PD-1 signaling pathway[1]

NP-12 TFA 对 PD-L1 和 PD-L2 表现出等价拮抗作用，从而促进淋巴细胞增殖及其执行效应器任务的能力 [1]。 NP-12 TFA 针对 rmPD-L1 和 rmPD-L2 的平均 EC50 值分别为 17 nM 和 16.6 nM，可恢复小鼠脾细胞检测系统中的增殖 [1]。此外，NP-12 TFA 已被证明可显着减轻重组人 PD-L1 和 PD-L2 介导的体外人 PBMC 增殖抑制，针对 PD-L1 和 PD-L2 的平均 EC50 值为 63.3 nM 和 44.1 nM ，分别[1]。

AUNP-12 抑制小鼠皮下注射的 B16F10 小鼠黑色素瘤细胞的 44% 肿瘤生长（5 mg/kg，皮下注射，每天一次，14 天）；它减少静脉注射 B16F10 细胞的肺转移。小鼠（5 mg/kg，皮下注射，每天一次，11 天）；将原位注射至小鼠乳腺脂肪垫的 4T1 细胞（3 mg/kg，皮下注射，每天一次，40 天）抑制 44% 的肿瘤生长。接受 AUNP-12 治疗的动物中，10% 的动物肿瘤生长完全消退，另外 10% 的动物肿瘤生长部分消退。安乐死后测量，AUNP-12治疗的动物的肺转移平均减少>60%。

AUNP-12 在使用表达 hPDL2 的 HEK293 细胞抑制 PD1 与 PD-L2 结合时显示 EC50 = 0.72 nM，在使用表达 hPDL1 的 MDA-MB231 细胞的大鼠外周血单核细胞 (PBMC) 增殖测定中显示 EC50 = 0.41 nM 。这与 AUNP-012 报道的“破坏 PD1-PDL1/2 相互作用的亚纳摩尔效力”很好地对应。

AUNP-12 在使用表达 hPDL2 的 HEK293 细胞抑制 PD1 与 PD-L2 结合时显示 EC50 = 0.72 nM，在使用表达 hPDL1 的 MDA-MB231 细胞的大鼠外周血单核细胞 (PBMC) 增殖测定中显示 EC50 = 0.41 nM 。

AUNP-12 is active in vivo in a lung metastasis model of B16F10 melanoma in mice, showing a 64% reduction in metastasis at 5 mg/kg (subcutaneous, once daily, 14 days).[2]

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Pharmacokinetics of AUNP-12 in Balb/c mice[3]
All animal experimental procedures used in these studies including pharmacokinetic, pharmacodynamic, and efficacy experiments were approved by the Institutional Animal Ethical Committee based on the Committee for the Purpose of Control and Supervision on Experiments on Animals (India) guidelines. AUNP-12 was administered either intravenously or subcutaneously to the animals at a dose of 3 mg/kg to determine the pharmacokinetic parameters using 5% dextrose water as formulation. After administration, blood samples were collected at regular intervals until 24 hours and centrifuged to obtain the plasma fraction. The plasma samples were processed by SPE method and the eluent were analyzed by LC/MS-MS to determine the plasma concentration of the compound. From intravenous administration, plasma concentration after injection (C0 minutes), the area under the concentration−time curve from time zero to infinity (AUC 0−∞), the mean residence time, volume of distribution (Vdss), and clearance (CL) for each mouse were obtained. The maximum plasma concentration (Cmax), time to reach maximum plasma concentration (Tmax), and AUC 0−∞ were obtained from subcutaneous administration of AUNP-12 . On the basis of the intravenous and subcutaneous parameters, bioavailability of AUNP-12 was calculated.

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Syngeneic mouse studies[3]
In all in vivo tumor growth inhibition (TGI) studies, tumor volumes were measured two times weekly using digital calipers and the volume was expressed in mm3 using the formula V = 0.5a × b2, where a and b are the long and short diameters of the tumor, respectively. Body weights and clinical signs were monitored twice a week. AUNP-12 was dissolved in 5% dextrose water for all the in vivo studies, except for B16F10 mouse melanoma and Renca tumor models where 1 × PBS was used. Fresh formulation was prepared every day. Compound and vehicle controls were dosed subcutaneously once a day at a dosing volume of 10 mL/kg body weight.

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[1]. US 2011/0318373 A1
[2]. Cancer Research, vol. 72, no. 8 Suppl. 1, Abstract 2850, 2012.
[3]. A Rationally Designed Peptide Antagonist of the PD-1 Signaling Pathway as an Immunomodulatory Agent for Cancer Therapy. Mol Cancer Ther. 2019 Jun;18(6):1081-1091.

