MV151

Proteasome

蛋白酶体标记和凝胶内检测[1]
MV151(6)的效价通过荧光底物测定蛋白酶体活性来确定。将EL-4裂解物与浓度增加的MV151孵育，监测底物su - leu - leu - val - tir - amc（乳糜蛋白酶样活性）、Z-Ala-Ala-Arg-AMC（胰蛋白酶样活性）和Z-Leu-Leu-Glu-βNA（肽酰谷氨酰肽水解活性）的裂解情况。在浓度低于1 μM时，MV151似乎比抑制PGPH活性更有效地抑制胰蛋白酶样活性和凝乳胰蛋白酶样活性（图2A）。这可能是由于亚基之间的活性差异，变构效应，小亚基特异性的探针，或非饱和动力学。在浓度为1 μM及更高时，MV151完全抑制上述三种活性。
使用荧光扫描仪探索MV151标记的蛋白酶体亚基的直接凝胶可视化。纯化的人20S蛋白酶体用MV151处理后，活性亚基β1、β2和β5被均匀标记（图2B）。为了确定凝胶内检测的灵敏度，我们直接将凝胶的荧光读数（图2B）与蛋白质的银染色检测蛋白酶体亚基（图2C）进行了比较。凝胶内检测显示非常敏感，因为只需3 ng蛋白酶体就足以检测单个mv151标记的蛋白酶体亚基；这种方法的检测灵敏度至少是银染色的三倍。
接下来，我们比较了组成β1、β2和β5亚基与免疫蛋白酶体β1i、β2i和β5i亚基的标记。为此，我们在人宫颈癌细胞系HeLa（表达组成性蛋白酶体）和小鼠淋巴样细胞系EL-4（表达组成性蛋白酶体和免疫蛋白酶体）的溶出物中标记蛋白酶体，浓度增加MV151。所有活性组成型和诱导型β蛋白酶体亚基被MV151整齐而均匀地标记（图2D和2E）。所有亚基在10 nM MV151浓度下均可检测到，在1 μM MV151浓度下荧光信号达到饱和。在较高浓度的MV151中，高分子量区域的非特异性标记增加。

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活细胞功能蛋白酶体抑制[1]
接下来，我们研究了MV151是否能够标记活细胞中的蛋白酶体亚基。增加MV151浓度孵育EL-4和HeLa细胞。在EL-4细胞（图4A）和HeLa细胞（图4B）中观察到所有蛋白酶体亚基的特异性和敏感性标记，尽管比在裂解物中标记亚基需要更高的浓度。β1亚基的标记比裂解物的强度低，而β5标记看起来更明显。细胞裂解物和活细胞中蛋白酶体标记谱的差异此前已被报道；然而，其原因尚不清楚。重要的是，EL-4和HeLa细胞与无活性对照化合物MV152(7)孵育后，没有发现蛋白酶体或任何其他蛋白质的标记（图4A和4B）， MV152与MV151几乎相同，但缺乏活性的乙烯基砜战斗部。

小鼠蛋白酶体抑制的监测[1]
在细胞系中获得的结果促使我们研究MV151是否可以用于标记小鼠蛋白酶体。为检测MV151的生物利用度，C57Bl/6小鼠单次腹腔注射MV151 （20 μmol/kg体重），24小时后处死。 荧光显微镜对小鼠组织的分析显示了MV151在体内穿透组织的能力。在肝脏（图5A）和胰腺（图5B）中检测到最高的Bodipy TMR荧光。有趣的是，Bodipy TMR荧光在组织周围较高，表明探针可能通过腹膜腔扩散而不是通过进入血液分布而最有效地到达肝脏。

