NP1192

NAT10 (N-acetyltransferase 10); E3 ligase

NAT10 降解： 在 SiHa 细胞中，NP1192 在 1.25、2.5、5 和 10 μM 浓度下诱导的 NAT10 降解率分别为 28%、32%、40% 和 43%，在 20 μM 浓度下处理 36 小时后达到最高 69% 的降解率。在鼠源 U14 宫颈癌细胞中，处理 36 小时后 NAT10 蛋白含量降低近 70%。即使在高达 20 μM 的浓度下，NP1192 也未表现出经典的“钩状效应”[1]。
与 Remodelin 的比较： NP1192 在降低 CCA 细胞活力方面效果显著优于 Remodelin，其在 SiHa 细胞中的 IC50 值比 Remodelin 低 26.8%（NP1192 的 IC50 = 7.814 μM，Remodelin 为 10.67 μM）。与 Remodelin 相比，NP1192 还表现出更优越的抗增殖和抗侵袭效果 [1]。
降解机制： 与蛋白酶体抑制剂 MG132 共处理可显著阻断 NP1192 介导的 NAT10 降解，而溶酶体抑制剂巴弗洛霉素 A1 则无明显影响。这证实 NP1192 是通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）而非溶酶体途径促进 NAT10 降解的 [1]。
对 HIF-1α 和 PD-L1 的影响： NP1192 处理降低了 HIF-1α 蛋白水平，并导致 PD-L1 显著下调。NAT10 敲低或 NP1192 处理导致 HIF1A mRNA 稳定性下降，并减少了整体新生蛋白翻译。acRIP-qPCR 证实，NP1192 降低了 HIF1A mRNA 上的 ac4C 修饰 [1]。
对糖酵解和代谢的影响： NP1192 处理显著降低了 SiHa 和 U14 细胞中的乳酸水平，减少了葡萄糖摄取，同时 ATP 产量显著增加，表明代谢转向氧化磷酸化。JC-1 荧光染色显示红/绿比率降低，支持线粒体活性增强。Seahorse 细胞外流量分析表明，与对照组相比，NP1192 处理的 CCa 细胞的糖酵解能力仍然显著受损 [1]。
对细胞周期、增殖和侵袭的影响： NP1192 处理导致 SiHa 细胞周期阻滞（细胞周期相关通路富集，特别是细胞分裂和 G1/S 转换），并降低了集落形成和侵袭能力（Transwell 实验）[1]。
在患者来源类器官 (PDO) 中的活性： NP1192 处理对正常人上皮包皮成纤维细胞 (HFF-1) 类器官的活力影响甚微，但对癌症类器官表现出明确的剂量依赖性抑制作用，对卵巢癌 (OV)、宫颈癌 (CESC) 和胶质母细胞瘤 (GBM) 类器官的 IC50 值分别为 9.947 μM、3.048 μM 和 13.76 μM [1]。
耐药谱： 生成了 Remodelin 耐药的 SiHa 细胞，但文献正文未明确提供 NP1192 的相对耐药指数 (RI)。RI 定义为耐药细胞与亲本细胞 IC50 的比值 [1]。

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NP1192（0-20 μM，24-48 小时）通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）而非溶酶体途径，以剂量和时间依赖的方式诱导 SiHa（人）和 U14（小鼠）宫颈癌细胞系中 NAT10 的降解[1]。NP1192（36 小时）抑制宫颈癌（SiHa）细胞的生长，IC50 值为 7.814 μM（耐药细胞中为 76.2 μM），并且在类器官中也显示出剂量依赖性疗效，对卵巢癌（OV）、宫颈癌（CESC）和胶质母细胞瘤（GBM）类器官的 IC50 值分别为 9.947、3.048 和 13.76 μM[1]。 NP1192（20 μM，0-72 小时和 2 周）显著降低了宫颈癌细胞的活力，诱导细胞周期阻滞，并抑制其侵袭和克隆形成能力[1]。NP1192（0.195-50 μM，1-8 天）显著减少了肿瘤模型（卵巢癌、宫颈癌和胶质母细胞瘤）中类器官的大小和数量，而相应的正常类器官未受影响，表明其对非恶性组织的细胞毒性极低[1]。NP1192（20 μM，36 小时）降解了 NAT10，从而抑制了 HIF-1α 的表达，重编程了宫颈癌细胞的缺氧肿瘤微环境和代谢，表现为葡萄糖摄取和乳酸生成减少以及 ATP 水平升高，从而破坏了糖酵解过程[1]。

