Ac-VDVAD-pNA

Caspase-2

Ac-DVAD-pNA、、Ac-VDVAD-pNA和Ac-LDVAD-pNA三种底物在不改变P2或P3的情况下，最明显地表现出疏水性P5残基的加入效果。这些底物被caspase-7和caspase-3水解。Caspase-3对Ac-LDVAD-pNA的催化效率最高，Km最低，kcat/Km约为Ac-DVAD-pNA的140%。同样，Ac-VDVAD-pNA的kcat/Km是Ac-DVAD-pNA值的120%。疏水性P5残基降低了caspase-7的水解效率，kcat/Km值为Ac-DVAD-pNA > Ac-VDVAD-pNA > Ac-LDVAD-pNA。在caspase-7实验中，ac - ldad - pna的kcat/Km约为Ac-DVAD-pNA的80%。这些结果表明疏水性P5残基有利于caspase-3对底物的识别和水解，而不利于caspase-7对底物的水解。这一信息是有价值的，因为它将有助于为每种半胱天冬酶设计特异性抑制剂，这在历史上一直是非常具有挑战性的。[1]

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所有3种中国仓鼠半胱天冬酶都能有效地切割相应的人类同源物。然而，在其他底物上的活性也被观察到，特别是caspase-8（图2B）。中国仓鼠caspase-8对人caspase-9的底物Ac-LEHD-pNA活性最高。它切割Ac-LEHD-pNA的速度是为人类caspase-8设计的底物Ac-IETD-pNA的1.4倍。此外，中国仓鼠caspase-8对caspase-3和-7 （Ac-DEVD-pNA）、caspase-2 （Ac-VDVAD-pNA）和caspase-6 （Ac-VEID-pNA）设计的底物也显示出相当大的酶活性。中国仓鼠caspase-2是最特异性的，因为它最有效地切割caspase-2 VDVAD五肽底物，并且对Ac-DEVD-pNA和Ac-LEHD-pNA仅显示剩余的反应性。人类caspase-9的指定底物Ac-LEHD-pNA也是中国仓鼠caspase-9的最佳底物。然而，中国仓鼠caspase-9对Ac-WEHD-pNA、Ac-VEID-pNA和Ac-IETD-pNA也表现出相当大的活性。它切割Ac-WEHD-pNA的效率（49%）几乎是切割Ac-LEHD-pNA的一半。 [2]

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每种中国仓鼠caspase样品首先与不同浓度的肽fmk抑制剂混合，包括Z-LEHD-fmk、Z-IETD-fmk、Z-VDVAD-fmk或Z-DEVD-fmk。在加入相应的pNA底物之前，将混合物在室温下孵育30分钟。由于caspase切割pNA底物，OD450的变化率被记录为图3A、3C和3E所示的动力学图。动力学曲线的初始斜率与初始酶促反应速度成正比，代表了该特定测定中酶的活性。抑制效果量化为孵育后残留酶活性与原始酶活性的比值。该比率与图3B、3D和3F中使用的不同抑制剂浓度相对应。在图3A和3B中，除阴性对照外，中国仓鼠caspase-8仅用1 μM的抑制剂孵育后就灭活了。Z-LEHD-fmk和Z-IETD-fmk对中国仓鼠caspase-9有较强的抑制作用，Z-VDVAD-fmk次之。在30 μM下，即使是Z-DEVD-fmk也能将caspase-9的活性降低到几乎为零。即使抑制剂浓度为5 μM， Z-LEHD-fmk和Z-IETD-fmk也能更有效地抑制中国仓鼠caspase-8，而抑制剂Z-VDVAD-fmk和Z-DEVD-fmk需要更高的剂量才能达到相同的效果。［2］

酶动力学测定[1]
用比色法测定caspase-3底物Ac- devd -pNA，其中Ac为乙酰基，pNA为对硝基苯胺。Caspase-3在反应缓冲液(50 mM Hepes (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1% （v/v) Chaps, 10% （v/v）甘油，1 mM EDTA， 10 mM二硫苏糖醇）中室温孵育5分钟，然后加入不同浓度的底物。酶裂解释放的对硝基苯胺在405nm波长处用Polarstar Optima酶标仪测定。31 .使用SigmaPlot 9.0通过拟合反应速度得到Km和Vmax值caspase-3底物Ac-DEVD-pNA、Ac-DMQD-pNA、Ac-DVAD-pNA、Ac-VDVAD-pNA和Ac-LDVAD-pNA的催化常数kcat通过公式kcat = Vmax/[E]测定，其中[E]值在Ki测定过程中通过活性位点滴定法测定，如下所述。caspase-7也采用了同样的方法。[１]

