BT424

Hematopoietic cell kinase (HCK)
HCK (hematopoietic cell kinase), a Src family tyrosine kinase. BT424 is a specific HCK inhibitor that blocks HCK activity, thereby modulating downstream signaling pathways involved in macrophage activation, inflammation, and fibrosis.

与其他SFK相比，BT424对HCK的抑制选择性更高，EC50为12 μM（图7B、C、D）。研究人员对BT424进行了细胞毒性研究，结果表明，在50 μM浓度下，BT424对RAW264.7巨噬细胞和足细胞均无细胞毒性（图7E、F）。研究人员通过将100 mM的DMSO储备液用水稀释至25 μM，并在室温下放置24小时，进行了BT424的稳定性测试。HPLC分析显示，BT424未发生降解（降解率低于3%）。这些数据表明，研究人员开发了一种选择性更高的HCK抑制剂BT424，它可能是一种潜在的靶向先导化合物。[1]

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HCK抑制剂BT424可降低巨噬细胞的M1极化、增殖和迁移。[1]
首先，研究人员测试了BT424对BMDM自噬的影响。 BT424不溶于水，研究人员将其配制成100 mM的DMSO储备液，然后用培养基稀释至25 μM用于细胞处理。研究发现，BT424处理可提高自噬活性，表现为LC3II/LC3I比值升高和P62水平降低（图8A）。Western blot分析显示，BT424抑制HCK活化可降低BMDM中巨噬细胞的M1促炎极化，并增加M2极化，这可通过iNOS和CD206的M1和M2标志物检测得到证实（图8B）。接下来，研究人员检测了BT424对巨噬细胞增殖的影响。他们首先在Raw264.7细胞中进行MTT实验（图8C），发现BT424显著降低了这些细胞的增殖。研究人员还使用碘化丙啶 (PI) 对 Raw264.7 细胞进行细胞周期分析，发现 BT424 处理可增加 G0/G1 期细胞比例，减少 G2/M 期细胞比例（图 8D）。研究人员对 Raw264.7 细胞进行了 Click-iT™ EdU 细胞增殖实验（图 8E）和 Ki67 免疫荧光染色（图 8F）。与对照组相比，BT424 处理组的 EdU 和 Ki67 阳性细胞数量均减少。研究人员对 Raw264.7 细胞进行了划痕实验，发现 BT424 显著降低了这些细胞的迁移能力（图 8G）。这些数据表明，BT424 通过抑制 HCK 活性，可以抑制巨噬细胞 M1 型促炎极化、增殖和迁移。[1]

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BT424 是一种特异性 HCK 抑制剂。体外实验表明，BT424 可调节巨噬细胞活化和自噬。通过抑制 HCK，BT424 可改变巨噬细胞的活化状态，减少促炎细胞因子的产生，并促进抗炎或促消退表型的形成。此外，它还能调节巨噬细胞的自噬通量，这可能有助于其发挥抗炎和抗纤维化作用。

HCK特异性抑制剂BT424可改善UUO模型中的炎症和肾纤维化[1]
研究人员首先通过对野生型（WT）小鼠每日灌胃给予25 mg/kg BT424，持续1个月，来测试该HCK抑制剂的毒性。根据小鼠的体重变化、行为和活动情况，他们未观察到任何明显的毒性。此外，研究人员使用IDEXX BioAnalytics（美国缅因州韦斯特布鲁克，邮编04092）提供的常规生化指标检测方法，对载体组和BT424组小鼠的血清进行检测，结果显示肝酶、肾功能、血脂谱和血糖水平均无明显变化（补充表S1）。这些数据表明，BT424治疗不会对这些小鼠产生显著的毒性。随后，研究人员测试了BT424对UUO诱导的纤维化的影响。小鼠分别接受 25 mg/kg 的 BT424 或载体（n = 5）灌胃治疗，从术前一天开始，持续至术后 7 天。HE 染色结果显示，与载体组相比，BT424 治疗组小鼠的单侧输尿管梗阻（UUO）肾脏形态学肾小管损伤显著减轻（图 9A）。Masson 染色和 Col1A1 免疫荧光染色证实，BT424 治疗组小鼠的 UUO 肾脏纤维化程度降低（图 9A、B）。BT424 治疗组小鼠 UUO 肾脏中 Col1a1、纤连蛋白和 FSP-1 的 mRNA 表达显著降低（图 9C）。BT424 治疗组 UUO 小鼠中 F4/80 阳性巨噬细胞数量显著减少（图 9D）。Western blot 分析表明，由于巨噬细胞总数减少和 M1 极化降低，iNOS 表达也随之降低（图 9E）。由于BT424处理导致巨噬细胞总数减少，肾脏中CD206表达降低；但在调整巨噬细胞数量后，CD206表达升高，表明BT424调节巨噬细胞，提示巨噬细胞极化方向由M1向M2转变（图9E）。BT424处理小鼠的UUO肾脏中巨噬细胞的自噬活性增强，这可通过LC3和F4/80的共染色以及巨噬细胞中LC3的定量分析来反映（图9F）。这些数据证实，BT424通过减少巨噬细胞数量和抑制巨噬细胞自噬来减轻UUO模型中的纤维化，并降低巨噬细胞的炎症性M1极化。

