Novexatin   中文名称: 诺瓦克汀

NP213 targets the fungal cytoplasmic membrane. Its mechanism of action involves membrane perturbation, disruption, and permeabilization, leading to cell lysis. [1]
As a cationic antimicrobial peptide, it targets the fungal cell membrane regardless of the metabolic activity level of the fungi. [2]
The primary target of Novexatin is the fungal cytoplasmic membrane. As a cationic antimicrobial peptide (AMP), Novexatin acts by interacting with the fungal cell membrane and is effective regardless of the metabolic activity level of the fungi. The compound exerts its antifungal activity through membrane perturbation, disruption, and permeabilization, ultimately leading to fungal cell lysis. Notably, unlike conventional antifungal agents such as azoles, Novexatin does not rely on enzyme inhibition for its action, and this unique mechanism makes it less prone to inducing drug resistance.

NP213（500–1000 μg/mL；18 小时）增加了 PI 染色的 T 细胞数量。标本中的红细胞 NCPF0118。这一发现表明NP213具有杀菌作用，膜透化是其作用机制[1]。 NP213 对红色毛癣菌 NCPF0118 的最低抑制浓度 (MIC) 根据角蛋白来源的不同而变化。在含有人皮肤角蛋白、人指甲角蛋白和羊毛角蛋白的1640培养基中，NP213的MIC值分别为16-32mg/L、125mg/L和250mg/L[1]。 NP213（2-3 小时；0-8 μg/ml）对具有临床意义的酵母菌表现出高活性，例如念珠菌属、隐球菌属和丝孢菌属。所有 122 种酵母分离株的 MIC100 中位数为 1-2 µg/ml [3]。

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- NP213（Novexatin）是由NovaBiotics开发的第三代合成环状阳离子抗菌肽。目前该药已完成I/IIa期临床开发，作为外用制剂（水溶液）用于治疗轻至中度甲真菌病。[1][2]
- NP213是基于指甲内源性宿主防御肽合理设计而成。它是一种高度亲水且带正电荷（净电荷+7）的环状肽，由7个精氨酸组成的七聚体（7个氨基酸均为精氨酸）。环状结构最大程度减少了外切蛋白酶的降解，而有限的序列多样性（仅含R-R键）使其仅对极少数类型的内切蛋白酶敏感，从而解决了多肽易被蛋白水解的问题。[1]
- NP213的正电荷（+7）有利于指甲穿透，因为在生理条件下指甲是一种带负电荷的水性水凝胶。其小分子尺寸（7个氨基酸，而内源性HDP为30-100个氨基酸）也有助于指甲穿透。[1]
- NP213具有膜裂解作用模式，无论真菌代谢活性水平如何均可靶向杀灭真菌。它引起真菌膜通透性增加、细胞内含物丢失和细胞死亡。[1][2]
- 在使用感染了毛癣菌的全层人甲碎片优化的离体人甲感染模型中，每日应用10%（质量/体积）NP213持续28天可完全根除真菌感染。处理后指甲的透射电子显微镜分析显示死亡真菌的细胞壁保持完整但细胞内含物消失，证实NP213能够穿透全层指甲并保持生物活性。这一效果优于8%环吡酮和5%阿莫罗芬指甲油剂，后者在甲板内仍有活真菌存在的证据。[1]
- NP213成功根除了从临床确诊甲真菌病患者获得的离体感染甲的皮肤癣菌感染。在所有八个测试的指甲样本中，每日用10% NP213治疗28天后，与溶媒对照相比皮肤癣菌载量显著降低（P < 0.0001）。[1]
- NP213的开发凸显了使用生理相关检测方法的重要性。标准体外药敏试验方法（如CLSI）未能预测抗真菌药物在指甲内的疗效。使用改良角蛋白基础培养基（磷酸盐缓冲液中含0.5%人甲粉末）获得的MIC值能更好地反映指甲内的活性。如果没有这种改良的检测方法，使用标准方法获得的高MIC值本可能导致NP213开发的中止——尽管该药目前已处于临床后期阶段。[1] - NP213代表了一种针对甲真菌病的新型、同类首创候选疗法，解决了现有疗法的局限性，包括角蛋白结合、指甲穿透性差以及与口服抗真菌药相关的副作用。[1][2]

