PD-161570

FGFR1 (IC50 = 39.9 nM); FGFR1 (Ki = 42 nM); FGFR1 autophosphorylation (IC50 = 622 nM); PDGFRβ (IC50 = 262 nM); PDGFR (IC50 = 310 nM); EGFR (IC50 = 240 nM); c-Src (IC50 = 44 nM); TGF-β Receptor

以剂量依赖性方式，用 PD-161570（化合物 6c；0.1-1 µM；第 1-8 天；VSMC）治疗可抑制 PDGF 刺激的血管平滑肌细胞的增殖，第 8 天的 IC50 为 0.3 µM [ 1]。当人卵巢癌细胞 (A121(p)) 和 Sf9 昆虫细胞过度表达人 FGF-1 受体时，PD-161570 会抑制 FGF-1 受体的组成型磷酸化，从而阻止 A121(p) 细胞在培养物中生长[2 ]。 PD-161570 可有效抑制碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 介导的血管生成 [4]。

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通过直接的合成努力，我们发现了一种小分子，它是人类FGF-1受体酪氨酸激酶的40纳摩尔抑制剂。1-叔丁基-3-[6-(2,6-二氯苯基)-2-(4-二乙氨基丁基氨基)-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-脲（PD 161570）对FGF-1受体（IC50 = 40 nM）的选择性分别比PDGFβ受体（IC50 = 262 nM）或EGF受体（IC50 = 3.7微摩尔）酪氨酸激酶高出约5倍和100倍。此外，PD 161570抑制了人类卵巢癌细胞（A121(p)）和过表达人类FGF-1受体的Sf9昆虫细胞中FGF-1受体的组成性磷酸化，并阻断了A121(p)细胞在培养中的生长。这些结果表明，这种新型合成抑制剂具有纳摩尔级的效力和对FGF-1受体酪氨酸激酶的特异性。[2]

AZD0530和TAK 165的体内治疗效果[3]
接下来，评估这些候选药物对FOP模型小鼠的治疗效果。我们关注AZD0530和TAK 165，因为它们适用于体内实验（Hennequin等人，2006，Nagasawa等人，2006）。此前，我们通过Dox给药产生了有条件表达hFOP-ACVR1（R206H）的FOP模型小鼠，并通过使用心脏毒素（CTX）的肌肉损伤产生HO（Hino等人，2017）。腹腔注射AZD0530或TAK 165显著抑制了这些小鼠的HO（图5A-5C）。在CTX注射部位，我们观察到藏红O（酸性蛋白多糖，软骨细胞的细胞外基质蛋白）、von Kossa（钙沉积）和COL1（骨标志物）的阳性染色（图5D，载体）。另一方面，给予AZD0530或TAK 165的小鼠似乎对von Kossa或COL1的阳性染色较少（图5D，AZD0530和TAK 165）。与赋形剂相比，服用AZD0530或TAK 165的小鼠体重变化没有明显差异（图5E）。这些观察结果表明，AZD0530和TAK 165能有效抑制FOP模型小鼠的HO。这些化合物的治疗作用也在使用WT小鼠的BMP-7诱导的HO模型中得到了证实（图S3）。此外，我们验证了AZD0530和TAK 165是否有可能在体内抑制FOP患者来源细胞的HO。我们之前报道了一种基于人类FOP iPSC的体内模型（Hino等人，2015，Hino等，2017）。在这种人源化FOP模型中，将FOP-iMSCs和激活素A表达细胞移植到小鼠体内可诱导FOP患者来源的异位骨。值得注意的是，AZD0530或TAK 165的给药显著抑制了这些小鼠的HO（图6A-6C）。在服用AZD0530或TAK 165的小鼠中，肥大软骨细胞（基于藏红O和von Kossa染色）和von Kossa-和COL1阳性骨区域似乎较少（图6D）。由于在AZD0530和TAK 165治疗组中观察到大量抗人特异性波形蛋白阳性细胞（图6D），我们可以得出结论，这些化合物的治疗作用不是由于人移植细胞的死亡，而是由于HO的抑制。在这些实验中，AZD0530和TAK 165给药均未降低体重（图5E、6E和S3D），所用剂量与先前研究中的剂量相当（Hennequin等人，2006，Nagasawa等人，2006）。TAK 165尤其不会损害正常软骨细胞的软骨生成（图S4A-S4C）、体内正常骨骼发育（图S4D和S4E）或体外伤口愈合（图S4F和S4G）。因此，我们得出结论，HO抑制主要不是由毒性引起的，尽管进一步的体内评估可能更可取。总之，AZD0530和TAK 165是有前景的候选药物，因为它们除了抑制FOP模型小鼠的HO外，还在体内抑制FOP患者来源细胞的HO。

