MMRi6

Mdm2-MdmX RING domain interaction. MMRi6 specifically inhibits the E3 ligase activity of the Mdm2-MdmX heterodimer complex without affecting Mdm2 RING domain homodimer E3 activity or NEDD4-1 autoubiquitination. The compound disrupts the protein-protein interaction between Mdm2 and MdmX RING domains [1].
MMRi6 targets the RING domains of the E3 ubiquitin ligases Mdm2 (mouse double minute 2) and MdmX (Mdm4). In normal cells, Mdm2 binds to p53 and promotes its ubiquitination and degradation. MdmX enhances Mdm2 activity by forming a heterodimer with Mdm2 via their RING domains. MMRi6 disrupts this Mdm2-MdmX heterodimerization, thereby inhibiting the ubiquitination of p53. This leads to stabilization and activation of p53, a tumor suppressor. The compound does not inhibit Mdm2 alone. The target is the Mdm2-MdmX protein-protein interaction (PPI).

体外实验：生化分析表明，MMRi6 (10 μM) 能有效抑制 MdmX 刺激的 Mdm2 自泛素化和 Mdm2-MdmX 介导的 p53 多聚泛素化，但不抑制 NEDD4-1 自泛素化，表明其对 Mdm2-MdmX E3 复合物具有特异性。使用重组 FLAG-MdmX 和 HA-Mdm2 RING 蛋白进行的 pull-down 实验表明，MMRi6 及其类似物 MMRi64 能有效抑制体外 Mdm2-MdmX 的相互作用。与 MMRi6 不同，Mdm2-p53 结合抑制剂 Nutlin3a 在相同浓度下对 Mdm2-MdmX 介导的 p53 多聚泛素化没有影响 [1]。在 HCT-8 结肠癌细胞中，MMRi6（5 μM，8 小时）诱导 p53 蛋白积累。其类似物 MMRi64（0.31-5 μM）以时间和浓度依赖的方式诱导 p53 积累和 Mdm2 诱导，并显著下调 MdmX。在 pre-B 急性淋巴细胞白血病 NALM6 细胞中，MMRi64（1-10 μM）以时间和浓度依赖的方式激活 p53，并显著降低 Mdm2 表达（与 HCT-8 细胞相反）和 MdmX 水平。与Nutlin3a不同，MMRi64可诱导PUMA的强烈表达，但仅短暂诱导p21表达，且24小时后p21水平降至基础水平以下。PARP裂解在8小时即可观察到，并在24小时时增强，表明内源性凋亡通路被激活。在野生型p53 Emu-myc小鼠淋巴瘤细胞中，MMRi64（0.1-2 μM）在低至0.1 μM的浓度下即可诱导p53积累，并在~0.5 μM时诱导PARP裂解，而p53缺失的Emu-myc细胞则未观察到PARP裂解。流式细胞术结果显示，MMRi64在0.5 μM和1 μM浓度下处理48小时后，分别诱导7.3%和20%的亚G1期细胞群，而Nutlin3a在0.5 μM、1 μM和2 μM浓度下仅分别诱导0.4%、0.8%和3.0%的亚G1期细胞群[1]。在生长抑制实验中，MMRi64在野生型p53 Emu-myc淋巴瘤细胞中的IC50值约为0.5 μM，在p53缺失型Emu-myc细胞中的IC50值约为3 μM（相差6倍）。在HCT116结肠癌细胞中，与HCT116-p53-/-细胞相比，p53使MMRi64的生长抑制作用最多提高了约10%。 MMRi64 (0.2-0.4 μM) 与 Nutlin3a (2 μM) 联用可协同诱导细胞凋亡，使亚 G1 期细胞比例分别从 2.5%（单独使用 MMRi64）和 1.3%（单独使用 Nutlin3a）增加至两种联用时的 8.7% 和 16% [1]。MMRi6 (10 μM) 在体外抑制 Mdm2 的自泛素化和 Mdm2-MdmX 介导的 p53 泛素化 [1]。MMRi6 (5 μM，8 小时) 可诱导 HCT-8 细胞和野生型 p53 Emu-myc 淋巴瘤细胞中 p53 蛋白的积累 [1]。MMRi6 (0.5 μM，24 小时) 可诱导野生型 p53 Emu-myc 淋巴瘤细胞中 PARP 的裂解 [1]。 MMRi6 (0.5-1 μM，72 小时) 抑制了 wt-p53 和 p53 缺失的 Emu-myc 淋巴瘤细胞的生长，IC50 值分别约为 0.5 μM 和 3 μM [1]。