Caspase活性测定[2]
将表达重组中国鼠半胱天冬酶的冷冻大肠杆菌细胞颗粒解冻，用1.5 ml裂解缓冲液（5 mM DTT, 10 mM HEPES pH 7.5, 2 mM EDTA, 0.1% CHAPS/NP40）裂解10分钟，并在冰上孵育。裂解物超声进一步破坏细胞和DNA等大分子。然后将细胞裂解液以13000 rpm离心5分钟。收集上清液中的细胞质提取物。通过测定595 nm处的吸光度，用Pierce's Coomasie Plus-The Better Bradford Assay Reagent测定这些裂解物的蛋白质浓度。在96孔板上，将50 μl大肠杆菌裂解液与Chemicon比色测定试剂盒提供的缓冲液和ddH2O混合至95 μl。然后加入5 μl对硝基苯胺（pNA）标记的caspase底物（Ac-DEVD-pNA、Ac-IETD-pNA、Ac-LEHD-pNA、Ac-VDVAD-pNA、Ac-WEHD-pNA和Ac-VEID-pNA）。反应混合物在37℃下孵育2小时。通过在Tecan GENios微孔板读取器上跟踪405 nm （OD405）吸光度变化，监测caspase裂解从底物释放游离pNA发色团。每个样品的Caspase活性是根据OD405的初始增加率来确定的。背景对照使用不表达重组半胱天冬酶的大肠杆菌细胞裂解物。［2］

[1]. Structural and kinetic analysis of caspase-3 reveals role for s5 binding site in substrate recognition. J Mol Biol. 2006 Jul 14;360(3):654-66.
[2]. Specific inhibition of caspase-8 and -9 in CHO cells enhances cell viability in batch and fed-batch cultures. Metab Eng. 2007 Sep-Nov;9(5-6):406-18.
[3]. Talanian RV, et, al. Substrate specificities of caspase family proteases. J Biol Chem. 1997 Apr 11;272(15):9677-82.

本研究利用肽类似物抑制剂和在P2、P3和P5位点存在差异的底物，探讨了人caspase-3底物特异性的分子基础。我们解析了caspase-3与底物类似物复合物的晶体结构，分辨率为1.7 Å至2.3 Å。caspase-3与这些类似物相互作用的差异与Ac-DEVD-Cho、Ac-VDVAD-Cho和Ac-DMQD-Cho的Ki值分别为1.3 nM、6.5 nM和12.4 nM，以及相应肽底物的相对kcat/Km值分别为100%、37%和17%相符。结合的肽类似物在主链原子以及保守的P1 Asp和P4 Asp位点表现出非常相似的相互作用，而P2和P3位点的相互作用则有所不同。 P2 位于疏水性的 S2 沟槽中，这与 Ac-DMQD-Cho 的 P2 位点为 Gln 且具有极性的抑制作用较弱相一致。S3 是一个表面亲水位点，与 Ac-DEVD-Cho 中的 P3 位点 Glu 存在有利的极性相互作用。Ac-DMQD-Cho 和 Ac-VDVAD-Cho 的 P3 位点残基为疏水性残基，但并非位于极性 S3 位点的最佳位置，这与它们抑制作用较弱相一致。在 caspase-3 中发现了一个疏水性的 S5 位点，其中 Phe250 和 Phe252 的侧链与 Ac-VDVAD-Cho 的 P5 位点 Val 相互作用，并通过构象变化包围底物结合位点。通过比较 caspase-3 底物 Ac-VDVAD-pNA 和 Ac-LDVAD-pNA 与 Ac-DVAD-pNA 的水解效率，证实了疏水性 P5 位点残基的动力学重要性。相比之下，caspase-7 对 P5 位点为 Val 或 Leu 的底物的水解效率低于 Ac-DVAD-pNA。caspase-3 和 caspase-2 具有相似的疏水性 S5 位点，而 caspase-1、7、8 和 9 的疏水性残基在结构上并不相同；这些 caspase 对底物 P5 位点的选择性可能存在差异。对 P5 位点的选择性差异将有助于确定每种 caspase 的特定底物和相关信号通路。[1]

