D3 Receptor ( Ki = 1.4 )

NGB 2904 抑制喹吡罗 (100 nM) 刺激的有丝分裂，IC50 为 5.0 nM[1]。 表1中总结的化合物4和5/NGB-2904的受体结合谱是通过体外结合研究确定的，该研究使用了转染有个体人、灵长类动物或大鼠受体亚型cDNA的CHO细胞膜。这两种化合物对D3受体显示出高亲和力，其选择性是所有其他多巴胺受体亚型的150倍以上。在~l受体上观察到类似的选择性。在4的情况下，发现5-羟色胺5-HT2具有中等亲和力（125 nM）和选择性（100倍）。表1中未列出的结合位点的全球受体筛选（Panlabs）表明，在1 mM时没有超过50%的抑制作用。
为了确定4和5/NGB-2904对D3受体的功能作用，测量了D3转染CHO细胞有丝分裂的影响。J2激动剂激活D3受体刺激CHO细胞摄取[3H]胸苷。D3受体激动剂多巴胺和喹匹罗都以剂量依赖的方式刺激[3H]胸苷掺入CHO.hD3细胞，而D3拮抗剂氟哌啶醇以及NGB 2849和NGB-2904都是受体拮抗剂。氟哌啶醇、NGB 2849和NGB-2904分别以8.8、6.8和5.0 nM的IC50值拮抗100 nM奎尼罗刺激的有丝分裂[1]。

在野生型小鼠中，NGB 2904（26 μg/kg；单次皮下注射）可改善安非他明 (26 mg/kg) 刺激的运动 [3]。在野生型小鼠中，NGB 2904（0.026 μg-1 mg/kg；每天一次，持续 7 天或单次皮下注射）可增加自发运动 [3]。

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越来越多的证据表明，多巴胺（DA）D（3）受体拮抗剂在减轻可卡因成瘾的临床前模型中的奖励和复发方面表现出很大的前景。在本研究中，我们研究了新型D（3）选择性拮抗剂NGB-2904（N-（4-[4-{2,3-dichlorophenyl}-1-piperazinyl]丁基）-3-芴甲酰胺）对可卡因自我给药的影响，可卡因增强的脑刺激奖励（BSR），以及可卡因引发的雄性Long-Evans大鼠寻药行为的恢复。我们发现：（1）在固定比率2（FR2）强化下，急性腹腔注射（i.p.）NGB-2904（0.1-10mg/kg）未能改变可卡因自我给药（0.5mg/kg/输注），但1或5mg/kg NGB-2904显著降低了渐进比率（PR）强化下可卡因自我给药剂量的断裂点；（2）可卡因（1、2和10mg/kg）显著增强了电BSR（降低了大脑奖励阈值），而NGB 2904显著抑制了2mg/kg可卡因引起的BSR增强，但10mg/kg可卡因没有；（3）单独使用NGB-2904既不能维持自我给药行为，也不能改变大脑奖励阈值；（4）NGB-2904显著抑制可卡因引发的已熄灭的寻药行为的恢复，但不抑制蔗糖加蔗糖线索引发的寻糖行为的恢复。总体而言，这些数据表明，新型D（3）选择性拮抗剂NGB 2904通过PR自我给药、BSR和可卡因引发的可卡因寻求行为的恢复来评估可卡因的奖励作用。由于这些特性及其缺乏有益效果（根据BSR和药物自我给药期间的替代评估），NGB 2904作为治疗可卡因成瘾的潜在药物值得进一步研究。[2]

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多巴胺D3受体被认为在调节啮齿动物的运动行为中起着重要作用，并已被提出作为药物滥用、精神病和帕金森病的治疗靶点。基于利用D3受体敲除小鼠和D3受体偏好激动剂的研究，多巴胺D3受体功能的一个模型提出，D3受体刺激对精神兴奋剂诱导的运动具有抑制作用，这与多巴胺D1和D2受体同时刺激的效果相反。药物化学的最新进展导致了高选择性多巴胺D3受体拮抗剂的开发。为了深化我们对D3多巴胺受体行为功能的理解，我们测定了高选择性多巴胺D3受体拮抗剂NGB-2904对野生型和多巴胺D3受体敲除小鼠苯丙胺刺激和自发运动的影响。NGB-2904（26.0微克/千克皮下注射）增强了野生型小鼠受苯丙胺刺激的运动，但在多巴胺D3受体敲除小鼠中没有可测量的效果。在急性或每日一次连续七天的一系列剂量（0.026微克-1.0毫克/千克）中，最高剂量的NGB-2904（1.0毫克/公斤）刺激了野生型小鼠的自发运动，但在多巴胺D3受体敲除小鼠中没有可测量的效果。NGB 2904的这些行为效应与其他高度D3受体选择性拮抗剂的行为效应形成鲜明对比，这些拮抗剂以前没有对自发运动活动产生影响。结合起来，这些数据增加了这种新型D3受体配体的行为特征，并为多巴胺D3受体抑制功能在调节啮齿动物运动中的作用提供了进一步的支持[3]。