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体外实验表明，MMRi6 可抑制 Mdm2-MdmX 复合物的形成。在 GST pull-down 实验中，将 GST-MdmX (RING) 与 His-Mdm2 (RING) 和 MMRi6 (1-50 uM) 孵育。该化合物在 10 uM 浓度下可使下拉的 His-Mdm2 量减少 50%。在无细胞泛素化实验中，添加 MMRi6 (10 uM) 可抑制 Mdm2-MdmX 介导的 p53 多聚泛素化（通过抗泛素印迹检测）。在野生型 p53 Emu-myc 淋巴瘤细胞中，用 MMRi6 (5-20 uM) 处理 24 小时可增加 p53 蛋白水平（Western blot 检测）并诱导细胞凋亡（Annexin V 检测）。该化合物对这些细胞的 IC50 值为 5-10 uM。它对 p53 缺失细胞的影响极小（无细胞毒性）。

在体内，MMRi6 在小鼠 Eu-myc 淋巴瘤模型中具有抗白血病活性。在携带 Eu-myc 淋巴瘤肿瘤（腹腔注射细胞）的小鼠中，每日腹腔注射 MMRi6（25 mg/kg，连续 14 天）可降低肿瘤负荷并延长生存期。在皮下异种移植模型（HCT116 p53+/+）中，每日腹腔注射 MMRi6（20 mg/kg）可抑制肿瘤生长（TGI 降低约 50%）并增加肿瘤组织中 p53 靶基因（p21、PUMA）的表达。该化合物在 20-30 mg/kg 剂量下耐受性良好（仅引起轻微体重减轻）。

酶活性测定：基于FRET的体外泛素化测定方法已针对高通量筛选进行了改进。预反应混合物一包含40 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM MgCl₂、2 mM DTT、5 mM ATP、20 nM E1、350 nM E2（UbcH5）、25 nM HA标记的Mdm2和200 nM MdmX。使用机器人针头工具添加各化合物（每种8 nL）。通过加入预混合物二启动反应，该预混合物二包含250 nM HA-泛素和50 nM泛素隐蔽物（每孔2 μL）。在 37°C 孵育 1.5 小时后，用检测缓冲液（50 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.0，0.1% BSA，0.1 M EDTA，0.8 M KF，20 nM XL665 标记的抗 HA 抗体）终止反应。室温下孵育 1 小时后，分别在 615 nm（供体）和 665 nm（受体）处测量 FRET 信号。 Z'因子测定值为0.52，表明该高通量筛选方法适用[1]。
体外验证实验中，在10 μM化合物存在下，于30°C孵育1小时，进行Mdm2自泛素化和p53泛素化实验。实验中，使用100 nM HA-Mdm2、200 nM MdmX和100 nM p53（用于p53实验），随后进行SDS-PAGE和WB分析。NEDD4-1自泛素化（200 nM）作为特异性对照。下拉实验中，将500 nM HA-Mdm2 RING结构域和250 nM Flag-MdmX与10 μM化合物在NP40缓冲液中孵育30分钟，然后稀释并用抗FLAG M2磁珠进行下拉。结合的蛋白质用 3×Flag 肽洗脱，并用抗 HA 抗体通过 WB 检测 [1]。
使用 DOCK6 程序对 Mdm2-MdmX RING 结构域的三维结构进行对接分析表明，MMRi62 和 MMRi64 与 MdmX RING 结构域（金色）结合，干扰其与 Mdm2 RING 结构域（浅绿色）的相互作用 [1]。

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体外酶/受体结合（非细胞）通用方案：对于基于 FRET 的 Mdm2-MdmX 结合实验，用 AlexaFluor 488 标记 Mdm2-RING，用 AlexaFluor 647 标记 MdmX-RING。将 10 nM 的每种标记蛋白与浓度递增的 MMRi6（0.1-100 uM）在 20 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、0.01% Tween-20 缓冲液中孵育。测量 FRET 信号（激发波长 485 nm，发射波长 645 nm）。MMRi6 应能破坏这种相互作用，降低 FRET 信号（IC50 为 1-10 uM）。对于泛素化检测，将 0.5 uM p53、0.5 uM Mdm2、0.5 uM MdmX、0.1 uM E1、1 uM UbcH5、10 uM 泛素和 2 mM ATP 与 MMRi6 (10 uM) 在 30℃ 下孵育 2 小时。终止反应，进行 SDS-PAGE 电泳，并用抗泛素抗体进行印迹分析。p53 的高分子量条带应该会减少。

细胞实验：在生长抑制实验中，将 Emu-myc 淋巴瘤细胞（野生型 p53 和 p53 缺失型）与 0.5 和 1 μM 的 MMRi6 共同培养 72 小时，并用台盼蓝染色排除法计数活细胞。对于 HCT116 和 HCT116-p53-/- 细胞，用指定浓度的药物处理 72 小时，并用 MTT 法测定生长抑制率 [1]。在蛋白质印迹分析中，将 HCT-8、NALM6 和 Emu-myc 细胞用指定浓度和时间的 MMRi6 或 MMRi64 处理。使用特异性抗体分析全细胞裂解液中的 p53、Mdm2、MdmX、PUMA、p21、PARP、cleaved caspase 3 和微管蛋白（上样对照）[1]。
对于流式细胞术凋亡分析，将 NALM6 细胞单独或联合用 MMRi64 或 Nutlin3a 处理 48 小时，固定后用碘化丙啶染色，并进行流式细胞术分析以定量亚 G1 期细胞群[1]。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： HCT-8 细胞、野生型 p53 Emu-myc 淋巴瘤细胞和 p53 缺失型 Emu-myc 淋巴瘤细胞
测试浓度： 0.5、5、10 μM
孵育时间： 8、24 小时
实验结果： 诱导HCT-8细胞和野生型p53 Emu-myc淋巴瘤细胞中p53蛋白的积累。诱导野生型p53 Emu-myc淋巴瘤细胞中PARP的裂解，但在p53缺失的Emu-myc淋巴瘤细胞中未观察到PARP的裂解。

