| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 1mg |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 25mg |
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| 50mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
Myosin II
Blebbistatin, the best characterized myosin II-inhibitor, is commonly used to study the biological roles of various myosin II isoforms. Despite its popularity, the use of blebbistatin is greatly hindered by its blue-light sensitivity, resulting in phototoxicity and photoconversion of the molecule. Additionally, blebbistatin has serious cytotoxic side effects even in the absence of irradiation, which may easily lead to the misinterpretation of experimental results since the cytotoxicity-derived phenotype could be attributed to the inhibition of the myosin II function. Here we report the synthesis as well as the in vitro and in vivo characterization of a photostable, C15 nitro derivative of blebbistatin with unaffected myosin II inhibitory properties. Importantly, para-nitroblebbistatin is neither phototoxic nor cytotoxic, as shown by cellular and animal tests; therefore it can serve as an unrestricted and complete replacement of blebbistatin both in vitro and in vivo[1]. |
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| 体外研究 (In Vitro) |
Blebbistatin是最具特征的肌球蛋白II抑制剂，通常用于研究各种肌球蛋白II亚型的生物学作用。尽管它很受欢迎，但它的蓝光敏感性极大地阻碍了它的使用，导致了分子的光毒性和光转换。此外，即使在没有照射的情况下，布来司他丁也有严重的细胞毒性副作用，这很容易导致对实验结果的误解，因为细胞毒性衍生的表型可能是由于肌球蛋白II功能的抑制。在这里，我们报告了一种具有不受影响的肌球蛋白II抑制特性的光稳定、C15硝基博来司他丁衍生物的合成以及体外和体内表征。重要的是，如细胞和动物试验所示，para-nitroBlebbistatin既没有光毒性也没有细胞毒性；因此，它可以在体外和体内不受限制地完全替代博来司他丁[1]。
para-Nitroblebbistatin 抑制盘基网柄菌肌球蛋白II运动结构域（DdMD）的基础ATP酶活性，IC50为 2.33 ± 0.13 µM，与blebbistatin相似（IC50 = 2.96 ± 0.45 µM）。[1] para-Nitroblebbistatin 抑制兔骨骼肌肌球蛋白 S1（SkS1）的基础ATP酶活性，IC50为 0.4 ± 0.05 µM，与blebbistatin相当（IC50 = 0.41 ± 0.03 µM）。[1] 在20 µM浓度下，para-Nitroblebbistatin 完全抑制了DdMD和SkS1两种肌球蛋白亚型的肌动蛋白激活的ATP酶活性，即使在高浓度肌动蛋白（高达80 µM）存在下也是如此。[1] 当在430 nm激发时，para-Nitroblebbistatin 的荧光发射强度不到blebbistatin的1%。[1] 在蓝光（480 ± 10 nm）照射下，para-Nitroblebbistatin 的吸收光谱基本保持不变，表明其具有高光稳定性；而blebbistatin则发生了显著的光转化。[1] 基于肌球蛋白-ADP-钒酸盐-blebbistatin复合物晶体结构（PDB：1YV3）的分子建模表明，在blebbistatin的C15位添加硝基（形成para-Nitroblebbistatin）不会与肌球蛋白结合口袋中的任何侧链产生空间位阻。[1] |
