| 规格 | 价格 | |
|---|---|---|
| 500mg | ||
| 1g | ||
| Other Sizes |
| 靶点 |
human P2X3 (pIC50 = 8.0); rat P2X3 (pIC50 = 8.0); human P2X2/3 (pIC50 = 7.3)
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|---|---|
| 体外研究 (In Vitro) |
在表达重组大鼠和人 P2X3 以及人 P2X2/3 通道的细胞系中，AF-353 (Ro-4) 在抑制 α,β-meATP 引起的细胞内钙通量方面表现出强大的效力 [1]。 AF-353 (Ro-4) 的 p50 为 7.3，同样能抑制人 P2X2/3 通道活性，但效力稍差 [1]。
采用放射配体结合、细胞内钙通量和全细胞电压钳电生理学方法测定AF-353对大鼠和人P2X3和人P2X2/3受体的拮抗效力（pIC（50））。 关键结果：这些受体的pIC（50）估计值在7.3至8.5之间，而300倍高的浓度对其他P2X通道或各种受体、酶和转运蛋白几乎没有影响。与A-317491和TNP-ATP相比，竞争结合和细胞内钙通量实验表明，AF-353以非竞争方式抑制ATP的激活。 结论和意义：有利的药代动力学特征与P2X3和P2X2/3受体的拮抗剂效力和选择性的结合表明，AF-353是动物模型中研究这些通道的优秀体内工具化合物，并证明了将分子鉴定和优化为潜在临床候选物的可行性，并最终成为治疗疼痛相关疾病的新型疗法[1]。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
AF-353 (Ro-4)（10 mg/kg、20 mg/kg；静脉注射；持续 4-6 小时）可抑制正常和脊髓损伤 (SCI) 大鼠的嘌呤能反应 [2]。它还会缩短正常大鼠的收缩期间隔，但不会缩短 SCI 大鼠的收缩期 [2]。然而，SCI 大鼠中不排尿 (NVC) 的频率显着降低。 AF-353 (Ro-4) 不会损害氧气水平或心脏功能 [2]。
通过在T8-T9处完全横断诱导雌性大鼠脊髓损伤（SCI），并在4周后膀胱过度活动时进行实验。非横断大鼠用作对照（正常大鼠）。记录脊髓背角的神经活动，并通过耻骨上导管获取场电位，以响应膀胱内压力步骤。在对照条件下、用膀胱内ATP（1mm）刺激膀胱粘膜嘌呤能受体后以及静脉注射P2X3/P2X2/3拮抗剂AF-353（10mg/kg和20mg/kg）后记录场电位。在尿烷麻醉的大鼠膀胱内注入生理盐水进行膀胱测量。在基线记录后全身应用AF-353（10mg/kg）；大鼠还接受了第二剂AF-353（20mg/kg）。评估排尿（VC）和非排尿（NVC）收缩频率的变化。 结果：SCI大鼠的场电位和NVC频率明显高于NL大鼠。在对照组而非SCI大鼠中，膀胱内ATP增加了场电位频率，而全身AF-353显著降低了两组的这一参数。AF-353也减少了对照组大鼠的收缩间期，但在SCI大鼠中没有；然而，SCI大鼠的NVC频率显著降低。 结论：膀胱传入神经上的P2X3/P2X2/3受体正向调节过度活动膀胱的感觉活动和NVCs[2]。 |
| 酶活实验 |
药理学选择性[1]
通过测量AF-353对表达重组P2X通道的细胞系中激动剂诱发的细胞内钙通量的拮抗效力，确定了AF-353对P2X3和P2X2/3通道的选择性优于其他同源P2X通道（见上文）。此外，在两个广泛的商业选择性小组中检查了AF-353，一个涵盖75个受体、通道、酶和转运蛋白，另一个涵盖100多种激酶（Ambit）。 放射性配体结合[1] 使用四环素非表达载体（Lachnit等人，2000）或表达hP2X3或hP2X2/3的1321N1人星形细胞瘤细胞，在来自表达大鼠P2X3（CHO-rP2X3）离子通道的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）的膜中进行了放射性配体结合实验。在1X Versene中收获细胞，用Polytron在冰冷的50 mM Tris pH 7.4中用1X Complete™蛋白酶抑制剂混合物均质化。