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为了研究导致中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞在分批培养和补料分批培养中凋亡的分子机制，我们从 CHO cDNA 文库中克隆了 caspase-2、-8 和 -9。在大肠杆菌中表达的重组中国仓鼠caspase-2和-9对商业肽底物Ac-VDVAD-pNA和Ac-LEHD-pNA（分别是人caspase-2和-9的指定商业底物）表现出最高的活性。然而，中国仓鼠caspase-8表现出广泛的底物特异性，其切割caspase-9底物的效率高于切割caspase-8底物的效率。市售的氟甲基酮类caspase抑制剂，例如Z-LEHD-fmk、Z-IETD-fmk、Z-VDVAD-fmk和Z-DEVD-fmk，均被证实对这些caspase的抑制完全缺乏特异性。人 caspase-8 和 -9 的可逆醛类抑制剂 Ac-LEHD-CHO 和 Ac-IETD-CHO 对抑制中国仓鼠 caspase-8 的效率相当。因此，目前广泛使用的利用“caspase 特异性”抑制剂来追踪单个 caspase 在细胞死亡中作用的方法可能并不准确，甚至会产生误导。作为一种替代方法，我们稳定表达了中国仓鼠 caspase-2、-8 和 -9 的显性负性 (DN) 突变体，以特异性抑制 CHO 细胞中的这些酶。结果表明，抑制内源性 caspase-8 或 caspase-9 均能提高 CHO 细胞在分批培养和补料分批悬浮培养中的存活率，而抑制 caspase-2 的影响甚微。这些结果提示 caspase-8 和 -9 可能参与 CHO 细胞在分批培养和补料分批培养中的凋亡过程，而 caspase-2 则不参与。这些发现对于开发基因工程改造CHO细胞以对抗分批和补料分批培养中细胞凋亡的策略具有重要价值。[2]

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半胱天冬酶家族是一类新型的细胞内半胱氨酸蛋白酶，其在细胞因子成熟和细胞凋亡中发挥着已知或疑似的作用。这些酶对底物P1位的Asp残基具有偏好性。为了阐明白细胞介素-1β转化酶（ICE）家族蛋白酶生物学功能的差异，我们详细研究了caspase-1、-2、-3、-4、-6和-7在体外对最短长度肽底物的P1位以外的特异性。我们发现这些酶之间存在差异和相似之处，提示该家族的功能亚组划分与基于整体序列比对的划分不同。ICE同源物的主要特异性解释了许多观察到的酶对大分子底物的偏好性，并可用于支持对其天然功能的预测。研究结果还提示了最佳肽底物和抑制剂的设计。[3]

C29H41N7O12

679.68

679.281

189684-53-5

25108784

Ac-Val-Asp-Val-Ala-Asp-pNA

Ac-VDVAD-pNA; VDVAD

Typically exists as solid at room temperature

1.4±0.1 g/cm3

1160.8±65.0 °C at 760 mmHg

655.8±34.3 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.572

2.23

295.02

8

12

17

48

1230

5

CC(C(NC(C)=O)C(NC(C(NC(C(NC(C(NC(C(NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1)=O)CC(O)=O)=O)C)=O)C(C)C)=O)CC(O)=O)=O)C

SIOKOOKURWWOID-PZQVQNRFSA-N

InChI=1S/C29H41N7O12/c1-13(2)23(31-16(6)37)29(46)34-20(12-22(40)41)27(44)35-24(14(3)4)28(45)30-15(5)25(42)33-19(11-21(38)39)26(43)32-17-7-9-18(10-8-17)36(47)48/h7-10,13-15,19-20,23-24H,11-12H2,1-6H3,(H,30,45)(H,31,37)(H,32,43)(H,33,42)(H,34,46)(H,35,44)(H,38,39)(H,40,41)/t15-,19-,20-,23-,24-/m0/s1

(3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-acetamido-3-methylbutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-4-(4-nitroanilino)-4-oxobutanoic acid

Ac-VDVAD-PNA; (3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-acetamido-3-methylbutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-4-(4-nitroanilino)-4-oxobutanoic acid; Ac-Val-Asp-Val-Ala-Asp-PNA; Ac-VDVAD-pNA (trifluoroacetate salt); Caspase-2 substrate; SCHEMBL7885355;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。