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BT424 可改善单侧输尿管梗阻 (UUO) 模型中的炎症和肾纤维化。UUO 模型是一种成熟的啮齿动物进行性肾纤维化模型。BT424 通过抑制 HCK，减少炎症细胞浸润，降低促炎细胞因子的产生，并减轻肾脏细胞外基质的沉积，从而减轻纤维化并保护肾功能。这些作用证实了 HCK 抑制剂在肾脏疾病治疗中的潜在应用价值。

自噬检测[1]
将自噬LC3 HiBiT报告基因按照制造商的方案，用PloyJet转染至HEK293细胞。然后用Nano-Glo HiBiT荧光试剂检测LC3报告基因。荧光信号强度根据上样蛋白量进行调整。对于Raw264.7和BMDM细胞，分别用1 μM自噬诱导剂PP242、100 nM自噬体降解抑制剂巴弗洛霉素A1 (BafA1)和5 mM自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤 (3MA)处理24小时，并通过Western blot检测LC3和P62的表达。在自噬刺激前2小时，用HCK抑制剂BT424和达沙替尼预处理细胞。

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EGFR 和整合素信号通路研究 [1]
将野生型 (WT) 和 HCK KO 小鼠的骨髓来源巨噬细胞 (BMDM) 在第 5 天用含 1% FBS 的 DMEM 培养基（含 L929 细胞）饥饿过夜。然后用 100 ng/ml 的 EGF 处理细胞 15 分钟和 30 分钟，之后在冰上用冷 PBS 洗涤收集细胞。收集细胞裂解液进行蛋白质印迹分析，以检测 EGFR 信号通路相关蛋白。对于整合素信号通路，按照文献[16]所述，将 BMDM 接种到预先包被胶原蛋白的 10 cm 培养皿中培养 1 小时。通过免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测 F-肌动蛋白和 pY20 与 SYK 的结合。

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趋化因子芯片分析 [1]
使用 Proteome Profiler 小鼠趋化因子芯片试剂盒，按照制造商的说明，对来自野生型 (WT) 和 HCK KO 小鼠的 BMDM 培养基进行趋化因子芯片分析。将 7 天大的 BMDM 用 100 ng/ml LPS 和 50 ng/ml IFNγ 处理 24 小时，使其极化为 M1 型；将 WT BMDM 在极化为 M1 型之前，用 HCK 抑制剂达沙替尼预处理 2 小时。

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使用重组人HCK酶进行无细胞HCK激酶活性测定。将该酶与肽底物和ATP在含有递增浓度BT424（0.01-10,000 nM）的测定缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mM DTT）中孵育。在30℃下孵育30-60分钟后终止反应，并通过发光法（ADP-Glo）测定磷酸化底物来确定IC₅0值。选择性评估以其他Src家族激酶（例如Src、Lyn、Fyn）和非相关激酶为参照。

MTT 和碘化丙啶流式细胞术检测细胞增殖 [1]
培养 4 天的 BMDM 用于 MTT 和 PI 流式细胞术检测。使用碘化丙啶染色液和 MTT，并遵循制造商的方案。使用 Attune 流式细胞仪和 FlowJo v10.8.0 软件进行流式数据分析。BT424 在细胞增殖实验前 24 小时用 BT424 处理 RAW 264.7 细胞。

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2D 和 3D 迁移实验 [1]
划痕实验。在实验前一天，将 RAW 264.7 细胞和 BMDM 接种于 6 孔板中，并在实验前一晚进行饥饿培养。使用含 0.5% FBS 的饥饿培养基来抑制细胞增殖。使用 200 μL 移液器吸头进行划痕。用完全培养基替换含 0.5% FBS 的饥饿培养基，以抑制细胞增殖。分别于划痕后0小时、1小时、3小时、6小时、12小时和24小时拍摄图像。使用ImageJ软件的“Wound_healing_size_tool”工具测量未愈合区域的距离。