一般流程[2]
\n手术恢复后，每只大鼠被放入测试箱中，并允许其按压操作杆以获得静脉注射的可卡因（1 mg/kg/次），注射量为0.08 ml，注射时间为4.6秒，采用FR1强化程序。在4.6秒的注射时间内，记录了大鼠按压操作杆的额外反应，但这些反应不会导致额外的注射。每个实验阶段持续3小时。FR1强化程序持续3-5天，直至大鼠建立稳定的可卡因自我给药行为。初始可卡因剂量为1 mg/kg/次是基于我们之前的经验，即该剂量能够最快速、最容易地诱导大鼠习得可卡因自我给药行为。随后，受试者被随机分配到以下四个实验之一：（1）在 FR2 强化程序下进行可卡因自我给药，（2）在 PR 强化程序下进行可卡因自我给药，（3）在有经验的可卡因自我给药大鼠中进行 NGB-2904 或生理盐水替代测试，或（4）可卡因触发的药物寻求行为的恢复。在所有实验中，均在测试前 30 分钟给予 NGB-2904，因为初步数据显示，NGB-2904 的作用大约在全身给药后 30 分钟出现。\n

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\n\nFR2 强化下的可卡因自我给药 [2]
\n从 FR1 强化过渡到 FR2 强化后，受试者（n=10）被允许继续在 FR2 强化下进行可卡因（0.5 mg/kg/次）自我给药，直至满足以下稳定可卡因维持反应的标准：反应间隔变异性 <10%，且连续至少 3 天按压有效杠杆的次数变异性 <10%。选择该可卡因剂量是基于先前的研究结果，即大鼠以 0.5 mg/kg/次的剂量进行可卡因自我给药时表现出高度稳定的自我给药行为。此外，既往研究表明，0.5或1 mg/kg/次输注的可卡因剂量处于可卡因剂量-反应自我给药曲线的下降段范围内，在该范围内已观察到稳定可靠的剂量依赖性效应（Weissenborn等，1998；Parsons等，1998；Xi等，2005）。此外，我们选择0.5 mg/kg而非1 mg/kg的可卡因剂量，是为了增加动物在相同药物摄入量下的工作量（即按压杠杆的次数）。根据我们之前的经验，这种方法可以提高测量药物摄入或觅药行为变化的灵敏度。为避免在自我给药期间出现可卡因过量，每只动物每次实验最多注射50次可卡因。在反应率稳定后，每只受试动物在测试前30分钟随机接受四种剂量中的一种NGB-2904（0.1、1、5和10 mg/kg，腹腔注射）或赋形剂（1 ml 25% 2-羟丙基-β-环糊精溶液）。随后，动物单独进行5-7天的可卡因自我给药，直至基线反应率恢复，之后再进行下一剂量NGB-2904的测试。不同剂量NGB-2904的测试顺序根据拉丁方设计进行平衡。\n

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\n\nPR强化下的可卡因自我给药[2]
\nFR1和FR2强化下的初始可卡因自我给药与上述相同。在 FR2 强化下建立稳定的可卡因自我给药后，受试者被转为在 PR 程序下进行可卡因自我给药（0.5 mg/kg/次注射），在此期间，每次测试中，获得一次静脉注射可卡因所需的按压杠杆次数逐渐增加（详见 Richardson 和 Roberts，1996），根据以下 PR 系列：1、2、4、6、9、12、15、20、25、32、40、50、62、77、95、118、145、178、219、268、328、402、492 和 603，直到达到断点。断点定义为动物在最后一次可卡因输注后1小时内完成的最大工作负荷（即按压杠杆次数）。在1小时内，动物未接受任何输注。在PR强化条件下，动物被允许继续每日进行可卡因自我给药实验，直至断点的日间变异性连续3天保持在1-2倍的比率增量范围内。一旦确定了稳定的断点，受试者被分为四个亚组，以确定三种不同剂量的NGB-2904（0.1、1和5 mg/kg，腹腔注射）或赋形剂（1 ml 25% 2-羟丙基-β-环糊精溶液）对可卡因自我给药PR断点的影响。由于每次药物测试后都比较难以达到基线断点水平，因此我们选择在本实验中使用组间设计而不是组内设计。\n

