Natural product from Peucedanum praeruptorum Dunn.; NO/cGMP

（-）-Praeruptorin A/前胡素A已在日本前胡和泰国前胡中报道。（±）-Praeruptorin A能有效放松回肠和气管平滑肌。（+）-前胡素A可以通过减少平滑肌细胞（SMCs）的面积、胶原含量和SMCs中的[Ca2+]i来改善血管肥大[1]。

白花前胡甲素是一种天然存在于中药白花前胡根部的香豆素类化合物，该药材常用于治疗某些呼吸系统疾病和高血压。虽然先前研究表明(±)-白花前胡甲素对气管和动脉标本具有舒张作用，但关于其对映体的功能特性知之甚少。本研究通过制备型Daicel Chiralpak AD-H色谱柱成功分离并鉴定出两种对映体，观察比较了它们对主动脉环的舒张作用。(+)-白花前胡甲素在抑制KCl和苯肾上腺素诱导的完整内皮大鼠离体主动脉环收缩方面，显示出比(-)-白花前胡甲素更强的舒张活性。去除内皮显著减弱了(+)-白花前胡甲素的舒张作用，但对(-)-对映体影响不大。用N(ω)-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME，一氧化氮合酶抑制剂）或亚甲蓝（MB，可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂）预处理主动脉环，会导致两种对映体的舒张作用发生与内皮去除相似的变化。分子对接研究也表明(+)-白花前胡甲素比(-)-对映体更符合一氧化氮合酶药效团特征。另一方面，两种白花前胡甲素对映体都能轻微减弱由肌浆网(SR)内Ca2+释放诱导的大鼠主动脉环收缩。这些发现表明(+)-和(-)-白花前胡甲素对大鼠离体主动脉环具有不同的舒张作用，这可能主要归因于内皮一氧化氮合酶催化的一氧化氮合成。[1]

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(±)-白花前胡甲素对映体对KCl或PE诱导的大鼠主动脉环收缩的影响[1]
分别用高浓度KCl（60 mM）或PE（1 μM）预收缩主动脉环。达到平台期后，分别累积加入(+)-白花前胡甲素和(−)-白花前胡甲素（KCl诱导收缩时浓度为1-30 μM，PE诱导收缩时为3-100 μM），获得浓度-舒张反应曲线。 在内皮完整的主动脉环中，(±)-白花前胡甲素对映体在1-100 μM浓度范围内对基础张力无显著影响（数据未显示），但两者均对KCl（60 mM）或PE（1 μM）诱导的收缩表现出浓度依赖性舒张作用（图5A和C）。对于KCl诱发的收缩，(+)-和(−)-白花前胡甲素的IC50值分别为12.1±1.3 μM和20.9±0.8 μM，Emax值分别为90.7±1.4%和68.6±5.2%。对于PE诱发的收缩，(+)-和(−)-对映体的IC50值分别为35.4±3.6 μM和45.8±2.5 μM，Emax值分别为86.3±2.6%和79.8±2.4%。结果表明，在内皮完整的大鼠主动脉环中，(+)-白花前胡甲素对KCl或PE诱导收缩的抑制作用强于(−)-对映体。

在内皮去除的主动脉环中，(+)-白花前胡甲素和(−)-对映体也显示出对KCl或PE诱导收缩的浓度依赖性舒张作用（图5B和D）。对于KCl诱发的收缩，(+)-和(−)-对映体的IC50值分别为22.7±1.5 μM和22.8±2.9 μM，Emax值分别为65.6±3.5%和65.3±8.1%。对于PE诱发的收缩，IC50值分别为42.9±4.1 μM和44.0±1.0 μM，Emax值分别为70.2±3.9%和69.1±3.0%。这些发现表明内皮去除显著减弱了(+)-白花前胡甲素的舒张作用，但对(−)-对映体影响不大，且(+)-白花前胡甲素的作用涉及内皮依赖性和非依赖性舒张机制。