| 体内研究 (In Vivo) |
在HeLa细胞中，在黑暗中用20 µM para-Nitroblebbistatin 处理3天，有效抑制了胞质分裂，导致多核细胞持续增加，到第3天几乎所有细胞都变成多核。此效果与blebbistatin处理相当。[1]
在持续出泡的M2人黑色素瘤细胞系中，10 µM的para-Nitroblebbistatin 溶液在10分钟内完全抑制了细胞出泡，效果与blebbistatin相同。[1] 在后侧线原基（pLLp）中表达GFP的转基因斑马鱼胚胎（1 dpf）中，用浓度递增的para-Nitroblebbistatin 处理24小时，阻止了pLLp的迁移并导致身体弯曲，表型模拟了blebbistatin处理的效果。[1] 在盘基网柄菌细胞中，para-Nitroblebbistatin 诱导了多核性，与blebbistatin相似。[1] |
| 酶活实验 |
基础和肌动蛋白激活ATP酶测量[1]
在20⁰C下，使用丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶偶联试验（NADH偶联试验）在增加浓度的Blebistatin/para-nitroBlebbistatin/对氯Blebistadin或肌动蛋白下，测量了3µM或0.5µM DdMD W501+和3μM或0.2µM SkS1构建体的相对基础或肌动蛋白激活的ATP酶活性。在肌动蛋白激活的ATPase测量中，将20µM抑制剂与肌球蛋白在冰上预孵育15分钟。相应地，从兔骨骼肌制备G-肌动蛋白，并在室温下用2mM MgCl2聚合1小时。在测定缓冲液中进行基础ATP酶活性测量，在低盐缓冲液（2 mM MgCl2、1 mM HEPES、2 mM 2-巯基乙醇，pH 7.3）中进行肌动蛋白激活ATP酶活性测定。 在体外评估了对肌球蛋白II ATP酶活性的抑制作用。在存在浓度递增的para-Nitroblebbistatin 或blebbistatin的情况下，测量纯化的肌球蛋白亚型（盘基网柄菌肌球蛋白II运动结构域，DdMD，或兔骨骼肌肌球蛋白 S1，SkS1）的基础ATP酶活性。该实验测量了ATP释放的无机磷酸盐。从剂量反应曲线确定IC50值。为了测试对肌动蛋白激活的ATP酶活性的影响，在固定浓度抑制剂（20 µM）和递增浓度的肌动蛋白（高达80 µM）存在下测量ATP酶活性。所有实验进行三次重复。[1] |
| 细胞实验 |
细胞检测和显微成像[1]
对于光毒性测定，将HeLa细胞生长到96孔板中，实现单层培养。细胞在含有10µM Blebistatin或para-nitroBlebbistatin的PBS中孵育30分钟，然后用480±10nm的光照射15分钟。施加的能量为3.3µJ/µm2。照射后，将抑制剂洗掉，并将细胞保持在细胞培养基中。孵育18小时后，通过直接台盼蓝染色和随后对照射区域中的细胞计数来确定死亡率。使用LWD PH 20x/0.40物镜在配备索尼数码相机的改良光学显微镜（Motic AE31）上采集HeLa细胞的广角图像（图2A和图S2）。使用Plan Apo 63x/1.40 Oil DIC物镜对HeLa细胞进行共聚焦成像（图3C）。采集和图像分析使用蔡司LSM 710 Zen 2011软件。对于HeLa Kyoto细胞的活细胞共聚焦延时成像，DMEM培养基中补充了25 mM HEPES，以实现CO2非依赖性培养基。使用Plan Apo 20x/0.8物镜在蔡司LSM 710上进行共聚焦延时成像（图2B和电影S1、S2和S3）。抑制剂处理的Dd细胞在50 ml Falcon管中在21°C下以200 rpm的速度振荡培养三天。使用Plan Apo 63×/1.4油DIC II物镜，通过Femtonics双光子显微镜（配备Ti蓝宝石激光器）对Dd和M2细胞进行双光子成像（图S3、S4和电影S4和S5）。使用Femtonics MES软件进行采集和图像分析。 HeLa细胞光毒性实验： HeLa细胞用10 µM para-Nitroblebbistatin、blebbistatin处理或不作处理。然后用蓝光（480 ± 10 nm，能量密度 3.3 µJ µm⁻²）照射15分钟。照射后，通过洗涤去除抑制剂。细胞再孵育18小时，然后用台盼蓝染色。在光学显微镜下计数活的（未染色）、死的（蓝色）和形态缺陷的细胞。[1] 长期活细胞成像： 用50 µM para-Nitroblebbistatin 或blebbistatin处理表达EGFP-α-微管蛋白和mCherry-H2B的HeLa Kyoto细胞。在共聚焦显微镜下（488 nm和561 nm激发）重复成像12小时，每10分钟获取三个z截面。分析细胞的命运、分裂和形态。[1] HeLa细胞胞质分裂抑制和细胞毒性实验： HeLa细胞用20 µM para-Nitroblebbistatin 或blebbistatin处理，并在黑暗中孵育3天。每天监测细胞数量、存活率（通过台盼蓝拒染法）和多核细胞的比例（通过Hoechst染色和共聚焦显微镜观察）。[1] M2黑色素瘤细胞出泡抑制实验： M2人黑色素瘤细胞用10 µM para-Nitroblebbistatin 或blebbistatin处理。通过显微镜在10分钟内观察细胞出泡情况。[1] 对盘基网柄菌的影响： 用para-Nitroblebbistatin 或blebbistatin处理盘基网柄菌细胞，并评估多核性的诱导情况。[1] |