蛋白酪氨酸激酶测定[2]
使用全长FGF-1、PDGFβ和EGF受体酪氨酸激酶在总体积为100μl的溶液中进行检测，该溶液含有25 mM Hepes缓冲液（pH 7.4）、150 mM NaCl、10 mM MnCl2、0.2 mM原钒酸钠、750μg/ml的谷氨酸和酪氨酸的无规共聚物（4:1）、不同浓度的抑制剂和60-75 ng的酶，如前所述32、33。通过加入[γ-32P]ATP（50μM ATP，每次孵育含0.4μCi[γ-32P-]ATP）和在25°C下孵育10分钟的样品来引发反应。通过加入30%三氯乙酸（TCA）和将材料沉淀到玻璃纤维过滤垫上来终止反应。用15%TCA洗涤过滤器三次，通过在Wallac 1250β板读数器中计数过滤器上保留的放射性来确定[32P]掺入谷氨酸酪氨酸聚合物底物的情况。非特异性活性是指在没有酶的情况下孵育样品后，过滤器上保留的放射性。比活性被确定为总活性（酶加缓冲液）减去非特异性活性。以图形方式确定抑制特定酶活性50%的化合物浓度（IC50）。为了测定ATP动力学，测定条件与上述相同，除了在不存在或存在单一浓度的PD 161570的情况下加入不同浓度的ATP，以生成ATP浓度曲线。通过非线性回归分析获得PD 161570的Ki测定值，以将抑制数据拟合到描述不同类型抑制的方程中。

细胞增殖测定[1]
细胞类型：血管平滑肌细胞 (VSMC)
测试浓度：0.1 µM、0.3 µM、1 µM
孵育时间：1天、3天、6天、8天
实验结果：剂量依赖性抑制VSMC增殖章节8天IC50为 0.3 µM。

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细胞生长试验[2]
将A121（p）人卵巢癌细胞以每孔10000个细胞的速度接种在0.5ml RPMI-1640/10%FBS的24孔板中。24小时后，去除补充血清的培养基，彻底洗涤细胞，然后如上所述将其保持在无血清培养基中<每隔一天加入PD 161570、PD 153035或CGP 53716与bFGF（25ng/ml）或抑制剂载体一起进行三次细胞培养。在药物暴露后第1、3、5和7天通过库尔特计数法测量细胞数量。

体内实验 [3]
将 hFOP-ACVR1 条件性转基因小鼠（Beard 等，2006；Hino 等，2017；Ohnishi 等，2014；Yamada 等，2013）、BMP-7 诱导的 HO 模型小鼠（Hino 等，2017）和移植了 FOP-iMSCs 的激活素 A 诱导的 HO 模型小鼠（Hino 等，2017）腹腔注射 5 mg/kg AZD0530、TAK 165 或雷帕霉素（每日一次，每周五次），并按照先前描述的方法进行分析（Hino 等，2017）。

[1]. Structure-activity relationships for a novel series of pyrido[2,3-d]pyrimidine tyrosine kinase inhibitors. J Med Chem. 1997 Jul 18;40(15):2296-303.

[2]. Inhibition of FGF-1 receptor tyrosine kinase activity by PD 161570, a new protein-tyrosine kinase inhibitor. Life Sci. 1998;62(2):143-50.

[3]. An mTOR Signaling Modulator Suppressed Heterotopic Ossification of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva. Stem Cell Reports. 2018 Nov 13;11(5):1106-1119.

[4]. Pharmacologic characterization of a kinetic in vitro human co-culture angiogenesis model using clinically relevant compounds. J Biomol Screen. 2013 Dec;18(10):1234-45.