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NO/环磷酸鸟苷(cGMP)通路在(±)-白花前胡甲素对映体舒张KCl诱导的大鼠主动脉环收缩中的作用[1]
为确定NO/cGMP通路是否参与(±)-白花前胡甲素对映体的舒张作用，分别在内皮完整的大鼠主动脉环中，于KCl给药前30分钟加入L-NAME（100 μM，NO合酶抑制剂）和MB（10 μM，催化cGMP形成的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)抑制剂）。
L-NAME或MB在测试浓度下对大鼠主动脉环的基础张力无影响（数据未显示）。在L-NAME预处理的主动脉环中，(+)-白花前胡甲素和(−)-对映体的IC50值分别为21.0±4.1 μM和22.4±1.6 μM，Emax值分别为70.3±8.5%和64.2±7.6%（图6A）。在MB预处理的主动脉环中，(+)-和(−)-白花前胡甲素的IC50值分别为20.2±0.5 μM和22.1±1.1 μM，Emax值分别为80.0±1.3%和70.2±4.2%（图6B）。与内皮去除类似，L-NAME或MB预处理均显著减弱了(+)-白花前胡甲素对KCl诱导收缩的舒张作用，但对(−)-对映体影响不大，且两种对映体的舒张效果趋于相同。这些发现表明NO/cGMP信号通路主要参与(+)-而非(−)-白花前胡甲素的舒张作用。
为阐明(+)-白花前胡甲素舒张效能对NO阻断的敏感性是否源于NO（或cGMP）与其协同作用，我们观察了(±)-白花前胡甲素对乙酰胆碱诱发舒张（NO依赖性舒张）的影响。结果显示：(+)-和(−)-白花前胡甲素均不影响乙酰胆碱对完整内皮大鼠离体主动脉环的舒张作用。单独乙酰胆碱、乙酰胆碱加(+)-白花前胡甲素（30 μM）、乙酰胆碱加(−)-对映体（30 μM）的IC50值分别为4.0±0.7 μM、4.3±0.6 μM和4.2±0.4 μM。该结果证明(+)-白花前胡甲素并非通过与NO协同发挥舒张效应1。

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(±)-白花前胡甲素对映体对细胞内Ca2+释放诱导的大鼠主动脉环收缩的影响[1]
在无Ca2+的K-H液中，PE（1 μM）可通过释放细胞内Ca2+诱发内皮去除大鼠主动脉环的短暂收缩。如图7所示，(±)-白花前胡甲素对映体仅轻微减弱PE诱导的收缩且效能相近。对照组与(+)-白花前胡甲素（3 μM、10 μM、30 μM）处理组的收缩比值（T2/T1）分别为93.3±2.1%、92.2±2.5%、88.7±3.2%和81.9±4.3%；(−)-对映体处理组的T2/T1值分别为94.6±3.7%、91.8±1.9%、85.8±3.5%和80.1±5.1%。选择性IP3R抑制剂肝素（100 μg/ml）则显著抑制PE诱导的收缩（对照组与肝素组的T2/T1值分别为98.1±7.5%和6.5±1.3%）。这表明(±)-白花前胡甲素对映体可轻微减弱IP3R（肌醇-1,4,5-三磷酸受体）介导的细胞内Ca2+释放诱导的主动脉环收缩1。

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K+通道阻断剂对(±)-白花前胡甲素对映体舒张PE诱导大鼠主动脉环收缩的影响[1]
为探究K+通道开放是否参与(±)-白花前胡甲素对映体的舒张作用，在标准K-H液中去内皮主动脉环中，于PE（1 μM）给药前30分钟加入TEA（5 mM，假定K+通道阻断剂）。
图8A显示两种对映体以相近效能减弱PE诱导的收缩，(+)-白花前胡甲素和(−)-对映体的IC50值分别为42.9±4.1 μM和44.0±1.0 μM。TEA预处理未改变对映体的舒张作用，其IC50值分别为43.1±3.8 μM和44.1±6.4 μM（图8B）。该结果提示K+通道开放不参与(±)-白花前胡甲素对映体的舒张机制1。

将 (+)-Praeruptorin A 和 (−)-Praeruptorin A 溶解于 PEG400 中。[1]
为了研究这些化合物对细胞内 Ca2+ 释放诱导的收缩的影响，将主动脉环暴露于无 Ca2+ 溶液中，并使用 PE (1 μM) 诱导第一次瞬时收缩 (T1)。之后，用标准 Krebs-Henseleit 溶液洗涤主动脉环两次（至少孵育 40 分钟以补充细胞内 Ca2+ 储存），然后再用无 Ca2+ 的 K-H 溶液洗涤两次（孵育 15 分钟）。然后在有或无 (+)-Praeruptorin A 和 (−)-Praeruptorin A 的情况下，使用 PE 诱导第二次瞬时收缩 (T2)，其中 (+)-Praeruptorin A 和 (−)-Praeruptorin A 在 PE 给药前 30 分钟加入。以肝素（100 μg/ml）作为阳性对照。计算第二次收缩与第一次收缩的比值（T2/T1）[1]。

[1]. (+/-)-Praeruptorin A enantiomers exert distinct relaxant effects on isolated rat aorta rings dependent on endothelium and nitric oxide synthesis. Chem Biol Interact. 2010 Jul 30;186(2):239-46.