通过两步离心分离质膜。均质化膜在4°C下以1000×g离心15分钟。丢弃1000×g颗粒，将上清液在4°C下以43000×g离心30分钟。丢弃43000×g上清液，将沉淀物储存在-70°C下，直至进行分析。氚标记的AF-353（81.2 Ci·mmol−1）由罗氏放射化学部门合成；HPLC证实纯度>97%。在50mM Tris pH 7.4的平衡结合条件下测定P2X3和P2X2/3膜上的配体亲和力。[3H]-AF-353（同聚体离子通道为1.7–140 nM，异聚体离子信道为1.3–660 nM）与膜（200–350µg·mL-1）在不存在或存在10µM未标记的AF-353>类似物AF-010（用于定义非特异性结合）的情况下在22°C下孵育2–5小时，以确定其平衡解离亲和力常数（Kd）以及膜的受体表达水平（Bmax）。对于未标记分子，通过将未标记分子（连续稀释超过百万倍浓度范围）与[3H]AF-353（1-5nM）和CHO-rP2X3膜共孵育来确定解离亲和力常数（KB）。在所有情况下，通过在GF/B过滤器上用冰冷的50 mM Tris（pH 7.4）过滤来结束孵育。在使用Perkin-Elmer TopCount平板读数器定量过滤器捕获的放射性之前，将过滤器浸泡在MicroScint-20闪烁混合物中至少3小时。使用四参数双曲函数通过非线性回归分析竞争结合数据，以估计曲线最大值、曲线最小值、希尔斜率和IC50；使用Cheng-Prusoff方程根据观察到的IC50值计算KB估计值（Cheng和Prusoff，1973）。亲和力表示为在两到四个重复实验中确定的平均值和标准偏差。 [3H]AF-353和其他未标记的测试配体之间结合模式的竞争评估是基于Cheng-Prusoff关系的预期，该关系描述了两个配体以互斥的方式结合（Cheng和Prusoff，1973）。这种关系由方程内联图描述，其中[A*]表示放射性配体浓度，Kd表示A*的平衡解离常数，KB表示未标记的测试化合物的平衡解离常量，IC50是置换A*结合50%的测试化合物浓度。在上述条件下，通过在没有或存在竞争剂的情况下将CHO-rP2X3膜与[3H]-AF-353一起孵育，进行了放射性配体结合研究。对于这项分析，在5-8个不同的放射性配体浓度范围内（[3H]-AF-353 0.1-60 nM），确定了每种未标记的测试化合物的IC50值。观察到的IC50值以IC50/KB与[a*]/Kd的比率绘制，用于所有测试浓度的放射性配体（a*）。根据Cheng-Prusoff方程，未标记配体和[3H]AF-353之间的竞争相互作用将绘制为斜率为1、Y轴截距为1的直线。 |
| 细胞实验 |
全细胞电压钳电生理学[1]
在这些实验中，我们采用了标准的千兆密封膜片钳技术来研究P2X2/3通道。膜片钳装置由以下部件组成：防振台、显微镜、显微操作器、膜片钳放大器、数字化仪、药物灌注系统和采集软件。 对于记录，浴溶液由（以mM计）155 NaCl、5 KCl、2 CaCl2、1 MgCl2、10 d-葡萄糖、10 HEPES组成，pH 7.4，含NaOH，310 mOsM，移液管细胞内溶液由（以mM计）130 CsF、10 NaCl、10 EGTA、1 MgCl2、10 HEPES组成，pH 7.2，含CsOH，290mOsM。用Sutter Instruments P-87移液管拉拔器拉拔标准壁硼硅酸盐玻璃电极（外径1.50 mm，内径0.87 mm，带细丝）。所用电极的平均电阻为3.5MOhm。为了激活P2X2/3异聚体通道，使用10µMα，β-meATP溶液（用NaOH调节pH值）。该值大约是实验条件下信道的EC50。以约30秒的规则间隔激活通道2秒。当来自通道的电流在至少三次激动剂应用中保持一致时（约90秒），加入测试化合物。监测化合物引起的堵塞，直至达到平衡，然后洗掉化合物以确定失速动力学。 |
| 动物实验 |
动物/疾病模型： 脊髓损伤（SCI）雌性SD（Sprague-Dawley）大鼠（250-300 g）[2]