异种移植模型疗效： 在鼠源宫颈癌 (U14) 异种移植模型中，NP1192（25 mg/kg，瘤周注射，每2天一次）与抗 PD-L1 抗体（2.5 mg/kg，每3天一次）的联用相较于 NP1192 或抗 PD-L1 单药显著抑制了肿瘤生长。该联合治疗还实现了最显著的肿瘤乳酸水平降低（>80%），而 NP1192 单药治疗组则降低了 40% 以上。体内生物发光成像证实了这些发现 [1]。
代谢成像： 18F-FDG-PET-CT 扫描显示，联合治疗组的代谢摄取最低，表明 NP1192 有效抑制了肿瘤代谢活性 [1]。
免疫调节： 对肿瘤组织的免疫流式细胞术分析显示，NP1192 联合抗 PD-L1 阻断治疗组的 CD8+ 肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 频率最高，IFN-γ 产生增加（ELISA），促癌的调节性 T 细胞 (Treg, CD4+CD25+FOXP3+) 显著减少，并且 M2 型巨噬细胞 (CD11b+F4/80+CD206+) 的比例降低，表明向 M1 型巨噬细胞极化转变。NP1192 单药治疗也显著减少了髓源性抑制细胞 (MDSC, CD11b+LY-6G+) [1]。
单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 分析： 对 NP1192 处理小鼠肿瘤样本的 scRNA-seq 分析显示，NP1192 处理显著降低了免疫抑制性 M2 巨噬细胞和 MDSC 的比例，同时增加了 M1 巨噬细胞。在 CD8+ TIL 中，NP1192 处理的肿瘤表现出更少的耗竭性 CD8+ TIL (Tex) 和更多的细胞毒性效应样 CD8+ TIL (Teff，包括产生 IFN-γ 的细胞)。拟时序分析表明 NP1192 可将 CD8+ TIL 维持在一个初始激活状态 [1]。

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NP1192（25 mg/kg，腹腔注射，每2天一次，持续一周）可与抗PD-L1抗体协同作用，在U14-luc异种移植模型中抑制肿瘤生长、抑制糖酵解并增强CD8+ T效应细胞免疫功能[1]。

所提供的文献中未描述针对 NP1192 的直接酶活性实验（例如，使用纯化的 NAT10 酶）。研究重点在于细胞内的降解和下游效应。

用于 NAT10 降解检测的 Western Blot 分析： 用 NP1192 或对照处理 SiHa、U14 和 HFF-1 细胞。使用含蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液提取总蛋白。蛋白在聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到 PVDF 膜上，用牛奶封闭，并与一抗（抗 NAT10、抗 PD-L1、抗 HIF-1α、抗 β-微管蛋白）孵育过夜，随后与二抗孵育。通过化学发光法检测靶蛋白 [1]。
细胞活力 (CCK-8) 实验： 将 NAT10 敲低 SiHa 细胞以及经 DMSO、Remodelin 或 NP1192 处理 36 小时的 SiHa 细胞接种到 96 孔板中（每孔 2000-3000 个细胞）。细胞贴壁后，加入 CCK8 试剂与培养基的 1:10 混合液，孵育 2 小时，在 450 nm 波长处测量吸光度以计算 IC50 值 [1]。
集落形成实验： 将 NAT10 敲低 SiHa 细胞以及经 DMSO、Remodelin 或 NP1192 处理 36 小时的 SiHa 细胞接种到 6 孔板中（每孔 2000-3000 个细胞），孵育至少 2 周。集落用福尔马林固定，结晶紫染色并计数 [1]。
Transwell 侵袭实验： 使用 Matrigel 包被的 Transwell 小室。将 NAT10 敲低 SiHa 细胞以及经 DMSO、Remodelin 或 NP1192 处理 36 小时的 SiHa 细胞重悬于无血清培养基中，加入上室。12 小时后，固定、染色并计数膜下表面的细胞 [1]。
细胞周期流式细胞术分析： 细胞用 70% 乙醇固定，用含 PI 和 RNase A 的溶液处理，并通过流式细胞术分析以确定细胞周期分布 [1]。
mRNA 稳定性实验： 用放线菌素 D (5 μM) 处理 SiHa 和 NAT10-KD SiHa 细胞 0、4 或 8 小时。通过 qPCR 评估 HIF1A mRNA 半衰期的变化 [1]。
新生蛋白合成实验： 细胞用甲醇固定，用 Click-iT Plus OPP 蛋白合成试剂盒染色，并用 DAPI 染色。在共聚焦激光扫描显微镜下观察细胞 [1]。
乳酸、ATP 和 2-NBDG 摄取实验： 用 20 μM NP1192 或 DMSO 处理 SiHa 和 U14 细胞 36 小时。根据试剂盒说明书进行实验，并使用 GraphPad Prism 9 分析数据 [1]。
Seahorse 实验： 用 20 μM NP1192 或 DMSO 处理 SiHa 和 U14 细胞 36 小时。根据 Seahorse XF 糖酵解检测试剂盒手册进行实验 [1]。
JC-1 染色实验： 用 20 μM NP1192 或 DMSO 处理 SiHa 和 U14 细胞 36 小时。根据线粒体膜电位检测试剂盒手册进行实验 [1]。
ROS 染色实验： 用 20 μM NP1192 或 DMSO 处理 SiHa 和 U14 细胞 36 小时。根据 ROS 检测试剂盒手册进行实验 [1]。
acRIP-qPCR： acRIP-qPCR 结果显示，与 DMSO 处理相比，用 20 μM NP1192 处理 36 小时的 SiHa 组和 NAT10 敲低组的 IP/input 百分比降低，表明靶 RNA 上的 ac4C 修饰减少 [1]。
CD8+ T 细胞共培养实验： 从小鼠脾脏中分离新鲜 CD8+ T 细胞，用抗 CD3/CD28 和 IL-2 激活，然后以 10:1 的效应器与靶标比例与 U14 细胞及不同药物共培养 24 小时。通过流式细胞术检测 CD8+ T 细胞亚型。通过基于 CFSE 的细胞毒性、Calcein AM/PI 共染色和 CCK8 实验评估肿瘤细胞杀伤能力。通过 ELISA 测量上清液中的 IFN-γ 和 TNF-α 水平 [1]。

