PD-1 signaling pathway[1]
AUNP‑12 targets the PD‑1/PD‑L1 immune checkpoint axis. By binding to PD‑1 and preventing its interaction with PD‑L1/PD‑L2 on tumour cells and antigen‑presenting cells, AUNP‑12 blocks the inhibitory signal that normally suppresses T‑cell activation, proliferation and effector function. This reactivates tumour‑specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) to kill cancer cells.

NP-12 TFA 对 PD-L1 和 PD-L2 均表现出等效的拮抗作用，从而促进淋巴细胞增殖及其效应功能[1]。NP-12 TFA 对重组人 PD-L1 和 PD-L2 的平均 EC50 值分别为 17 nM 和 16.6 nM，能够恢复小鼠脾细胞增殖[1]。此外，NP-12 TFA 还被证实能够显著减轻重组人 PD-L1 和 PD-L2 介导的体外人外周血单核细胞 (PBMC) 增殖抑制作用，其对 PD-L1 和 PD-L2 的平均 EC50 值分别为 63.3 nM 和 44.1 nM[1]。

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在无细胞结合实验中，AUNP-12 TFA 与重组人 PD-1 具有高亲和力（Kd 值通常在低纳摩尔至低微摩尔范围内）。在竞争性 ELISA 实验中，该肽段可阻断 PD-1 与其配体 PD-L1 和 PD-L2 之间的相互作用，IC50 值在低微摩尔范围内。详细的动力学参数可参见文献。

AUNP-12可抑制皮下注射小鼠B16F10黑色素瘤细胞（5 mg/kg，每日一次，连续14天）的肿瘤生长达44%；可减少静脉注射小鼠B16F10细胞（5 mg/kg，每日一次，连续11天）的肺转移；可抑制原位注射至小鼠乳腺脂肪垫的4T1细胞（3 mg/kg，每日一次，连续40天）的肿瘤生长达44%。10%的AUNP-12治疗组动物肿瘤完全消退，另有10%的动物肿瘤部分消退。AUNP-12治疗组动物在安乐死后肺转移灶平均减少超过60%。

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在体内，AUNP-12 TFA 已在同源小鼠肿瘤模型（例如 CT26 结肠癌、B16 黑色素瘤、4T1 乳腺癌）中展现出抗肿瘤活性。皮下或腹腔注射（10-50 mg/kg）可抑制肿瘤生长，增加肿瘤内 CD8+ T 细胞浸润，并减少肿瘤浸润的调节性 T 细胞 (Tregs)。该肽通常耐受性良好，在有效剂量下未观察到严重的自身免疫相关毒性。

在以表达hPDL2的HEK293细胞进行的PD1与PD-L2结合抑制实验中，AUNP-12的EC50值为0.72 nM；在以表达hPDL1的MDA-MB231细胞进行的大鼠外周血单核细胞（PBMC）增殖实验中，AUNP-12的EC50值为0.41 nM。这与AUNP-012报道的“亚纳摩尔级PD1-PDL1/2相互作用破坏效力”相符。

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标准PD-1/PD-L1结合ELISA：将重组人PD-L1（2 ug/mL）包被于96孔板中，过夜。封闭后，将生物素标记的人PD-1（0.5-1 ug/mL）与浓度递增的AUNP-12 TFA（0.1 nM-10 uM）在25℃下预孵育1小时，然后加入孔板中，孵育2小时。用链霉亲和素-HRP和TMB底物检测结合的PD-1。IC50值由抑制曲线计算得出。也可进行使用固定化PD-1和可溶性PD-L1的反向实验。

AUNP-12 在用表达 hPDL2 的 HEK293 细胞抑制 PD1 与 PD-L2 结合时，EC50 为 0.72 nM；在用表达 hPDL1 的 MDA-MB231 细胞进行的大鼠外周血单核细胞 (PBMC) 增殖试验中，EC50 为 0.41 nM。

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通用细胞T细胞活化试验：通过密度梯度离心分离人外周血单核细胞（PBMC），或使用小鼠脾细胞。向细胞中加入AUNP-12 TFA（0.1-10 uM），然后以10:1的效应细胞与靶细胞比例，与表达PD-L1的肿瘤细胞（例如，PD-L1转染的CHO细胞或PD-L1阳性癌细胞系）共培养。共培养48-72小时后，通过ELISA检测上清液中IFN-γ的产生、流式细胞术检测CD8+ T细胞上CD69或CD25的表达以及CFSE稀释法检测T细胞增殖，来评估T细胞活化。与对照组相比，AUNP-12对PD-1/PD-L1结合的抑制作用应能增加IFN-γ的产生和T细胞增殖。

AUNP-12 在小鼠 B16F10 黑色素瘤肺转移模型中具有体内活性，在 5 mg/kg 剂量（皮下注射，每日一次，连续 14 天）下，转移灶减少了 64%。[2]

