养的心肌细胞中的UPS功能，提示UPS功能亢进可能在阿霉素治疗的急性心脏毒性中发挥重要作用。[4]

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泛素/蛋白酶体系统的功能障碍被认为在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病中发挥作用。尽管近期研究证实某些疾病相关蛋白会阻断蛋白酶体降解，且目前已存在多种疾病的优秀动物模型，但关于该系统的体内数据仍然匮乏。我们构建了一种用于体内分析泛素/蛋白酶体系统的模型，方法是构建携带组成型活性降解信号的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的转基因小鼠品系。向转基因小鼠施用蛋白酶体抑制剂后，多种组织中GFP显著积累，证实了该报告基因的体内功能。此外，UBB+1（一种在阿尔茨海默病中发现的异常泛素）可诱导原代神经元中该报告基因的积累。这些转基因小鼠为监测生理或病理条件下泛素/蛋白酶体系统的状态提供了一种有效工具。[5]

C25H42BN3O6

491.43

491.317

C, 61.10; H, 8.61; B, 2.20; N, 8.55; O, 19.53

179324-22-2

490002

White to off-white solid powder

4.706

147.46

5

6

15

35

653

3

B([C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1)(O)O

MWKOOGAFELWOCD-FKBYEOEOSA-N

InChI=1S/C25H42BN3O6/c1-16(2)12-20(24(31)29-22(26(33)34)14-18(5)6)27-23(30)21(13-17(3)4)28-25(32)35-15-19-10-8-7-9-11-19/h7-11,16-18,20-22,33-34H,12-15H2,1-6H3,(H,27,30)(H,28,32)(H,29,31)/t20-,21-,22-/m0/s1

[(1R)-3-methyl-1-[[(2S)-4-methyl-2-[[(2S)-4-methyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)pentanoyl]amino]pentanoyl]amino]butyl]boronic acid

MG 262; MG-262; PS-III; 179324-22-2; Z-Leu-Leu-Leu-B(OH)2; CHEMBL114388; [(1R)-3-methyl-1-[[(2S)-4-methyl-2-[[(2S)-4-methyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)pentanoyl]amino]pentanoyl]amino]butyl]boronic acid; 549V4DP94W; MG 262

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。