为了研究蛋白酶体探针的作用，我们利用最近开发的一种转基因小鼠模型来监测泛素-蛋白酶体系统，该模型基于UbG76V-GFP报告基因的普遍表达。我们之前的研究表明，使用蛋白酶体抑制剂epoxomicin和MG262会导致UbG76V-GFP报告基因在受影响的组织中大量积累。这种积累主要在肝脏中发现，在其他组织中浓度较高。在本实验中，给UbG76V-GFP报告小鼠单次腹腔注射MV151 （20 μmol/kg体重）。注射后共24小时，处死小鼠，荧光显微镜下对多个组织进行分析。在肝脏（图5C）和胰腺（图5E）中检测到积累UbG76V-GFP的细胞，在所有检查组织（脾、肠、肾、肝和胰腺）中，胰腺也含有最高的Bodipy TMR荧光。重要的是，所有积累UbG76V-GFP报告基因的细胞都含有非常高的Bodipy TMR荧光。蛋白酶体探针分布在聚集报告基因的细胞的细胞质和细胞核中。与我们在细胞培养实验中观察到的结果相似，小鼠受影响的细胞在靠近细胞核的细胞质中含有MV151的颗粒状积聚。我们证实了UbG76V-GFP在肝脏和胰腺中的积累与MV151的蛋白酶体阻断相一致。用MV151处理动物的肝脏（图5D）和胰腺（图5F）匀浆的SDS-PAGE凝胶内荧光分析显示，蛋白酶体催化亚基被标记为预期的，尽管与体外研究相比，观察到更高的背景标记。（图5D和图5F分别使用图5C和图5E图像中的组织。）脾脏匀浆的SDS-PAGE和凝胶内荧光分析显示了组成型和诱导型蛋白酶体催化亚基的标记（图5G）。

作为最后一组实验，我们监测了MG262在UbG76V-GFP转基因小鼠中的生物分布。我们选择硼酸MG262用于此目的，因为它既有纯化形式的商业可用性，又与药物硼替佐米最相似。分别皮下注射5 μmol/kg或10 μmol/kg体重的硼酸MG262，注射24小时后处死。脾胰溶解，MV151处理。SDS-PAGE分析显示，与未经处理的动物组织裂解物相比，蛋白酶体催化亚基对应的标记带显著减少(图6A，胰腺；图6B，脾脏)。同样组织的荧光显微镜分析（图6A和6B）证实了mg262处理的UbG76V-GFP小鼠中蛋白酶体的浓度依赖性抑制，UbG76V-GFP报告基因积累水平增加。

荧光底物测定蛋白酶体活性[1]
EL-4蛋白裂解物（1 mg/ml）与不同浓度的MV151(6)在37℃下孵育1小时。为了测定蛋白酶体的活性，将10 μg标记的裂解液加入100 μl底物缓冲液中，其中含有20 mM HEPES （pH 8.2）、0.5 mM EDTA、1% DMSO、1 mM ATP和10 μM Z-Ala-Ala-Arg-AMC（色氨酸样）、60 μM su - leu - leu - val - tyr - amc （chymotryptic样）或60 μM Z-Leu-Leu-Glu-βNA （caspase样）。采用Fluostar Optima 96孔板荧光仪（AMC为λex/λem = 355/450 nm， βNA为320/405 nm），在37°C下每分钟测量一次荧光，持续25 min，以每分钟最大荧光增量计算每个样品的比活性。非特异性水解通过1 μM环氧霉素在37℃预孵育1小时来评估，并从每次测量中减去。 <人力资源> 标记蛋白酶体亚基的凝胶内检测[1]
全细胞裂解液在含有50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 250 mM蔗糖，2 mM ATP的裂解缓冲液中制备。用比色Bradford法测定蛋白浓度。标记反应中，10 μg总蛋白裂解物在37℃下孵育1小时，增加MV151的浓度，总反应体积为10 μl。如有需要，使用50 ng纯化20S蛋白酶体。在竞争研究中，将细胞裂解物（10 μg）暴露于已知抑制剂中1小时，然后与MV151 (0.1 μM)在37°C下孵育1小时。为了评估背景标记，用MV151处理热灭活裂解物（10 μg，用1% SDS煮沸3分钟）。反应混合物用含有β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液煮沸3分钟，在12.5% SDS-PAGE上分离。使用台风变模成像仪上的Cy3/Tamra设置（λex 532, λem 560）直接在湿凝胶板上进行凝胶内可视化。用1 - 10 μM MV151在37°C的培养基中培养8小时，测定活细胞中的标记谱。细胞裂解，凝胶内检测，如上所述。