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Novexatin在体外表现出有效的杀真菌活性。作为一种杀真菌肽（fungicidal peptide），Novexatin能够快速直接地杀死真菌细胞，其作用机制是通过靶向真菌细胞质膜，引起膜的扰动、破坏和通透化，最终导致细胞裂解。与传统抗真菌药物不同，Novexatin不依赖抑制特定酶来发挥作用，因此其对真菌的杀灭活性不受真菌代谢状态的影响。在临床前研究中，Novexatin还显示出良好的安全性特征，对皮肤和指甲局部应用后无全身暴露的证据。

在小鼠中，NP213 (25 mg/kg) 具有良好的耐受性。 NP213 的半衰期约为 4.5 小时，在急性播散性念珠菌病小鼠模型中被证明既有效又具有耐受性 [3]。

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- 一项包含60名甲癣患者的I/IIa期临床研究的初步数据证实，每日给药28天，NP213耐受性非常好。它改善了指甲外观，并在28天给药周期后180天评估指甲真菌负荷时，观察到真菌学改善或感染消退。在轻度至中度甲癣患者中，NP213效果优于安慰剂。[1]

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Novexatin在人体临床试验中表现出显著的体内疗效。在第一项IIa期人体临床试验中，Novexatin治疗组中43.3%的患者在180天后指甲碎片培养结果显示无真菌检出。在第二项IIa期研究中，360天后56.5%的患者皮肤癣菌培养结果为阴性。两项试验中Novexatin均采用每日一次、连续28天的给药方案，这与传统甲真菌病外用治疗需要长达52周的应用形成鲜明对比。患者报告结局显示，在仅14天应用后，患者即记录了指甲外观的改善。研究中鉴定出的真菌均为毛癣菌属（Trichophyton spp.）。Novexatin的临床前和临床安全性特征均表现良好，局部应用于皮肤和指甲后无全身暴露证据。

Novexatin作为一种靶向真菌细胞膜的抗真菌肽，其主要作用机制涉及膜的直接物理化学相互作用，而非与特定酶或受体的结合。这种膜靶向机制通常通过测定最小抑菌浓度（MIC）、膜通透性测定（如SYTOX Green摄取实验）以及透射电子显微镜观察膜形态变化等方法进行评估，而非传统的酶结合或受体结合实验。

- 碘化丙啶染色实验：将红色毛癣菌孢子悬液暴露于不同浓度的NP213中18小时。然后真菌与PI共孵育15分钟。通过荧光显微镜检查细胞，并计数PI染色细胞的数量。[1]
- 时间-杀菌实验：制备红色毛癣菌孢子悬液或萌发孢子，在RPMI 1640培养基中与NP213或特比萘芬共孵育。在指定时间点取出等分试样，在含PASA的培养基中系列稀释以中和残留的NP213，然后涂布于PDA琼脂上。培养后计数菌落以确定真菌杀灭情况。[1]
- 芽管抑制实验：将红色毛癣菌孢子与NP213孵育，显微镜下评估芽管形成。芽管数量显著减少，但已形成芽管的长度不受影响。[1]
- 电荷依赖性实验：将红色毛癣菌在含NP213和递增摩尔当量PASA的RPMI 1640培养基中孵育96小时。评估生长抑制情况，所用浓度的PASA单独对真菌生长无影响。[1]
- MIC测定：按照CLSI M38-A2丝状真菌肉汤稀释法对一系列皮肤癣菌和非皮肤癣菌进行抗真菌药敏试验。MIC确定为抑制生长的最低浓度，MFC通过将孔内容物涂布于PDA琼脂上并评估生长情况来确定。[1]
- 改良MIC测定：抗真菌药敏试验按上述方法进行，但将RPMI 1640替换为含不同浓度人指甲粉悬液和alamarBlue的磷酸钠缓冲液。人指甲粉由无病指甲碎片在液氮中研磨、过筛并高压灭菌制备。每24小时用酶标仪监测真菌代谢活性，持续长达168小时。[1]