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AUNP-12 在 Balb/c 小鼠体内的药代动力学[3]
本研究中使用的所有动物实验程序，包括药代动力学、药效学和疗效实验，均已获得机构动物伦理委员会的批准，并符合印度动物实验控制和监督委员会的指导原则。为确定药代动力学参数，AUNP-12 以 3 mg/kg 的剂量静脉注射或皮下注射给药，使用 5% 葡萄糖溶液作为制剂。给药后，定期采集血样，直至 24 小时，并离心以获得血浆。采用固相萃取（SPE）法处理血浆样本，并用液相色谱-串联质谱（LC/MS-MS）分析洗脱液，以测定化合物的血浆浓度。静脉给药后，测定每只小鼠的注射后血浆浓度（C0分钟）、浓度-时间曲线下面积（AUC0-∞）、平均滞留时间、分布容积（Vdss）和清除率（CL）。皮下注射AUNP-12后，测定最大血浆浓度（Cmax）、达峰时间（Tmax）和AUC0-∞。基于静脉和皮下给药参数，计算AUNP-12的生物利用度。

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同基因小鼠研究[3]
在所有体内肿瘤生长抑制（TGI）研究中，每周两次使用数字游标卡尺测量肿瘤体积，并使用公式V = 0.5a × b²将体积表示为mm³，其中a和b分别为肿瘤的长径和短径。每周监测两次体重和临床症状。除B16F10小鼠黑色素瘤和Renca肿瘤模型外，所有体内研究中AUNP-12均溶解于5%葡萄糖溶液中；B16F10小鼠黑色素瘤和Renca肿瘤模型则使用1×PBS溶液。每日新鲜配制溶液。化合物和溶剂对照组均以10 mL/kg体重的剂量皮下注射，每日一次。

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通用体内同源肿瘤模型：雌性BALB/c小鼠（用于CT26结肠癌、4T1乳腺癌）或C57BL/6小鼠（用于B16黑色素瘤）（每组n=8）皮下注射5×10⁵个肿瘤细胞。当肿瘤体积达到约50-100 mm³时，每2-3天给予小鼠AUNP-12 TFA（10-50 mg/kg，腹腔或皮下注射），持续14-21天。每2-3天用游标卡尺测量肿瘤体积。实验结束时，切除肿瘤进行免疫组织化学染色（CD8⁺ T细胞浸润、FoxP3⁺ Tregs）和流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。同时分析脾细胞中T细胞活化标志物的表达。每天监测体重和自身免疫症状（皮疹、腹泻、体重减轻）。

作为一种肽，AUNP-12 TFA 的血浆半衰期中等（啮齿动物为 2-6 小时），这是由于其易受蛋白水解酶降解所致。TFA 盐可提高其水溶性（>5 mg/mL），便于肠外给药。该化合物口服生物利用度低，通常采用腹腔注射或皮下注射给药。常用的制剂为 PBS 或生理盐水（pH 7.4），并添加 5-10% 的 DMSO 或 PEG400。AUNP-12 TFA 是一种研究级肽，未经批准的临床试验，不得用于人类治疗。在临床前研究中，小鼠对高达 50 mg/kg 剂量的 AUNP-12 耐受性良好，未观察到急性毒性。在高剂量（≥50 mg/kg）下，可能会出现轻微的免疫相关不良反应，例如短暂性体重减轻或轻度腹泻。目前尚无遗传毒性数据。操作时应采取标准安全防护措施（戴手套、穿实验服）。

[1]. US 2011/0318373 A1
[2]. Cancer Research, vol. 72, no. 8 Suppl. 1, Abstract 2850, 2012.
[3]. A Rationally Designed Peptide Antagonist of the PD-1 Signaling Pathway as an Immunomodulatory Agent for Cancer Therapy. Mol Cancer Ther. 2019 Jun;18(6):1081-1091.

进一步的体内研究表明，AUNP-12/AUR-012 具有优异的药代动力学-药效学相关性，且疗效持续时间超过 24 小时。在黑色素瘤、乳腺癌和肾细胞癌的临床前模型中，与目前临床使用的治疗方法相比，AUR-012/AUNP-12 在抑制原发肿瘤生长和转移方面显示出更优的疗效。值得注意的是，每三天给药一次与每日一次给药的效果相当，且未观察到明显的毒性或中和活性。[9] 用抗 CD3/抗 CD-28 抗体刺激后对免疫细胞增殖的分析表明，CD4+ 和 CD8+ T 细胞的增殖完全恢复。有趣的是，AUR-012/AUNP-12 治疗完全抑制了 CD4+ Foxp3+ T 细胞的增殖，表明调节性 T 细胞的增殖被完全抑制。循环免疫细胞的持续激活及其分泌IFN-γ的能力可持续长达72小时，表明即使在动物模型中化合物清除后，其疗效仍然持续存在，因此支持长达3天的给药间隔。在黑色素瘤、乳腺癌、肾细胞癌和结肠癌模型中，AUR-012/AUNP-12均显示出抑制原发肿瘤生长和转移的疗效。此外，在预先建立的CT26模型中，该化合物的抗肿瘤活性与疗效密切相关，表现为肿瘤内CD4+和CD8+ T细胞的募集以及肿瘤和血液中PD1+ T细胞（包括CD4+和Page7/12阳性CD8+细胞）的减少。在一项为期14天的重复给药毒性研究中，AUR-012/AUNP-12在100倍有效剂量下具有良好的耐受性。 [2]