剂量： 10 mg/kg，20 mg/kg 给药途径： 静脉注射；静脉注射；静脉注射。间隔90分钟，持续4至6小时。 实验结果： 正常大鼠和SCI大鼠的嘌呤能反应均显著降低。刺激方案[2] 在膀胱内压力从0到60 cmH2O的阶跃过程中评估脊髓场电位。为了刺激膀胱内嘌呤能受体，每个实验分为三个部分。首先，膀胱内灌注生理盐水；其次，膀胱内灌注含1 mM ATP的生理盐水；第三，在膀胱内灌注1 mM ATP的同时，连续两次（10或20 mg/kg）静脉注射AF-353（即5-[5-碘-4-甲氧基-2-(1-甲基乙基)苯氧基]-2,4-嘧啶二胺盐酸盐，RO-4盐酸盐）。每次注射后，膀胱压力刺激持续1分钟，随后进行3分钟的无压力恢复期。此过程重复两次。实验总时长为4至6小时，AF-353两次注射间隔90分钟。 膀胱测压术的术前准备[2] 对照组或脊髓损伤（SCI）大鼠均采用1.0 g/kg氨基甲酸乙酯（皮下注射）麻醉。将一根耻骨上导管经膀胱顶部置入，另一根导管插入颈静脉用于药物输注。 膀胱测压评估[2] 将膀胱导管连接至注射泵，以0.12 mL/min的流速持续输注生理盐水2小时，同时使用连接至数据采集系统的压力传感器（World Precision Instruments）测量膀胱收缩。根据膀胱收缩期间是否排出生理盐水，将膀胱收缩分为排尿性收缩（VC）和非排尿性收缩（NVC）。基线记录后，大鼠接受 10 mg/kg 剂量的 AF-353 给药，2 小时后再次接受 20 mg/kg 剂量的给药。使用 WINDAQ 回放程序计算每种条件下最后 60 分钟的收缩频率。血液采集 [1] 使用肝素锂作为抗凝剂，在预定时间点从颈静脉采集血液。以 3000×g 离心 5 分钟后，获得血浆并储存在 -80°C 直至分析。[1] 血浆蛋白结合 [1] 从 Pel-Freez® Biologicals 公司获得肝素化大鼠血浆，并储存在 -80°C 直至使用。使用 Centrifree 微孔板分离装置将未结合的物质与蛋白结合的物质分离。将 AF-353 添加到肝素化超滤血浆 (n = 3) 中，使其最终浓度达到 200 至 5000 ng·mL−1。将 1 毫升血浆溶液和 0.3 毫升超滤液加入过滤装置中，并在 2000×g 下离心（固定角度）20 分钟。 |
| 药代性质 (ADME/PK) |
为了评估 AF-353 作为研究体内 P2X3 和 P2X2/3 受体拮抗作用的工具的实用性，我们分别以 2 mg·kg−1 的剂量静脉注射和口服 AF-353 混悬液给大鼠给药。测定的相关药代动力学参数见表 3。AF-353 具有良好的口服生物利用度（F = 32.9%），达峰时间 (Tmax) 约为 30 分钟，血浆半衰期为 1.63 小时。通过测定脑/血浆浓度比值 (B/P) 来确定其中枢神经系统渗透性；AF-353 具有很高的中枢神经系统渗透性，B/P 比值为 6（脑提取总浓度/血浆总浓度）。此外，体外测定显示，AF-353 在大鼠血浆中的蛋白结合率为 98.2%。 [1] 在大鼠中观察到良好的药代动力学参数，具有良好的口服生物利用度（%F = 32.9）、合理的半衰期（t(1/2) = 1.63 小时）和血浆游离分数（98.2% 蛋白结合）。
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| 参考文献 | |
| 其他信息 |
背景与目的：含有P2X3亚基的嘌呤受体（P2X3同源三聚体和P2X2/3异源三聚体）属于ATP门控P2X离子通道家族，可能参与多种疼痛相关疾病中的初级传入神经敏化。本研究描述了新型口服生物利用度高、高效且选择性强的P2X3/P2X2/3受体拮抗剂AF-353的体外药理学特性。实验方法：采用放射性配体结合、细胞内钙流和全细胞电压钳电生理方法测定了AF-353对大鼠和人P2X3受体以及人P2X2/3受体的拮抗效价（pIC50）。主要结果：这些受体的pIC(50)估计值范围为7.3至8.5，而浓度高300倍时对其他P2X通道或多种受体、酶和转运蛋白几乎没有影响。与A-317491和TNP-ATP不同，竞争性结合和细胞内钙流实验表明，AF-353以非竞争性方式抑制ATP的激活。在大鼠体内观察到良好的药代动力学参数，包括良好的口服生物利用度（%F = 32.9）、合理的半衰期（t(1/2) = 1.63 h）和血浆游离分数（98.2%蛋白结合）。结论和意义：AF-353 具有良好的药代动力学特征，同时对 P2X3 和 P2X2/3 受体具有拮抗效力和选择性，表明 AF-353 是一种优秀的体内工具化合物，可用于在动物模型中研究这些通道，并证明了筛选和优化分子成为潜在临床候选药物，最终开发出一类治疗疼痛相关疾病的新型疗法的可行性。[1]