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将巨噬细胞系（例如 RAW264.7）或骨髓来源的巨噬细胞接种后，用不同浓度（0.1-10 uM）的 BT424 处理 6-24 小时。然后用脂多糖 (LPS) 或其他促炎刺激物刺激细胞以诱导活化。通过蛋白质印迹法检测下游信号通路（例如 HCK 底物的磷酸化）来评估 HCK 抑制情况。巨噬细胞活化标志物：促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）通过 ELISA 或 qRT-PCR 检测。自噬标志物（LC3-II/I 比值、p62 水平）通过蛋白质印迹法检测。细胞活力通过 MTT 法检测。

动物实验[1]
德国EuMMCR构建了HCK外显子3 loxp侧翼敲除小鼠（HCK ES细胞克隆：HEPD0510）。将这些小鼠与组织特异性Cre小鼠（CMV-cre B6.C-Tg (CMV-cre)1Cgn/J006054；LysM-cre B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J）杂交，以在肾小管细胞和巨噬细胞中特异性敲除HCK。C57BL/6J野生型小鼠也购自杰克逊实验室。所有小鼠均饲养于西奈山动物房，环境条件受控：12/12小时光照/黑暗循环，环境温度20–25 °C。
野生型、HCK敲除小鼠和HCK抑制剂小鼠的单侧输尿管梗阻（UUO）模型构建方法参照我们之前的论文¹⁴。 BT424以 250 mg/ml 的 DMSO 溶液配制成储备液，然后用 PBS 稀释至 2.5 mg/ml，灌胃给小鼠，最终浓度为 25 mg/kg 体重。单侧缺血再灌注损伤联合对侧肾切除术 (uIRIx) 模型参照文献^69,70进行。简而言之，结扎右肾的动脉和静脉，切除右肾。然后夹闭左肾的动脉和静脉 25 分钟后松开。模型建立结束后，腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪，然后用冰冷的 PBS 灌注以收集组织。

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雄性小鼠（例如C57BL/6）接受单侧输尿管梗阻（UUO）手术以诱导进行性肾纤维化。假手术小鼠作为对照。BT424以10-50 mg/kg的剂量腹腔注射或口服给药，从手术当天或术前1-2天开始，每日一次，持续7-14天。小鼠在UUO术后7-14天处死。收集肾脏进行组织学分析（Masson三色染色用于纤维化，H&E染色用于炎症）。通过qRT-PCR或Western blot定量肾纤维化标志物（I型胶原、纤连蛋白、α-SMA）。通过免疫组织化学（F4/80、CD68）评估炎症细胞浸润（巨噬细胞、中性粒细胞）。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肾脏匀浆中的促炎细胞因子。采用蛋白质印迹法（Western blot）评估自噬标志物。记录体重和肾脏重量。

BT424 的具体药代动力学 (PK) 数据尚未公布。分子量为 421.08 (C22H15BCl2N2O2)。CAS 编号：2755180-37-9。分子式：C22H15BCl2N2O2。溶解度：DMSO (10-50 mg/mL)。储存：粉末储存于 -20℃ (3 年) 或 4℃ (2 年)；溶剂储存于 -80℃ (6 个月) 或 -20℃ (1 个月)。药代动力学参数（t1/2、Cmax、AUC、口服生物利用度）尚未确定。该化合物含有硼原子，可能影响其药代动力学和稳定性。

目前尚无关于BT424的具体毒性数据报告。在已发表的UUO模型研究中，剂量高达50 mg/kg时，未观察到全身毒性迹象（体重减轻、行为改变或死亡）。该化合物在这些剂量下通常耐受性良好。尚未进行全面的毒理学评估（hERG、Ames、重复给药毒性）。尚未开展临床试验。未经FDA批准。仅供研究使用。

[1]. HCK induces macrophage activation to promote renal inflammation and fibrosis via suppression of autophagy. Nat Commun. 2023 Jul 18;14(1):4297.