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Western Blot 分析[1]
细胞类型： SiHa、U14 和 HFF-1 细胞
测试浓度： 0、1.25、2.5、5、10 和 20 μM
孵育时间： 24、36 和 48 小时
实验结果： 导致 SiHa（人）和 U14（鼠）CCa 细胞系中总 NAT10 蛋白以剂量和时间依赖的方式显著减少。在SiHa细胞中，浓度分别为1.25、2.5、5和10 μM时，NAT10的降解率分别为28%、32%、40%和43%，在20 μM浓度下处理36小时后降解率最高，达69%，而24小时后降解率仅为20%。在小鼠U14宫颈癌细胞中，36小时后NAT10蛋白含量降低了近70%。即使在浓度高达20 μM时，也未观察到典型的钩状效应。与MG132共同处理时，NAT10的降解作用不显著，而巴弗洛霉素A1对其降解效率没有明显影响。在NAT10低表达的非恶性HFF-1细胞中，NAT10的细胞毒性极低。HIF-1α蛋白水平降低。在缺氧条件下，逆转了缺氧相关基因（如HIF1A和PD-L1）在mRNA和蛋白水平上的诱导。

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细胞增殖实验[1]
细胞类型：SiHa细胞和NAT10敲低SiHa细胞
测试浓度：20 μM
孵育时间：2周
实验结果：导致集落形成能力显著下降，抑制程度仅次于NAT10敲低细胞。

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细胞侵袭实验[1]
细胞类型：SiHa细胞和NAT10敲低SiHa细胞
测试浓度：20 μM
孵育时间： 36 小时
实验结果： 显著抑制了细胞侵袭，穿过基底膜的细胞数量显著减少。

小鼠异种移植模型 (U14 细胞)： 雌性 C57BL/6J 小鼠（6-8 周龄）皮下植入 U14 细胞（每只小鼠 1x10^7 个细胞）。7 天后，小鼠接受以下五种治疗之一：DMSO；Remodelin（25 mg/kg）；抗 PD-L1 抗体（2.5 mg/kg）；NP1192（25 mg/kg）；或抗 PD-L1 抗体 + NP1192。Remodelin 和 NP1192 每 2 天瘤周注射一次；抗 PD-L1 抗体每 3 天注射一次。每 2 天测量一次肿瘤体积。1 周后处死小鼠，取出肿瘤进行分析 [1]。
体内成像研究： 将稳定表达萤火虫荧光素酶的 U14 细胞植入 C57BL/6J 小鼠体内。肿瘤稳定后，每 2 天注射一次荧光素酶底物，并通过体内成像系统获取荧光值。治疗组同上 [1]。
免疫流式细胞术： 处死后，从异种移植模型中取出肿瘤及瘤周组织，使用免疫流式试剂盒及针对各种免疫细胞标志物的特异性抗体（CD11b、F4/80、CD206、CD86、CD4、CD25、FOXP3、CD45、LY-6G/LY-6C 等）进行分析 [1]。
大鼠药代动力学研究： 雄性 SD 大鼠（180-220 g）口服（10 mg/kg）或静脉注射（2 mg/kg）NP1192。在多个时间点（0.0833、0.25、0.5、1、2、4、6、8 和 24 小时）从尾静脉采集血样。通过 LC-MS/MS 测定药物浓度 [1]。
急性毒性研究： 六周龄雄性 C57BL/6J 小鼠腹腔注射 NP1192，剂量分别为 100、500 和 1000 mg/kg。连续 14 天监测小鼠存活情况 [1]。