据报道，日本假单胞菌（Peucedanum japonicum）和刺蒺藜（Prionosciadium thapsoides）中含有(-)-Praeruptorin A，并有相关数据。(±)-Praeruptorin A 已被证实能够舒张血管平滑肌，是假单胞菌（P. praeruptorum）根的主要生物活性成分。然而，其对映异构体的作用特征和潜在机制仍不清楚。在本研究中，我们发现(+)-praeruptorin A 和 (−)-praeruptorin A 均能浓度依赖性地舒张高钾收缩的具有功能性内皮的离体大鼠主动脉环，且(+)-praeruptorin A 的舒张作用强于 (−)-praeruptorin A。值得注意的是，去除内皮以及用 L-NAME 或 MB 预处理均显著减弱了 (+)-praeruptorin A 的舒张作用，但对 (−)-praeruptorin A 的舒张作用无明显影响，导致两种对映异构体的舒张效力趋于一致。这些结果强烈提示，(+)-praeruptorin A 可发挥内皮依赖性和非内皮依赖性的血管平滑肌舒张作用，而 (−)-praeruptorin A 仅发挥内皮非依赖性的舒张作用。此外，钾离子通道也参与调节肌肉收缩性和血管张力。直接激活动脉平滑肌细胞上的K+通道应使细胞膜超极化，并抑制Ca2+内流和平滑肌收缩。在本研究中，TEA（一种非选择性K+通道阻滞剂）预处理并未改变(±)-普拉普托林A对映体的舒张作用，提示K+通道开放可能与这些对映体的舒张作用无关。
总之，(+)-普拉普托林A和(−)-普拉普托林A均能浓度依赖性地舒张KCl收缩的离体大鼠主动脉环。 (+)-praeruptorin A 的作用比 (−)-praeruptorin A 更强。造成这种差异的最重要原因可能是 (+)-praeruptorin A 而非 (−)-praeruptorin A 能很好地与 eNOS 的药效团结合，从而激活 NO/cGMP 信号通路。[1]

C21H22O7

386.39518

386.136

C, 65.28; H, 5.74; O, 28.98

14017-71-1

(±)-Praeruptorin A;73069-25-7; 21499-23-0; 14017-71-1; 73069-27-9

9821539

Typically exists as solid at room temperature

1.3±0.1 g/cm3

486.8±45.0 °C at 760 mmHg

211.5±28.8 °C

0.0±1.2 mmHg at 25°C

1.574

4.18

92.04

0

7

5

28

720

2

C/C=C(/C)\C(=O)O[C@@H]1[C@@H](C2=C(C=CC3=C2OC(=O)C=C3)OC1(C)C)OC(=O)C

XGPBRZDOJDLKOT-YRCPKEQFSA-N

InChI=1S/C21H22O7/c1-6-11(2)20(24)27-19-18(25-12(3)22)16-14(28-21(19,4)5)9-7-13-8-10-15(23)26-17(13)16/h6-10,18-19H,1-5H3/b11-6-/t18-,19-/m1/s1

[(9R,10R)-10-acetyloxy-8,8-dimethyl-2-oxo-9,10-dihydropyrano[2,3-f]chromen-9-yl] (Z)-2-methylbut-2-enoate

(-)-Praeruptorin A; 14017-71-1; Isopteryxin; [(9R,10R)-10-acetyloxy-8,8-dimethyl-2-oxo-9,10-dihydropyrano[2,3-f]chromen-9-yl] (Z)-2-methylbut-2-enoate; (+/-)-Praeruptorin A; 73069-25-7; (9R,10R)-10-(acetyloxy)-8,8-dimethyl-2-oxo-2H,8H,9H,10H-pyrano[2,3-h]chromen-9-yl (2Z)-2-methylbut-2-enoate; 10-(Acetyloxy)-9,10-dihydro-8,8-dimethyl-2-oxo-2H,8H-benzo(1,2-b:3,4-b')dipyran-9-yl 2-methyl-2-butenoate (9R-(9alpha(Z),10alpha))-;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。