显微镜观察[1]< br > 将约0.5 × 106个细胞接种于35mm培养皿中，14mm微孔/ 1.5盖和玻璃底微孔培养皿中，并允许贴壁过夜。在配备Radiance 2100 MP集成激光检测系统和Tsunami多光子激光模块的Nikon Eclipse TE 2000U显微镜上，用60×油浸透镜观察细胞。显微镜控制和数据采集采用LaserSharp 2K软件，图像处理采用Image Pro 3DS 5.1软件。GFP在λex = 488 nm处激发，在500 ~ 530 nm处检测。MV151和MV152在λex = 543 nm处激发，在560 ~ 620 nm处检测到。使用Photoshop软件调整CLSM图像的亮度和对比度。

Mouse Experiments [1]
Mice were housed according to Swedish animal care protocols with a 12 hr day/light cycle, and they were fed standard laboratory chow and tap water ad libitum. Adult C57Bl/6 and UbG76V-GFP/1 mice [16], matched for sex and age, were given a single intraperitoneal injection of vehicle (60% DMSO, 40% PBS), MV151 (20 μmol/kg body weight), or MG262 (5 or 10 μmol/kg body weight) in a total volume of 200 μl. Based on prior experience in our lab, the boronic acid inhibitors proved to be more potent and showed better tissue penetration in vivo compared to the vinyl sulfone inhibitors. Therefore, the 20 μmol/kg bodyweight dose was chosen for MV151, which showed no apparent toxicity in mice. Mice were euthanized 24 hr postinjection by anesthetization with inhaled isoflurane (4.4% in oxygen), followed by transcardial perfusion with 50 ml PBS for removal of contaminating blood. Tissues collected for immunocytochemical analysis were processed as described previously. Briefly, 12 μm cryosections were fixed for 15 min in 4% paraformaldehyde/PBS and washed in PBS; where mentioned, Hoechst nuclear stain (2 μg/ml in H2O) was applied for 15 min in the dark, followed by washing in PBS. Sections were mounted in a matrix containing 2.5% DABCO. Confocal microscopy was performed on a Zeiss LSM 510 META system. Tissues isolated for in-gel analysis were lysed with a Heidolph tissue homogenizer in 300 μl lysis buffer and were further treated as described above.

[1]. A fluorescent broad-spectrum proteasome inhibitor for labeling proteasomes in vitro and in vivo. Chem Biol. 2006 Nov;13(11):1217-26.

The proteasome is an essential evolutionary conserved protease involved in many regulatory systems. Here, we describe the synthesis and characterization of the activity-based, fluorescent, and cell-permeable inhibitor Bodipy TMR-Ahx(3)L(3)VS (MV151), which specifically targets all active subunits of the proteasome and immunoproteasome in living cells, allowing for rapid and sensitive in-gel detection. The inhibition profile of a panel of commonly used proteasome inhibitors could be readily determined by MV151 labeling. Administration of MV151 to mice allowed for in vivo labeling of proteasomes, which correlated with inhibition of proteasomal degradation in the affected tissues. This probe can be used for many applications ranging from clinical profiling of proteasome activity, to biochemical analysis of subunit specificity of inhibitors, and to cell biological analysis of the proteasome function and dynamics in living cells. [1]