我们采用体内电生理和膀胱测压法评估了选择性 P2X3/P2X2/3 拮抗剂 AF-353 对正常大鼠和脊髓损伤 (SCI) 大鼠膀胱感觉通路的影响。结果显示：(i) 与正常大鼠相比，SCI 大鼠的基础脊髓神经活动增强；(ii) 与正常大鼠不同，SCI 大鼠在受到有害压力刺激后，膀胱内注射 ATP 激活嘌呤能受体并未增强脊髓神经活动； （iii）在正常大鼠和脊髓损伤大鼠中，全身应用选择性 P2X3/P2X2/3 拮抗剂 AF-353 可显著降低对化学物质（ATP）和有害压力刺激的脊髓神经活动；（iv）与电生理结果一致，AF-353 可显著降低正常大鼠和脊髓损伤大鼠的反射性膀胱收缩。[2] |
| 分子式 |
C14H18CLIN4O2
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|---|---|
| 分子量 |
436.68
|
| CAS号 |
927887-18-1
|
| PubChem CID |
46837686
|
| 外观&性状 |
Typically exists as solids at room temperature
|
| LogP |
5.134
|
| tPSA |
96.28
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
3
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
6
|
| 可旋转键数目(RBC) |
4
|
| 重原子数目 |
22
|
| 分子复杂度/Complexity |
334
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
|
| SMILES |
C1(N)=NC=C(OC2=CC(I)=C(OC)C=C2C(C)C)C(N)=N1.[H]Cl
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| 别名 |
Ro-4 hydrochloride; AF-353 hydrochloride; 927887-18-1; 5-(5-Iodo-2-isopropyl-4-methoxyphenoxy)pyrimidine-2,4-diamine hydrochloride; 5-(5-iodo-4-methoxy-2-propan-2-ylphenoxy)pyrimidine-2,4-diamine;hydrochloride; Ro 4 hydrochloride; AF-353 (hydrochloride); SCHEMBL2482416; QRBBKDZPXABQPE-UHFFFAOYSA-N;
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
|
| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.2900 mL | 11.4500 mL | 22.9001 mL | |
| 5 mM | 0.4580 mL | 2.2900 mL | 4.5800 mL | |
| 10 mM | 0.2290 mL | 1.1450 mL | 2.2900 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
HW091077
UB-MBX-46
P2X3 antagonist 39
HEI3090
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