| 动物实验 |
斑马鱼胚胎的光毒性试验和显微成像[1]
将斑马鱼胚胎与 5 µM blebbistatin 和对硝基Blebbistatin 孵育，并用 470 ± 20 nm 的光照射 10 分钟。照射能量为 0.4 µJ/µm2。对胚胎进行 36 小时的观察，当胚胎出现坏死时，则判定其死亡。使用配备 NeoLumar S 0.8x FWD 80mm 物镜的蔡司 Stereo Lumar.V12 显微镜采集斑马鱼图像。图像采集使用 AxioVision 4.8 软件（图 4B）。 鱼类饲养和胚胎处理[1] 使用转基因 Tg(−8.0cldnb:lynEGFP)zf106 (cldn:gfp) 鱼品系。对于blebbistatin和对硝基blebbistatin处理，将1日龄（dpf）胚胎去除卵膜，并置于20孔板中，加入指定浓度的试剂，试剂用标准E3胚胎培养基稀释。本研究中使用的所有方案均已获得匈牙利国家食品链安全办公室的批准（许可证号：XIV-I-001/515-4/2012）。 斑马鱼光毒性试验：将受精后3天（dpf）的斑马鱼幼体用10 µM对硝基blebbistatin或blebbistatin处理。然后用蓝光（470 ± 20 nm，能量密度0.4 µJ µm⁻²）照射10分钟。处理后监测36小时内的死亡率。 [1] 斑马鱼发育表型分析：将表达后侧线原基中绿色荧光蛋白（GFP）的转基因斑马鱼胚胎（1日龄，cldnb:gfp）用递增浓度的对硝基blebbistatin或blebbistatin处理。孵育24小时后（2日龄），对胚胎进行麻醉，并在荧光立体显微镜下观察（激发波长470 ± 20 nm），以评估后侧线原基的迁移前沿和体型形态。监测36小时内的死亡率。文中未详细说明用于药物溶解的具体载体或溶剂。[1] |
| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
对硝基布比司他汀（para-Nitroblebbistatin）对HeLa细胞无光毒性作用。经蓝光照射并孵育18小时后，对硝基布比司他汀处理的细胞的死亡率和形态与未处理的对照组无明显差异，而布比司他汀则导致大量细胞死亡和形态缺陷。[1] 对硝基布比司他汀对HeLa细胞无细胞毒性。在黑暗条件下用20 µM对硝基布比司他汀孵育3天后，细胞死亡率与DMSO对照组相似，且细胞形态未受损。相比之下，在相同条件下，布比司他汀处理导致90%的细胞在3天内死亡，且存活细胞出现严重的形态缺陷。 [1]
在斑马鱼幼体中，用 10 µM 对硝基布莱比斯他汀处理后进行蓝光照射，36 小时后的死亡率为 18 ± 10%，显著低于相同条件下布莱比斯他汀造成的 86 ± 5% 的死亡率。[1] 在黑暗条件下（未照射），用 10 µM 对硝基布莱比斯他汀处理斑马鱼胚胎 36 小时，其死亡率与未处理的对照组相似。相比之下，在相同的黑暗条件下，用 10 µM 布莱比斯他汀处理的所有胚胎均死亡，这凸显了布莱比斯他汀固有的细胞毒性。[1] 对硝基布莱比斯他汀对盘基网柄菌细胞没有细胞毒性作用。[1] |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
blebbistatin 是一种常用的分子工具，可用于体外和体内特异性抑制多种肌球蛋白 II 亚型。尽管 blebbistatin 应用广泛，但其水溶性差（在水性缓冲液中低于 10 μM）和对蓝光敏感限制了其应用。蓝光照射会导致分子发生光转化，除了其细胞毒性外，还会引起严重的细胞光毒性。此外，blebbistatin 在浓度高于 10 μM 的水基介质中会形成不溶性聚集体，并具有极高的荧光强度和对不同类型表面的高黏附性，这限制了其在实验中的应用。本文报道了一种高溶解度（在水性缓冲液中为 440 μM）、无荧光且光稳定的 C15 氨基取代的 blebbistatin 衍生物，称为对氨基 blebbistatin。重要的是，在 HeLa 细胞和斑马鱼胚胎上实验证明，该衍生物既无光毒性也无细胞毒性。此外，对氨基blebbistatin具有与blebbistatin或对硝基blebbistatin类似的肌球蛋白II抑制特性（不要与C7取代的硝基blebbistatin混淆），已在兔骨骼肌肌球蛋白S1以及M2和HeLa细胞上进行了测试。由于其溶解度和光化学特性显著提高，且无光毒性或细胞毒性，对氨基blebbistatin可能成为blebbistatin的可行替代品，尤其是在需要高浓度抑制剂或蓝光照射的应用中。[Sci Rep. 2016年5月31日;6:26141.]