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\n\n在先前有可卡因自我给药史的大鼠中进行NGB-2904或生理盐水自我给药[2]
\n在FR2强化条件下，大鼠至少连续3天建立起稳定的每日可卡因自我给药模式（0.5 mg/kg/次）后，将动物分为五组（每组n=8）：（1）在接下来的几天中，在通常的3小时测试期间，大鼠可以进行可卡因（0.5 mg/kg/次）自我给药；（2）用NGB-2904（0.1 mg/kg/次）代替可卡因； (3) 用 NGB-2904 (0.5 mg/kg/次输注) 替代可卡因；(4) 用海洛因 (0.05 mg/kg/次输注) 替代可卡因；(5) 用生理盐水 (0.08 ml/次输注) 替代可卡因。由于动物可能需要几天时间才能适应新的强化物，因此每项替代试验重复 3-5 天。选择 NGB-2904 的剂量基于两点考虑。首先，NGB-2904 在本实验用作溶剂的 5% 2-羟丙基-β-环糊精溶液中的最大溶解度约为 3 mg/ml，因此 0.5 mg/kg/次输注是可行的最大单位剂量。其次，在最初 30 分钟内累积的静脉注射 NGB-2904 剂量（5-8 次输注 × 0.1 或 0.5 mg/kg/次输注，见图 2）约为 0.5-4 mg/kg，高于在下文详述的自我给药、BSR 和恢复药物寻求实验中发现有效的 NGB-2904 的腹腔注射剂量（0.1-5 mg/kg），因此自我给药失败是一个更重要的发现。选择海洛因和生理盐水分别作为正性强化物和中性强化物对照。\n\n

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\n\n测试可卡因和/或NGB-2904对BSR的影响[2]
\n一旦达到基线θ0值（连续5天内θ0变化<15%），即可评估可卡因和/或NGB-2904对BSR的影响。在测试日，动物随机接受三种不同剂量的NGB-2904（0.1、1和5 mg/kg，腹腔注射）或赋形剂（1 ml 25% 2-羟丙基-β-环糊精），注射前30分钟再注射可卡因（1、2或10 mg/kg，腹腔注射）。每次测试后，动物接受额外的5-7天BSR再稳定期，直至建立新的基线θ0值。根据拉丁方设计，对不同剂量的NGB-2904进行测试的顺序进行了平衡。通过比较在有或无不同剂量NGB-2904预处理的情况下，可卡因诱导的θ0值变化，评估了NGB-2904对可卡因增强的BSR的影响。\n

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\n\n消退和恢复测试[2]
\n在建立稳定的可卡因自我给药后，将动物置于消退条件下，在此条件下，用生理盐水代替可卡因，并关闭与可卡因相关的提示灯和声音。主动按压操作杆只会输注生理盐水。每只大鼠每天进行3小时的消退训练，直至该大鼠连续至少3天在3小时训练中按压操作杆的次数少于10次。成功完成消退训练后，将动物分为四组进行恢复测试。在恢复测试当天，每组大鼠分别接受赋形剂（25% 2-羟丙基-β-环糊精）或不同剂量的NGB-2904（0.1、1 和 5 mg/kg，腹腔注射）。在给予赋形剂或NGB-2904 30分钟后，所有大鼠在恢复测试开始前立即接受可卡因预处理（10 mg/kg，腹腔注射）。恢复测试期间的条件与消退训练相同。记录可卡因诱发的主动按压杠杆反应（恢复），但这些按压杠杆反应并未导致可卡因输注或条件反射线索的呈现。恢复测试持续3小时。\n

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\n药物[2]
\n为了降低注射阻力和溶液渗透压，我们使用5% 2-羟丙基-β-环糊精作为静脉注射NGB-2904的溶剂。我们之前观察到，5%和25%的2-羟丙基-β-环糊精在行为效应方面没有差异。\n

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\n\n实验1：NGB-2904的急性和亚慢性效应[3]
\n在测试前一天（约15:00），将小鼠从动物房取出并运送到测试设施（位于相邻的建筑物内）。将受试小鼠放入生活活动室，并在给药前适应16-18小时，期间提供实验室饲料和水。次日上午约10:00，在给药前移除实验箱内的食物和水，以避免摄食行为与运动行为相互干扰。小鼠分别注射以下药物之一：赋形剂（50% PEG 400）、0.026、2.6、260.0、333.0或1000 μg/kg的NGB-2904。随后将小鼠放回活动箱，并记录其2小时的运动活动。2小时测试结束后，将小鼠放回笼中过夜。每日重复注射一次，持续7天，并记录每天前2小时的运动距离，以此计算7天内的平均运动距离。每只动物在第 1 天仅接受一剂 NGB-2904，并在所有 7 个测试日中持续接受相同剂量。\n