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Novexatin作为一种抗真菌肽，其体外抗真菌活性评估通常遵循CLSI（临床和实验室标准协会）指南进行肉汤微量稀释法测定。典型实验流程包括：将Novexatin在适宜的培养基（如RPMI-1640）中进行系列稀释，加入标准化的真菌悬浮液（如毛癣菌属分生孢子，终浓度约0.4-5 × 10⁴ CFU/mL），在35°C条件下孵育48-72小时后读取最小抑菌浓度（MIC）。体外细胞毒性评估可使用正常人角质形成细胞或成纤维细胞，通过MTT或CCK-8法测定Novexatin对哺乳动物细胞的毒性。

NP213（诺维沙汀）制剂[4]
NP213采用固相合成法合成，以乙酸盐形式存在（纯度约为95%）（法国PolyPeptide集团；英国Almac集团；美国Ambiopharm公司）。NP213以无定形结晶形式制备成冻干粉末，其纯度通过反相高效液相色谱法测定。NP213是由7个L-精氨酸残基组成的环状主链均聚物，净电荷为+7。

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研究设计[4]
本文总结了我们开展的四项临床试验的结果，这些试验旨在评估诺维沙汀®（NP213）的安全性和有效性。所有研究均按照《赫尔辛基宣言》中规定的伦理原则进行，并符合良好临床规范和所有适用的监管要求。所有受试者均被告知临床研究的性质和目的，并在研究开始前签署了知情同意书。

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I/IIa期研究[4]
一项初步的I/IIa期研究（EudraCT编号：2008-001496-29）是一项随机、安慰剂对照、分两阶段进行的首次人体临床试验，分为两个部分（第一部分为双盲，第二部分为单盲），旨在评估NP213在轻度至中度趾甲真菌感染（25%–75%的趾甲受累）患者中的安全性、耐受性、药代动力学(PK)和药效学。本研究未明确致病真菌。第二部分（IIa期）仅在第一部分（I期）确认耐受性和安全性的结果公布后才开始。第一部分纳入了12名患有趾甲真菌病的受试者，分别接受NP213或安慰剂（赋形剂）治疗（比例为2:1）；第二部分纳入了48名患有趾甲真菌病的受试者，分别接受NP213或安慰剂（赋形剂）治疗（比例为2:1）。相当一部分试验受试者（42名患者中的19名；45.2%）的趾甲真菌病病情比意向治疗人群（轻度至中度趾甲真菌病）更为严重，但仍被纳入研究。研究分析涵盖所有患者，并对意向治疗人群进行了单独分析。本文所有试验标准的更详细描述可在补充数字内容中找到。

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第二项 IIa 期研究 [4]
第二项 IIa 期临床试验（ClinicalTrials.gov 注册号：NCT02343627）是一项随机、双盲、安慰剂对照的试点研究，旨在评估 NP213 溶液治疗由皮肤癣菌引起的轻度至中度趾甲真菌感染（10%–50% 的趾甲受累）患者的安全性和有效性。该试验纳入了 47 名受试者，并按 3:1 的比例随机分配接受 NP213 或安慰剂治疗。

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最大暴露量研究 [4]
接下来进行了一项独立的最大暴露量研究，以验证先前的药代动力学数据，该数据表明在对单个目标趾甲给药后，NP213 不会达到全身浓度。本研究是在 I/IIa 期和第二项 IIa 期研究之外，采用独立患者人群开展的。本研究旨在确定每日将 NP213 涂抹于每个脚趾甲和手指甲，持续 28 天后，其全身吸收程度如何。本试验是一项开放标签、多剂量安全性及药代动力学试验，研究对象为健康成年志愿者和患有严重远端甲下甲癣 (DSO)³⁸ 的患者，这些患者由皮肤癣菌引起，累及手指甲和/或脚趾甲（双侧大脚趾甲及至少四个其他脚趾甲受累面积≥50%）。试验采用最大剂量方案，评估 10% (w/v) NP213 溶液的安全性及药代动力学。任何用于治疗甲癣的局部疗法的理想目标产品特性是将产品涂抹于所有指甲和甲周皮肤，因为再感染/复发很常见^18,19，这可能是由于邻近指甲的亚临床感染或伴随的足癣（香港脚）所致，而足癣在甲癣患者中很常见^22,23。目前的局部甲癣治疗方法无法实现这一点。鉴于NP213具有良好的安全性，且其分子设计专门用于渗透指甲而非皮肤，因此不会被全身吸收，本最大暴露试验旨在研究最大暴露是否会导致NP213的全身暴露，并确定是否可以将涂抹于所有指甲和甲周皮肤纳入后续的治疗方案。