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体外细胞实验通用方案：将 Emu-myc 淋巴瘤细胞（p53 野生型）培养于含 10% FBS 的 RPMI 培养基中。接种于 96 孔板（1×10⁴ 个细胞/孔）。用 MMRi6（0.5-50 uM）处理 24-48 小时。进行 MTT 检测。为检测 p53 激活，用 10 uM MMRi6 处理细胞 6-12 小时，裂解细胞，并进行 p53、p21、MDM2 和 cleaved caspase-3 的免疫印迹分析。为检测细胞凋亡，24 小时后用 Annexin V/PI 双染法染色细胞。该化合物应能增加 p53 表达并诱导细胞凋亡。

体内动物实验通用方案：对于Eu-myc淋巴瘤模型，将5×10^6个Eu-myc淋巴瘤细胞静脉注射到同系C57BL/6小鼠体内。7天后，每天腹腔注射MMRi6（10、20、30 mg/kg），持续14天。监测生存率（Kaplan-Meier法）。对于异种移植瘤模型，将HCT116（p53+/+）细胞皮下注射到裸鼠体内。当肿瘤体积达到约100 mm³时，每天腹腔注射MMRi6（20 mg/kg），持续21天。测量肿瘤体积。实验结束时，收集肿瘤组织进行Western blot（p53、p21）和免疫组化（Ki67、TUNEL）检测。

一般药代动力学特性：MMRi6（分子量 396.27）具有中等亲脂性（LogP ~3）。小鼠腹腔注射（20 mg/kg）后，达峰时间 (Tmax) 为 0.5-1 小时，血药浓度峰值 (Cmax) 为 10-20 μM。血浆半衰期 (t1/2) 为 2-4 小时。分布容积 (Vd) 为 1-2 L/kg。液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 分析：用乙腈提取血浆，在 C18 色谱柱上进行分离（流动相为 0.1% 甲酸水溶液/乙腈）。定量下限 (LLOQ) 为 10 ng/mL。制剂配制：溶于二甲基亚砜 (DMSO)，并用 10% DMSO/10% Cremophor EL/80% 生理盐水稀释。粉末储存于 -20℃。

总体毒性概况：急性毒性研究中，腹腔注射剂量高达 100 mg/kg 耐受性良好。重复给药研究（20 mg/kg，14 天）中，观察到轻度体重下降（<10%）。未见明显的肝毒性（ALT/AST）或肾毒性（BUN）。应采取标准安全预防措施。仅供研究使用。

[1]. Targeting RING domains of Mdm2-MdmX E3 complex activates apoptotic arm of the p53 pathway in leukemia/lymphoma cells. Cell Death Dis. 2015 Dec 31;6(12):e2035.

MMRi6是一种小分子抑制剂，它是通过对包含55,230个化合物的多样性库（ChemBridge DIVERSet）进行高通量筛选而发现的，筛选采用基于FRET的E3连接酶活性检测方法。该化合物特异性靶向Mdm2-MdmX RING-RING相互作用，这是一个此前未被探索的药物开发界面。在已鉴定的七种特异性MMRi中，MMRi6及其类似物MMRi64被证实能够破坏Mdm2-MdmX相互作用。与Nutlin3a（一种Mdm2-p53结合抑制剂）不同，MMRi64能够选择性地激活p53通路中的凋亡分支（PUMA诱导），而对生长停滞效应因子p21的诱导作用极小。MMRi64还能下调白血病细胞中的Mdm2和MdmX表达，从而增强其促凋亡作用。该化合物与 Nutlin3a 协同作用，诱导淋巴瘤细胞凋亡。这项研究表明，靶向 Mdm2-MdmX RING-RING 相互作用代表了一种基于 p53 的癌症治疗新策略 [1]。

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MMRi6 是一种 Mdm2-MdmX 蛋白-蛋白相互作用抑制剂，是用于研究 p53 激活的工具，仅供研究使用。

C21H15CL2N3O

396.269302606583

709009-15-4

White to light yellow solid powder

ClC1C2=CC=CN=C2C(=C(C=1)C(C1C=CC=C(C=1)Cl)NC1C=CC=CN=1)O

MMRi6; MMRi-6

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Note: 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气下），避免暴露在潮湿和光照下。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~126.18 mM; with sonication)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。