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In summary, we described the synthesis of MV151 and characterized it as being a cell-permeable, broad-spectrum proteasome inhibitor. MV151 enables broad-spectrum proteasome profiling, both in cell lysates and in living cells. The Bodipy TMR dye proved to be very useful for in-gel readout of labeled active subunits in that it provided a straightforward method for direct and sensitive proteasome profiling and omitted the need for western blotting, radioactivity, and gel drying. MV151 could be readily detected upon administration to mice and correlated with inhibition of the proteasome in the affected tissues. Finally, MV151-mediated proteasome labeling in combination with UbG76V-GFP transgenic mice is a useful strategy for monitoring the biodistribution of proteasome inhibitors.[1]
The proteasome is a key enzyme in the maintenance of cellular homeostasis. Here, the synthesis and characterization of the activity-based, fluorescent, and cell-permeable MV151 are presented. MV151 targets the proteasome specifically and shows broad-spectrum activity by covalent and irreversible binding to the catalytic N-terminal threonine residues of immunoinducible and constitutively active β subunits. The bright fluorophore facilitates rapid and sensitive detection of active proteasome subunits by in-gel detection and fluorescence microscopy in living cells. Potentially, MV151 can find application in diverse fields of proteasome research: in medical research, for profiling the active proteasome fractions in a clinically relevant sample; and in chemistry and biochemistry, facilitating rapid determination of potency and subunit specificity of new proteasome inhibitors. [1]

C59H91BN8O9F2S

1137.27

1136.669

C, 62.31; H, 8.07; B, 0.95; F, 3.34; N, 9.85; O, 12.66; S, 2.82

945611-88-1

945611-88-1 (MV-151); 945611-89-2 (MV-152)

154732122

Typically exists as solid at room temperature

234

6

12

36

80

2280

3

[B-]1(N2C(=C(C(=C2C=C3[N+]1=C(C=C3)C4=CC=C(C=C4)OC)C)CCC(=O)NCCCCCC(=O)NCCCCCC(=O)NCCCCCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)/C=C/S(=O)(=O)C)C)(F)F

JNIDQOOVQFMCNR-FWDZYPIVSA-N

InChI=1S/C59H91BF2N8O9S/c1-40(2)36-46(31-35-80(10,77)78)66-58(75)51(38-42(5)6)68-59(76)50(37-41(3)4)67-57(74)22-16-13-19-33-64-55(72)20-14-11-17-32-63-54(71)21-15-12-18-34-65-56(73)30-28-49-43(7)53-39-47-25-29-52(45-23-26-48(79-9)27-24-45)70(47)60(61,62)69(53)44(49)8/h23-27,29,31,35,39-42,46,50-51H,11-22,28,30,32-34,36-38H2,1-10H3,(H,63,71)(H,64,72)(H,65,73)(H,66,75)(H,67,74)(H,68,76)/b35-31+/t46-,50+,51+/m1/s1

(2S)-2-[6-[6-[6-[3-[2,2-difluoro-12-(4-methoxyphenyl)-4,6-dimethyl-3-aza-1-azonia-2-boranuidatricyclo[7.3.0.03,7]dodeca-1(12),4,6,8,10-pentaen-5-yl]propanoylamino]hexanoylamino]hexanoylamino]hexanoylamino]-4-methyl-N-[(2S)-4-methyl-1-[[(E,3S)-5-methyl-1-methylsulfonylhex-1-en-3-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]pentanamide

MV151; MV 151; 945611-88-1; (2S)-2-[6-[6-[6-[3-[2,2-difluoro-12-(4-methoxyphenyl)-4,6-dimethyl-3-aza-1-azonia-2-boranuidatricyclo[7.3.0.03,7]dodeca-1(12),4,6,8,10-pentaen-5-yl]propanoylamino]hexanoylamino]hexanoylamino]hexanoylamino]-4-methyl-N-[(2S)-4-methyl-1-[[(E,3S)-5-methyl-1-methylsulfonylhex-1-en-3-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]pentanamide; 6-(3-(5,5-difluoro-7-(4-methoxyphenyl)-1,3-dimethyl-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-2-yl)propanamido)-N-((4S,7S,10S)-7,10-diisobutyl-2-methyl-4-((E)-2-(methylsulfonyl)vinyl)-6,9,12,19-tetraoxo-5,8,11,18-tetraazatetracosan-24-yl)hexanamide; MV-151; Bodipy TMRAhx(3)L(3)VS.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。