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根据现有临床研究数据，Novexatin已直接进入人体临床试验阶段。对于抗真菌药物的临床前体内评估，常用的动物模型包括豚鼠甲真菌病模型（通过接种毛癣菌至指甲诱导感染）和豚鼠皮肤癣菌病模型。典型的动物实验流程涉及：在麻醉动物指甲处制造微创损伤后接种真菌，待感染建立后（通常需7-14天），局部给予Novexatin（每日1-2次，持续14-28天），通过真菌培养和组织学切片评估治疗效果。

[1]. Improved Methods for Assessing Therapeutic Potential of Antifungal Agents against Dermatophytes and Their Application in the Development of NP213, a Novel Onychomycosis Therapy Candidate.Antimicrob Agents Chemother. 2019 Apr 25;63(5). pii.

[2]. Sequential and Structural Aspects of Antifungal Peptides from Animals, Bacteria and Fungi Based on Bioinformatics Tools.Probiotics Antimicrob Proteins. 2016 Jun;8(2):85-101.

[3]. Novamycin®/NP339 Technology Summary.

[4]. NP213 (Novexatin®): A unique therapy candidate for onychomycosis with a differentiated safety and efficacy profile. Med Mycol. 2020 Nov 10;58(8):1064-1072.

C42H84N28O7

1093.29976272583

1092.707

C, 46.14; H, 7.74; N, 35.87; O, 10.24

942577-31-3

NP213 TFA

16679727

Cyclo(Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg)
cyclo[L-arginyl-L-arginyl-L-arginyl-L-arginyl-L-arginyl-L-arginyl-L-arginyl]

Cyclo-RRRRRRR
(cyclo)-RRRRRRR-(cyclo)

Typically exists as solid at room temperature

-10.2

655

21

14

28

77

1710

7

O=C1[C@H](CCC/N=C(\N)/N)NC([C@H](CCC/N=C(\N)/N)NC([C@H](CCC/N=C(\N)/N)NC([C@H](CCC/N=C(\N)/N)NC([C@H](CCC/N=C(\N)/N)NC([C@H](CCC/N=C(\N)/N)NC([C@H](CCC/N=C(\N)/N)N1)=O)=O)=O)=O)=O)=O

NVZLKNHDHPPJHL-RMIXPHLWSA-N

InChI=1S/C42H84N28O7/c43-36(44)57-15-1-8-22-29(71)65-24(10-3-17-59-38(47)48)31(73)67-26(12-5-19-61-40(51)52)33(75)69-28(14-7-21-63-42(55)56)35(77)70-27(13-6-20-62-41(53)54)34(76)68-25(11-4-18-60-39(49)50)32(74)66-23(30(72)64-22)9-2-16-58-37(45)46/h22-28H,1-21H2,(H,64,72)(H,65,71)(H,66,74)(H,67,73)(H,68,76)(H,69,75)(H,70,77)(H4,43,44,57)(H4,45,46,58)(H4,47,48,59)(H4,49,50,60)(H4,51,52,61)(H4,53,54,62)(H4,55,56,63)/t22-,23-,24-,25-,26-,27-,28-/m0/s1

2-[3-[(2S,5S,8S,11S,14S,17S,20S)-5,8,11,14,17,20-hexakis[3-(diaminomethylideneamino)propyl]-3,6,9,12,15,18,21-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclohenicos-2-yl]propyl]guanidine

NP 213; NP213; Novexatin; RefChem:927946; 942577-31-3; NP213; 2-[3-[(2S,5S,8S,11S,14S,17S,20S)-5,8,11,14,17,20-hexakis[3-(diaminomethylideneamino)propyl]-3,6,9,12,15,18,21-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclohenicos-2-yl]propyl]guanidine; NP-213

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。