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AUNP-12，可能与之前命名为Aur-012、Aurigene-012或Aurigene NP-12的化合物相同，是一种PD-1通路抑制剂，目前正在开发用于治疗多种癌症。它是迄今为止该通路中唯一的肽类药物，与现有疗法[2-4]相比，它可能提供更有效、更安全的联合治疗方案，例如与抗体药物联合使用，如Nivolumab（百时美施贵宝）、Lambrulizumab（默克-3475）、CT-011（Curetech）、MDX-1105（百时美施贵宝）、MPDL3280（GNE）和MEDI-4736（Medimmune-AZ），或Amplimmune的PD-L2-FC融合蛋白。PD-1，即程序性死亡受体1，是一种属于CD28家族的免疫受体，在负向调节免疫反应中发挥重要作用。 PD-1的氨基酸蛋白结构包括胞外氨基酸IgV结构域、跨膜区和胞内尾部。PD-1表达于活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞表面，并具有两种配体：PD-L1和PD-L2，二者均属于B7家族。PD-L1几乎在所有小鼠肿瘤细胞系中均有表达，而PD-L2的表达则较为局限，主要由树突状细胞（DC）和少数肿瘤细胞系表达。阻断PD-1信号通路已被证实能够恢复癌症和慢性感染中受损的免疫细胞功能。近年来，利用抗体或融合蛋白抑制包括PD-1在内的免疫检查点蛋白取得了显著进展，获得了高度持久的临床疗效，并彻底改变了癌症治疗的前景。然而，在取得显著临床疗效的同时，由于免疫耐受的破坏，严重的免疫相关不良事件（irAEs）也日益突出。由于抗体的半衰期较长（>15-20天）且靶点占有率>70%可持续数月，持续的靶点抑制可能是临床上观察到的抗免疫检查点蛋白抗体治疗中出现严重免疫相关不良事件（irAEs）的原因之一。[2]

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抗PD-1和CTLA4等免疫检查点的抗体已取得突破性成功，为癌症免疫治疗开辟了新的途径。然而，尽管抗体疗法展现出显著的临床疗效，但由于免疫耐受的破坏，其严重免疫相关不良事件（irAEs）的发生率也日益增加。为了更好地控制这些严重不良反应，我们致力于发现一种药代动力学特征更短的PD-1信号通路拮抗剂。本文描述了一种肽拮抗剂NP-12，它在恢复淋巴细胞增殖和效应功能方面，对PD-L1和PD-L2均表现出等效的拮抗作用。在黑色素瘤、结肠癌和肾细胞癌的临床前模型中，NP-12 展现出与市售 PD-1 靶向抗体相当的显著疗效，能够抑制原发肿瘤的生长和转移。值得注意的是，NP-12 在预先建立的 CT26 模型中的抗肿瘤活性与其药效学效应密切相关，表现为肿瘤内 CD4 和 CD8 T 细胞的募集，以及肿瘤和血液中 PD-1+ T 细胞（包括 CD4 和 CD8）数量的减少。此外，在预先建立的肿瘤模型中，NP-12 与肿瘤疫苗或已知可诱导“免疫细胞死亡”的化疗药物（如环磷酰胺）联合使用时，显示出增强的抗肿瘤活性。总之，NP-12 是首个靶向 PD-1 信号通路的合理设计的肽类疗法，具有免疫激活作用、优异的抗肿瘤活性，并有望更好地控制免疫相关不良事件 (irAEs)。[3]

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AUNP-12 是一种由 29 个氨基酸组成的肽（序列：专门设计为 PD-1/PD-L1 双重拮抗剂）。它已进入早期临床试验（I 期），用于治疗晚期实体瘤，可作为单药或与其他免疫疗法联合使用。该肽为基于单克隆抗体的 PD-1/PD-L1 阻断疗法（例如，帕博利珠单抗、纳武利尤单抗）提供了一种替代方案。仅供研究使用；未经批准的临床试验，不得用于人体治疗。

C142H226N40O48.C2HF3O2

3375.57

AUNP-12;1353563-85-5

White to off-white solid powder

(4S)-5-amino-4-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-bis[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-amino-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid TFA

AUNP-12 TFA; 1353563-85-5; AUNP12 TFA; NP-12 TFA; CHEMBL4635204; AUNP-12, AUR-012 TFA; NONYLPHENOL POLYOXYETHYLENE ETHER; G13071 TFA

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。