肾脏炎症和纤维化是导致慢性肾脏病（CKD）进展的常见途径。我们此前发现，造血细胞激酶（HCK）在人类慢性同种异体移植损伤中表达上调，促进肾脏纤维化；然而，其细胞来源和分子机制尚不清楚。本研究利用免疫染色和单细胞测序数据发现，HCK在病变肾脏的促炎巨噬细胞中高度富集。HCK敲除（KO）或HCK抑制剂可降低RAW264.7细胞和骨髓来源巨噬细胞（BMDM）中巨噬细胞M1样促炎极化、增殖和迁移。我们发现HCK与两种自噬相关蛋白ATG2A和CBL相互作用，从而抑制巨噬细胞自噬通量。体内实验表明，全身性和髓系特异性HCK敲除均可减轻肾脏炎症和纤维化，具体表现为巨噬细胞数量减少、促炎极化减弱以及向单侧输尿管梗阻（UUO）肾脏和单侧缺血再灌注损伤（IRI）模型的迁移减少。此外，我们开发了一种选择性含硼HCK抑制剂，该抑制剂在体外可降低巨噬细胞的促炎活性、增殖和迁移，并可减轻UUO小鼠的肾纤维化。本研究阐明了HCK通过自噬调控CKD中巨噬细胞活化和极化的下游机制，并指出选择性HCK抑制剂有望成为治疗肾纤维化的新疗法。 [1] 总之，我们发现SFK HCK通过调节巨噬细胞内的自噬，改变其极化、增殖和向受损肾脏的迁移，参与CKD和慢性肾脏病（CAI）中肾间质纤维化/肾小管萎缩（IF/TA）的进展。我们还开发了一种无毒、特异性的HCK抑制剂，其靶向先导化合物BT424，并证实该抑制剂可以调节巨噬细胞功能，从而减轻进行性肾纤维化。[1] 我们的研究表明，在SFK家族成员中，HCK在病变肾脏的巨噬细胞中表达受到高度调控。另一方面，FYN主要在足细胞中表达，并通过磷酸化肾素来调节足细胞功能。我们之前已证实，达沙替尼可通过抑制FYN诱导的足细胞损伤，在狼疮性肾炎小鼠中诱发蛋白尿。因此，开发不影响FYN活性的更具选择性的HCK抑制剂对我们至关重要。本文介绍了一种相对选择性的HCK抑制剂BT424，该抑制剂不影响足细胞损伤，因此我们认为BT424是一种更优的HCK靶向药物，可用于治疗肾脏疾病患者，并具有抗炎和抗纤维化作用。
本研究存在一些局限性。我们证实HCK是巨噬细胞中的主要SFK，并在肾脏疾病中受到高度调控，但我们不能排除其他SFK成员在肾脏疾病中的作用。我们也认识到巨噬细胞在肾脏疾病中具有多种功能。近期有研究报道了巨噬细胞向肌成纤维细胞的转分化，我们将在未来的研究中探讨这一过程是否也受HCK调控。此外，在单侧输尿管梗阻（UUO）的HCK敲除小鼠中，包括巨噬细胞（浸润性和驻留性）和部分树突状细胞在内的F4/80阳性细胞总数显著减少。未来的研究将着重探讨HCK基因敲除背景下巨噬细胞、肾小管细胞和成纤维细胞之间的相互作用。LysM-cre并非巨噬细胞特异性，因为LysM启动子也在中性粒细胞中表达。既往研究表明，HCK调控中性粒细胞的活化和迁移。因此，需要进一步研究以明确HCK在肾脏炎症和纤维化过程中巨噬细胞和中性粒细胞中的作用。我们在损伤前用HCK抑制剂BT424处理小鼠，结果表明该抑制剂可以预防这些小鼠模型中的肾损伤或纤维化。还需要进一步研究以确定在疾病发生后对小鼠进行治疗是否可以逆转肾损伤和纤维化。总之，我们已证实HCK在肾脏炎症和纤维化过程中对巨噬细胞功能的调控起着关键作用。通过构建系统性和细胞特异性 HCK 敲除模型，并开发选择性含硼 HCK 抑制剂，我们证明了该通路在治疗进行性肾脏疾病方面的潜在价值。[1]

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其他信息：BT424（CAS 2755180-37-9）是一种研究用化合物，未经FDA批准。它是一种特异性HCK抑制剂，可在体外调节巨噬细胞活化和自噬，并改善UUO模型中的炎症和肾纤维化。它是研究HCK在髓系细胞生物学、炎症和纤维化中功能的重要工具。纯度≥98%。仅供研究使用。

C22H15BCL2N2O2

421.08

420.0603

2755180-37-9

168510578

White to off-white solid powder

42.8Ų

1

3

3

29

649

0

B1(N=C(NO1)C2=CC3=C(C(=CC(=C3)Cl)Cl)OC2C4=CC=CC=C4)C5=CC=CC=C5

SYIZHZBXDOQNIR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H15BCl2N2O2/c24-17-11-15-12-18(22-26-23(29-27-22)16-9-5-2-6-10-16)20(14-7-3-1-4-8-14)28-21(15)19(25)13-17/h1-13,20H,(H,26,27)

4-(6,8-dichloro-2-phenyl-2H-chromen-3-yl)-2-phenyl-5H-1,3,5,2-oxadiazaborole

BT424; BT-424; 2755180-37-9;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。