EGFR

体外活性：BIBW2992 对野生型和突变型 EGFR 和 HER2 均显示出有效的活性。它针对 L858R EGFR 的效力与吉非替尼相似，但针对吉非替尼耐药的 L858R-T790M EGFR 双突变体的活性高出约 100 倍。 BIBW2992 对体内 EGFR 和 HER2 磷酸化表现出有效的作用。在所有测试的细胞类型中，例如表达 wt EGFR 的人表皮样癌细胞系 A431、转染 wt HER2 的鼠 NIH-3T3 细胞以及乳腺癌细胞系 BT，其与参考化合物（例如 Lapatinib 等）相比均具有优势-474和胃癌细胞系NCI-N87，表达内源性HER2。激酶测定：EGFR 激酶：每个 100 µL 酶反应包含 10 µL 抑制剂（溶于 50% Me2SO）、20 µL 底物溶液（200 mM HEPES pH 7.4、50 mM 醋酸镁、2.5 mg/mL 聚 (EY)、5 µg /mL bio-pEY) 和 20 µL 酶制剂。添加 50 µL 用 10 mM MgCl2 制成的 100 µM ATP 溶液开始酶促反应。测定在室温下进行 30 分钟，并通过添加 50 µL 终止溶液（20 mM HEPES pH 7.4 中的 250 mM EDTA）终止。将 100 µL 转移至链霉亲和素包被的微量滴定板，在室温下孵育 60 分钟后，用 200 µL 洗涤液（50 mM Tris，0.05% Tween20）洗涤板。将 100 µL 等份的 HRPO 标记的抗 PY 抗体 (PY20H Anti-Ptyr:HRP) 250 ng/mL 添加到孔中。孵育 60 分钟后，用 200 µL 洗涤液洗涤板 3 次。然后使用 100 µL TMB 过氧化物酶溶液（A:B= 1:1）对样品进行显色。 10分钟后停止反应。将板转移至 ELISA 读数器并在 OD450nm 处测量消光。 HER2-IC 酶：在存在或不存在连续抑制剂稀释的情况下（在 50% Me2SO 中进行）测定酶活性。每个 100 µL 反应液包含与 EGFR 激酶测定所述类似的成分，但添加了 1000 µM Na3VO4。添加 50 µL 500 µM ATP 溶液（用 10 mM 醋酸镁配制），开始酶促反应。设置酶的稀释度，使得磷酸盐掺入bio-pEY 与时间和酶量成线性关系。将酶制剂稀释在 20 mM HEPES pH 7.4、130 mM NaCl、0.05% Triton X-100、1 mM DTT 和 10% 甘油中。测定在室温下进行 30 分钟，并通过添加 50 µL 终止溶液终止。 Src 激酶测定：每个 100 µL 反应液含有 10 µL 抑制剂（溶于 50% Me2SO）、20 µL 酶制剂、20 µL 底物溶液（补充有 1000 µM Na3VO4）。添加 50 µL 用 10 mM 醋酸镁制成的 1000 µM ATP 溶液开始酶促反应。 BIRK 激酶测定：使用 250 mM Tris pH 7.4、10mM DTT、2.5 mg/mL 聚 (EY)、5 mg/mL 生物 pEY 作为底物溶液，并通过添加 50 µL 2 mM ATP 溶液启动酶反应由 8 mM MnCl2、20 mM 乙酸镁制成。 VEGF2 和 HGFR 激酶测定：测定在室温下进行 20 分钟，并通过添加 10 µL 5% H3PO4 终止。然后使用 96 孔过滤器伴侣通用收集器将沉淀物捕获到 GF/B 过滤器上。彻底清洗后，将滤板在 50°C 下干燥 1 小时，密封并使用 TopCount™ 或 Microbeta b counter™ 进行闪烁计数来确定掺入的放射性。 细胞测定：将 1 × 104 个 NSCLC 细胞转移到每个孔中96 孔板并在无血清培养基中培养过夜，用于 EGFR 磷酸化测定。第二天添加 BIBW2992 后，将板在 37°C 下孵育 1 小时。 EGF 刺激使用 100 ng/mL 在室温下进行 10 分钟。用冰冷的 PBS 洗涤细胞，每孔用 120 μL HEPEX 缓冲液提取，并在室温下摇动 1 小时。每孔全部 2 × 104 个细胞用于 HER2 磷酸化测定。链霉亲和素预包被板用封闭缓冲液中 1:100 稀释的抗 EGFR-生物素和 c-erb2/HER2 癌蛋白 Ab-5（克隆 N24）-生物素包被。然后将细胞提取物转移至抗体包被的孔中并在室温下孵育1小时。消光在 450 nm 处测量。