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\n\n实验 2：NGB-2904 对苯丙胺刺激运动的影响 [3]
\n在一系列预实验中，我们确定低微克浓度的 NGB-2904 可增加苯丙胺刺激的运动（数据未显示）。本实验中使用的剂量来源于这些预实验。小鼠在生活活动箱中适应 1 小时后，注射赋形剂（50% PEG 400）或 NGB-2904（26.0 μg/kg）。30 分钟后，小鼠注射苯丙胺（2.5 mg/kg）或 0.9% 生理盐水。第二次注射后记录3小时的运动活性。我们之前已确定，2.5 mg/kg剂量的安非他明主要诱导野生型和D3受体敲除小鼠的运动行为增强，而刻板行为的竞争性表现可忽略不计（McNamara等，2006）。所有注射均为皮下注射，注射体积为1.0 ml/kg。每只动物仅用于一次行为观察，以避免行为敏感化效应导致的运动反应改变。由于可用于研究的D3受体突变小鼠数量有限，本实验仅使用单剂量NGB-2904。\n
\n\n\nNGB-2904在50%聚乙二醇400溶液中于60℃加热过夜溶解。[3]

[1]. NGB 2904 and NGB 2849: two highly selective dopamine D3 receptor antagonists. Bioorg Med Chem Lett. 1998 Oct 6;8(19):2715-8.

[2]. The novel dopamine D3 receptor antagonist NGB 2904 inhibits cocaine's rewarding effects and cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior in rats. Neuropsychopharmacology. 2006 Jul;31(7):1393-405.

[3]. The dopamine D3 receptor antagonist NGB 2904 increases spontaneous and amphetamine-stimulated locomotion. Pharmacol Biochem Behav. 2007 Apr;86(4):718-26.

N-[4-[4-(2,3-二氯苯基)-1-哌嗪基]丁基]-9H-芴-2-甲酰胺属于芴类化合物。

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N-(4-[4-(2,3-二氯苯基)-1-哌嗪基]丁基)-3-芴基甲酰胺和 N-(4-[4-(2,3-二氯苯基)-1-哌嗪基]丁基)-2-联苯基甲酰胺由 2,3-二氯苯胺经多步反应制备。这些化合物被鉴定为高选择性多巴胺 D3 受体拮抗剂。[1]

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总之，NGB 2904 可减弱可卡因的奖赏效应，选择性抑制复吸，且无明显的奖赏、厌恶或运动效应。因此，NGB 2904 或其他高选择性 D3 受体拮抗剂有望成为治疗可卡因滥用的药物，并可提供体内研究工具，以进一步阐明 DA D3 受体在药物成瘾中的作用。[2]

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综上所述，我们的研究结果进一步证实了越来越多的数据，表明 NGB 2904 在体内作为选择性 D3 受体拮抗剂发挥作用（Gilbert 等，2005；Xi 等，2006），并为阐明 D3 受体的功能提供了一种新的有效工具。鉴于 NGB 2904 在体外具有高度选择性，且在 D3 受体突变小鼠中未观察到明显作用，我们的研究结果进一步支持了 D3 受体在调节啮齿动物某些运动行为方面发挥抑制作用的假设。与所有使用基因敲除小鼠的研究一样，我们的结果必须谨慎解读，因为野生型小鼠和基因敲除小鼠之间药物反应的差异可能是由代偿性适应造成的，而非D3受体基因的缺失所致。基于其已证实的行为效应和体外选择性，NGB 2904可能成为阐明多巴胺D3受体在物质滥用、精神病和帕金森病中作用的有用工具。[3]

C28H30CL3N3O

530.918

529.145

C, 63.34; H, 5.70; Cl, 20.03; N, 7.91; O, 3.01

189061-11-8

NGB 2904;189060-98-8

19366304

Typically exists as solid at room temperature

35.6

2

3

7

35

670

0

O=C(C1=CC(CC2=C3C=CC=C2)=C3C=C1)NCCCCN4CCN(C5=CC=CC(Cl)=C5Cl)CC4.[H]Cl

PFIWYJNBKGCVFM-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C28H29Cl2N3O.ClH/c29-25-8-5-9-26(27(25)30)33-16-14-32(15-17-33)13-4-3-12-31-28(34)21-10-11-24-22(19-21)18-20-6-1-2-7-23(20)24;/h1-2,5-11,19H,3-4,12-18H2,(H,31,34);1H

N-[4-[4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl]butyl]-9H-fluorene-2-carboxamide;hydrochloride

NGB 2904 hydrochloride; 189061-11-8; NGB 2904 (hydrochloride); N-[4-[4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl]butyl]-9H-fluorene-2-carboxamide;hydrochloride; N-(4-(4-(2,3-Dichlorophenyl)piperazin-1-yl)butyl)-9H-fluorene-2-carboxamide hydrochloride; N-[4-[4-(2,3-Dichlorophenyl)-1-piperazinyl]butyl]-9H-fluorene-2-carboxamide; PFIWYJNBKGCVFM-UHFFFAOYSA-N; N-{4-[4-(2,3-DICHLOROPHENYL)PIPERAZIN-1-YL]BUTYL}-9H-FLUORENE-2-CARBOXAMIDE HYDROCHLORIDE;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。