通过筛选成纤维细胞生长因子受体 (FGFr) 和血小板衍生生长因子受体 (PDGFr) 酪氨酸激酶抑制剂的化合物库，开发出了一系列新型的 ATP 竞争性吡啶并[2,3-d]嘧啶类酪氨酸激酶抑制剂。最初的先导化合物 1-[2-氨基-6-(2,6-二氯苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-3-叔丁基脲 (4b，PD-089828) 被发现是一种广谱酪氨酸激酶抑制剂。化合物 4b 对 PDGFr、FGFr、EGFR 和 c-src 酪氨酸激酶的抑制 IC50 值分别为 1.11、0.13、0.45 和 0.22 μM。后续的构效关系研究合成了一系列新的类似物，与最初的先导化合物相比，这些类似物具有更高的效力、溶解度和生物利用度。例如，在化合物 4b 的 2 位引入 [4-(二乙氨基)丁基]氨基侧链，得到化合物 6c，其效力和生物利用度均得到增强。化合物 6c 能抑制 PDGF 刺激的血管平滑肌细胞增殖，IC50 值为 0.3 μM。此外，将化合物 4b 中的 6-(2,6-二氯苯基) 部分替换为 6-(3',5'-二甲氧基苯基) 官能团，得到一种高选择性的 FGFr 酪氨酸激酶抑制剂 4e。化合物 4e 对 FGFr 酪氨酸激酶的抑制 IC50 为 0.060 μM，而该化合物 (4e) 对 PDGFr、FGFr、EGFR、c-src 和 InsR 酪氨酸激酶的抑制 IC50 均大于 50 μM。[1] 进行性骨化性纤维发育不良 (FOP) 是一种罕见且难治性疾病，其特征是通过软骨内成骨形成骨外骨。FOP 患者携带 ACVR1 的功能获得性突变 (FOP-ACVR1)，ACVR1 是骨形态发生蛋白的 I 型受体。尽管进行了大量研究，但目前尚无获批用于治疗 FOP 的药物。在此，我们利用稳定表达 FOP-ACVR1 的软骨生成细胞系 ATDC5，开发了一种高通量筛选 (HTS) 系统，用于研究 FOP-ACVR1 的组成型激活。经过对 5000 种小分子化合物的高通量筛选 (HTS)，我们鉴定出两种先导化合物，它们能够有效抑制 FOP 患者来源的诱导多能干细胞 (FOP-iPSCs) 的软骨形成增强，并抑制多种模型小鼠（包括 FOP-ACVR1 转基因小鼠和利用 FOP-iPSCs 构建的 HO 模型小鼠）的异位骨化 (HO)。此外，我们发现其中一种先导化合物是 mTOR 信号通路调节剂，能够间接抑制 mTOR 信号通路。我们的研究结果表明，这些先导化合物有望用于未来的药物重定位和 mTOR 信号通路机制的研究。[3]血管生成是指从已存在的血管形成新的血管，它涉及多种细胞类型协同作用，促使内皮细胞增殖、迁移并分化形成微血管阵列。在病理条件下，微环境的变化会导致血管生成异常。以往的体外血管生成实验主要研究血管生成过程的各个方面，结果往往不稳定、难以量化，且临床相关性有限。本文描述了一种动力学、定量化的共培养血管生成模型，并证实了其与体内药理学的相关性。与体内血管生成类似，人脐静脉内皮细胞与正常人真皮成纤维细胞的共培养体系对多种细胞因子仍然敏感，导致管状结构形成随时间推移呈浓度依赖性刺激。使用选择性血管内皮生长因子（VEGF）拮抗剂阿昔替尼治疗，可抑制VEGF介导的管状结构长度和分支点形成，并且与之前的研究结果一致，阿昔替尼对VEGF的抑制作用优于碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。相反，FGFR-1选择性化合物PD-161570对bFGF介导的血管生成抑制作用更强。这些结果展示了该模型系统的细胞因子动力学、选择性药理学和转化应用。最后，将定量血管生成生物学与动态、活体内容成像相结合，突显了在药物发现研究中使用经过验证的体外模型的重要性。[4]

C26H35CL2N7O

532.514

531.228

C, 58.64; H, 6.63; Cl, 13.31; N, 18.41; O, 3.00

192705-80-9

5328135

Light yellow to yellow solid powder

157 °C

6.151

101.79

3

6

11

36

665

0

MKVMEJKNLUWFSQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C26H35Cl2N7O/c1-6-35(7-2)14-9-8-13-29-24-30-16-17-15-18(21-19(27)11-10-12-20(21)28)23(31-22(17)32-24)33-25(36)34-26(3,4)5/h10-12,15-16H,6-9,13-14H2,1-5H3,(H3,29,30,31,32,33,34,36)

1-tert-butyl-3-[6-(2,6-dichlorophenyl)-2-[4-(diethylamino)butylamino]pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-yl]urea

PD-161570; 192705-80-9; PD-161,570; PD 161,570; N-[6-(2,6-Dichlorophenyl)-2-[[4-(diethylamino)butyl]amino]pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-yl]-N'-(1,1-dimethylethyl)urea; pd161,570; CHEMBL45827; 1-(tert-butyl)-3-(6-(2,6-dichlorophenyl)-2-((4-(diethylamino)butyl)amino)pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-yl)urea; 1-tert-butyl-3-[6-(2,6-dichlorophenyl)-2-[4-(diethylamino)butylamino]pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-yl]urea; PD161570; PD 161570

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~33.33 mg/mL (~62.59 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。