非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)激酶结构域的遗传改变与对小分子酪氨酸激酶抑制剂治疗的敏感性有关。尽管第一代可逆的atp竞争抑制剂在含有EGFR突变的肺腺癌肿瘤中显示出令人鼓舞的临床反应，但随着时间的推移，几乎所有患者都对这些抑制剂产生了耐药性。这种对第一代EGFR抑制剂的耐药性通常与EGFR激酶结构域获得性T790M点突变或HER3下游信号通路上调有关。克服这些耐药机制，以及对由EGFR突变亚群驱动的可逆性EGFR抑制剂的原发性耐药，将是开发有效靶向治疗方案的必要条件。在这里，我们发现BIBW2992是一种苯胺-喹唑啉，旨在不可逆地结合EGFR和HER2，有效地抑制野生型和活化的EGFR和HER2突变体的激酶活性，包括厄洛替尼耐药亚型。与此活性一致，BIBW2992在基于等基因细胞的实验中抑制转化，抑制癌细胞系的存活，并在异种移植和转基因肺癌模型中诱导肿瘤消退，其活性优于厄洛替尼。这些发现鼓励在携带EGFR或HER2癌基因的肺癌患者中进一步检测BIBW2992。[1]

Four bitransgenic mice on continuous doxycycline diets for more than 6 weeks were subjected to MRI (Figure 4) to document the lung tumor burden. Afatinib (BIBW2992) formulated in 0.5% methocellulose-0.4% polysorbate-80 (Tween 80) was administered orally by gavage at 20 mg/kg once daily dosing schedule. Rapamycin was dissolved in 100% ethanol, freshly diluted in 5% PEG400 and 5% Tween 80 before treatment and administered by intraperitoneal injection at 2 mg/kg daily dosage. Mice were monitored by MRI every 1 or 2 weeks to determine reduction in tumor volume and killed for further histological and biochemical studies after drug treatment. For immunohistochemistry staining, three tumor-bearing mice in each group were treated three times with either Afatinib (BIBW2992) (20 mg/kg) alone or Afatinib (BIBW2992) (20 mg/kg) and rapamycin 2 mg/kg at 24 h intervals and killed 1 h after the last drug delivery. All the mice were kept on the doxycycline diet throughout the experiments. Littermates were used as controls.

[1]. BIBW2992, an irreversible EGFR/HER2 inhibitor highly effective in preclinical lung cancer models. Oncogene. 2008 Aug 7;27(34):4702-11.

C24H25CLFN5O3

717.184

C, 53.52; H, 4.63; Cl, 4.94; F, 2.65; N, 9.75; O, 24.51

439081-17-1

Afatinib;850140-72-6

10163178

Typically exists as solid at room temperature

3.6

88.6

2

8

8

34

702

1

CN(C)C/C=C/C(=O)NC1=C(C=C2C(=C1)C(=NC=N2)NC3=CC(=C(C=C3)F)Cl)O[C@@H]4CCOC4

ULXXDDBFHOBEHA-QDLOVBKTSA-N

InChI=1S/C24H25ClFN5O3/c1-31(2)8-3-4-23(32)30-21-11-17-20(12-22(21)34-16-7-9-33-13-16)27-14-28-24(17)29-15-5-6-19(26)18(25)10-15/h3-6,10-12,14,16H,7-9,13H2,1-2H3,(H,30,32)(H,27,28,29)/b4-3+/t16-/m1/s1

(E)-N-[4-(3-chloro-4-fluoroanilino)-7-[(3R)-oxolan-3-yl]oxyquinazolin-6-yl]-4-(dimethylamino)but-2-enamide

Afatinib Impurity C; 945553-91-3; (R)-Afatinib; (E)-N-[4-(3-chloro-4-fluoroanilino)-7-[(3R)-oxolan-3-yl]oxyquinazolin-6-yl]-4-(dimethylamino)but-2-enamide; 439081-17-1; (R,E)-N-(4-((3-Chloro-4-fluorophenyl)amino)-7-((tetrahydrofuran-3-yl)oxy)quinazolin-6-yl)-4-(dimethylamino)but-2-enamide; CHEMBL2347958; (2E)-N-[4-[(3-Chloro-4-fluorophenyl)amino]-7-[[(3R)-tetrahydro-3-furanyl]oxy]-6-quinazolinyl]-4-(dimethylamino)-2-butenamide;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。