对硝基blebbistatin是blebbistatin的C15硝基衍生物，其合成旨在克服母体化合物的主要局限性（光毒性、细胞毒性、荧光、光敏性），同时保持其对肌球蛋白II的抑制特异性和效力。[1] 与blebbistatin相比，对硝基blebbistatin的主要优势在于：1）荧光强度大幅降低（发射强度低于blebbistatin的1%），从而避免了与GFP等常用荧光探针的干扰； 2) 在蓝光照射下具有高光稳定性；3) 无光毒性；4) 在黑暗中无固有细胞毒性。[1] 该研究得出结论，对硝基blebbistatin是blebbistatin的理想且完全的替代品，可用于研究肌球蛋白II在生理、发育和细胞生物学研究中的特定作用，无论是在体外还是体内。[1] |
| 分子式 |
C18H15N3O4
|
|---|---|
| 分子量 |
337.329404115677
|
| 精确质量 |
337.106
|
| 元素分析 |
C, 64.09; H, 4.48; N, 12.46; O, 18.97
|
| CAS号 |
1621326-32-6
|
| PubChem CID |
102361739
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| 外观&性状 |
Yellow to orange solid powder
|
| LogP |
2.2
|
| tPSA |
98.7
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
1
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
5
|
| 可旋转键数目(RBC) |
1
|
| 重原子数目 |
25
|
| 分子复杂度/Complexity |
608
|
| 定义原子立体中心数目 |
1
|
| SMILES |
O[C@]12C(C3C=C(C)C=CC=3N=C1N(C1C=CC(=CC=1)[N+](=O)[O-])CC2)=O
|
| InChi Key |
KAUXNLHXGQGFOS-GOSISDBHSA-N
|
| InChi Code |
InChI=1S/C18H15N3O4/c1-11-2-7-15-14(10-11)16(22)18(23)8-9-20(17(18)19-15)12-3-5-13(6-4-12)21(24)25/h2-7,10,23H,8-9H2,1H3/t18-/m1/s1
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| 化学名 |
(3aS)-3a-hydroxy-6-methyl-1-(4-nitrophenyl)-2,3-dihydropyrrolo[2,3-b]quinolin-4-one
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| 别名 |
para-nitroblebbistatin; p-Nitroblebbistatin; 1621326-32-6; CHEMBL4162111; (3aS)-3a-hydroxy-6-methyl-1-(4-nitrophenyl)-2,3-dihydropyrrolo[2,3-b]quinolin-4-one; (3aS)-1,2,3,3a-tetrahydro-3a-hydroxy-6-methyl-1-(4-nitrophenyl)-4H-pyrrolo[2,3-b]quinolin-4-one; SCHEMBL23917202; TQR0306;
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : ~22 mg/mL (~65.22 mM)
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.9645 mL | 14.8223 mL | 29.6446 mL | |
| 5 mM | 0.5929 mL | 2.9645 mL | 5.9289 mL | |
| 10 mM | 0.2964 mL | 1.4822 mL | 2.9645 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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