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动物/疾病模型： 雌性 C57BL/6J 小鼠（6-8 周龄）皮下注射 U14-luc 细胞[1]
剂量： 25 mg/kg
给药途径： 腹腔注射，每 2 天一次，持续一周
实验结果： 与 DMSO 组相比，25 mg/kg 剂量组肿瘤体积和肿瘤负荷显著降低。与抗 PD-L1 抗体（2.5 mg/kg）联合使用时，肿瘤生长受到显著抑制。与抗 PD-L1 抗体（2.5 mg/kg）联合使用时，肿瘤乳酸水平降低最为显著（>80%）。¹⁸F-FDG PET-CT 成像显示，与抗 PD-L1 抗体联合使用时，肿瘤代谢摄取极低，表明其能有效抑制肿瘤代谢活性。与抗PD-L1阻断剂联合使用时，可增强CD8+效应T细胞群，重塑肿瘤微环境，并增强抗肿瘤免疫力。无论单独使用还是联合使用，均未引起明显的体重减轻或全身毒性。

大鼠药代动力学： 在雄性 SD 大鼠中，口服（10 mg/kg）和静脉注射（2 mg/kg）NP1192 后，测定了药物血浆浓度-时间曲线。具体的 PK 参数（如 T1/2、Cmax、AUC、F%）在原文的补充表 S1 中提供，但正文未详述 [1]。

急性毒性： 在为期 14 天的急性毒性研究中，雄性 C57BL/6J 小鼠腹腔注射 NP1192，剂量分别为 100、500 和 1000 mg/kg。治疗组未观察到明显的体重变化（图 S2）[1]。
对正常细胞/类器官的细胞毒性： NP1192 暴露对正常人上皮包皮成纤维细胞 (HFF-1) 类器官的活力影响很小，表明对非恶性组织的细胞毒性极小 [1]。
脱靶毒性： PROTAC 设计策略旨在减少与小分子抑制剂相关的脱靶毒性，体外和体内评估结果均证实了其良好的安全性 [1]。

[1]. https://pubs.acs.org/action/showCitFormats?doi=10.1021/acscentsci.5c00812&ref=pdf

作用机制 (MOA)： NP1192 是一种 PROTAC，可同时结合 NAT10 和 E3 泛素连接酶（使用泊马度胺作为 E3 配体），导致 NAT10 泛素化并随后被蛋白酶体降解。这种降解剂作用优于 Remodelin 的抑制作用。NAT10 降解消除了其对 RNA 的 ac4C 修饰活性，特别是对 HIF1A mRNA 的修饰，降低了其稳定性和翻译。这导致 HIF-1α 蛋白水平下降，进而抑制缺氧驱动的糖酵解（降低乳酸产生和葡萄糖摄取）并下调 PD-L1 表达。总体效果是逆转免疫抑制性肿瘤微环境 (TME) 并恢复 CD8+ 效应 T 细胞功能 [1]。
与免疫疗法的协同作用： NP1192 与抗 PD-L1 阻断剂协同作用，增强抗肿瘤免疫。联合治疗通过增加 CD8+ Teff 细胞和 M1 巨噬细胞，同时减少 Tex 细胞、Tregs 和 MDSCs，重塑了免疫细胞组成 [1]。
临床潜力： NP1192 被认为是一种有前景的癌症免疫治疗药物，具有双重代谢-免疫策略，可克服缺氧肿瘤中免疫检查点阻断 (ICB) 治疗的耐药性 [1]。

C39H42N8O5S

734.87

2966791-41-1

Typically exists as solids at room temperature

NP-1192; NP 1192

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。