进一步的体内研究表明，AUNP-12/AUR-012 具有优异的药代动力学-药效动力学相关性，且药效持续时间超过 24 小时。在黑色素瘤、乳腺癌和肾癌的临床前模型中，AUR-012/AUNP-12 在抑制原发肿瘤生长和转移方面均显示出优于目前临床使用的治疗药物的疗效。值得注意的是，每三天给药一次与每日给药一次疗效相当，且未观察到明显的毒性反应和中和活性。[9] 用抗 CD3/抗 CD-28 抗体刺激后分析免疫细胞增殖情况，结果表明 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的增殖得到完全恢复。有趣的是，AUR-012/AUNP-12 治疗完全抑制了 CD4+ Foxp3+ T 细胞的增殖，表明调节性 T 细胞的增殖被完全抑制。循环免疫细胞的持续激活及其分泌IFN-γ的能力可持续长达72小时，表明即使在动物模型中化合物清除后，其药效仍能持续存在，因此支持长达3天的给药间隔。在黑色素瘤、乳腺癌、肾癌和结肠癌模型中，AUR-012/AUNP-12均显示出抑制原发肿瘤生长和转移的疗效。此外，在预先建立的CT26模型中，该化合物的抗肿瘤活性与药效密切相关，表现为肿瘤内CD4+和CD8+ T细胞的募集，以及肿瘤和血液中PD1+ T细胞（包括CD4+和Page7/12阳性CD8+细胞）的减少。在为期14天的重复给药毒性研究中，AUR-012/AUNP-12在100倍有效剂量下具有良好的耐受性。 [2]

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AUNP-12，可能与之前代号为Aur-012、Aurigene-012或Aurigene NP-12的化合物相同，是一种PD-1通路抑制剂，目前正在开发用于多种癌症适应症。它是迄今为止该通路中唯一的肽类药物，与现有疗法相比，[2-4] 它可能提供更有效、更安全的联合治疗机会，例如抗体药物如Nivolumab（百时美施贵宝）、Lambrolizumab（默克-3475）、CT-011（Curetech）、MDX-1105（百时美施贵宝）、MPDL3280（GNE）和MEDI-4736（Medimmune-AZ），或Amplimmune的PD-L2-FC融合蛋白。PD-1，即程序性死亡受体1，是一种属于CD28家族的免疫受体，在负向调节免疫反应中发挥重要作用。 PD-1的氨基酸蛋白结构包括一个胞外氨基酸IgV结构域、跨膜区和一个胞内尾部。PD-1表达于活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞表面，并有两个配体：PD-L1和PD-L2，它们均属于B7家族。PD-L1几乎表达于所有小鼠肿瘤细胞系，而PD-L2的表达则更为局限，主要由树突状细胞（DC）和少数肿瘤细胞系表达。阻断PD-1信号通路已被证实能够恢复癌症和慢性感染中受损的免疫细胞功能。近年来，利用抗体或融合蛋白抑制包括PD-1在内的免疫检查点蛋白，取得了显著进展，实现了高度持久的临床疗效，彻底改变了癌症治疗的前景。然而，在取得显著临床疗效的同时，由于免疫耐受的破坏，严重的免疫相关不良事件（irAEs）也日益凸显。由于抗体半衰期长（>15-20天）且靶点占有率>70%可持续数月，持续的靶点抑制可能是导致临床上观察到的针对免疫检查点蛋白的抗体产生严重免疫相关不良事件（irAE）的原因之一。[2]

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针对PD-1和CTLA4等免疫检查点的抗体取得了突破性成功，为癌症免疫治疗开辟了新的途径。然而，在展现出显著临床疗效的同时，由于免疫耐受的破坏，基于抗体的治疗方法中也日益凸显出严重的免疫相关不良事件（irAE）。为了更好地控制这些严重不良反应，我们致力于发现一种具有更短药代动力学特征的PD-1信号通路拮抗剂。本文中，我们描述了一种肽拮抗剂NP-12，它在恢复淋巴细胞增殖和效应功能方面对PD-L1和PD-L2均表现出等效的拮抗作用。在黑色素瘤、结肠癌和肾癌的临床前模型中，NP-12 显示出与市售 PD-1 靶向抗体相当的显著疗效，能够抑制原发肿瘤的生长和转移。值得注意的是，NP-12 在预先建立的 CT26 模型中的抗肿瘤活性与药效学效应密切相关，表现为肿瘤内 CD4 和 CD8 T 细胞的募集，以及肿瘤和血液中 PD-1+ T 细胞（包括 CD4 和 CD8）数量的减少。此外，在预先建立的肿瘤模型中，NP-12 与肿瘤疫苗或已知可诱导“免疫细胞死亡”的化疗药物（如环磷酰胺）联合使用时，也显示出增强的抗肿瘤活性。总之，NP-12 是首个经合理设计的靶向 PD-1 信号通路的肽类治疗药物，具有免疫激活作用、优异的抗肿瘤活性，并有望更好地控制免疫相关不良事件 (irAEs)。[3]

C142H226N40O48.C2HF3O2

3375.57

AUNP-12;1353563-85-5

White to off-white solid powder

(4S)-5-amino-4-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-bis[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-amino-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid TFA

AUNP-12 TFA; 1353563-85-5; AUNP12 TFA; NP-12 TFA; CHEMBL4635204; AUNP-12, AUR-012 TFA; NONYLPHENOL POLYOXYETHYLENE ETHER; G13071 TFA

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。