Prothioconazole   中文名称: 丙硫唑

CYP51; fungicidal

Prothioconazole是一种用于农业的新型三唑类杀菌剂。我们使用白色念珠菌CYP51（CaCYP51）研究了丙环唑的体外活性，并考虑了此类化合物在医学领域的应用。用Prothioconazole、去硫Prothioconazole和伏立康唑处理白色念珠菌细胞导致CYP51抑制，这可以从14α-甲基化甾醇底物（羊毛甾醇和依必考）的积累和麦角甾醇的耗竭中得到证明。然后，我们比较了Prothioconazole、去硫Prothioconazole和伏立康唑与CaCYP51的抑制剂结合特性。我们观察到，去硫Prothioconazole和伏立康唑以唑类抗真菌药物的预期方式与CaCYP51非竞争性结合（II型抑制剂与血红素结合作为第六配体），而Prothioconazole则竞争性结合，没有表现出经典的抑制剂结合谱。在无细胞实验中，对CaCYP51活性的抑制表明， Prothioconazole-desthio具有活性，而Prothioconazole不抑制CYP51活性。发现在Prothioconazole存在下生长的白色念珠菌提取物中含有Prothioconazole。我们得出结论，Prothioconazole的抗真菌作用可归因于Prothioconazole-desthio[1]。

抗真菌结合测定。[1]
本研究中使用的唑类化合物的化学结构如图1所示。唑与CaCYP51的结合如前所述进行。在DMF中制备2 mg·ml−1的Prothioconazole储备溶液、0.2 mg·ml-1的Prothioconazole去硫溶液和0.1 mg·ml-1的伏立康唑溶液。在0.1 M Tris-HCl（pH 8.1）和25%（重量/体积）甘油中，用5μM CaCYP51逐步滴定唑，每次加入后测定500至350 nm之间的差谱。对每种化合物进行三次偶氮结合测定。结合饱和度曲线由ΔApeak谷对唑浓度构建。当配体结合“紧密”时，使用Morrison方程的重排来确定解离常数（Kd）值。当唑的Kd接近或低于CYP51的浓度时，观察到紧密结合。当配体结合不紧密时，使用Michaelis-Menten方程。报告的Kd值是三次重复的平均值以及相关的标准偏差。

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底物结合研究。[1]
如前所述，制备0.1%（wt/vol）羊毛甾醇在0.5%（vol/vol）吐温80中的水溶液。在含有P450的参考试管中加入等量的0.5%（体积/体积）吐温80，在样品试管中用10μM CaCYP51逐步滴定Lanosterol。每次增量添加羊毛甾醇后，确定500至350 nm之间的吸光度差光谱，并根据ΔA385-419构建结合饱和度曲线，包括对样品体积变化的校正。使用Michaelis-Menten方程通过非线性回归（Levenberg-Marquardt算法）确定底物结合常数（Ks）。羊毛甾醇的Ks值是三次重复的平均值以及相关的标准偏差。CaCYP51的自旋态变化是使用118 mM−1·cm−1的消光系数从ΔA385-419值计算出来的，该消光系数是为CYP164A2的I型差谱推导出来的，通过物理化学手段从100%低自旋调节到近100%高自旋。

在存在和不存在4μM伏立康唑、100μMProthioconazole和4μMProthioconazole-desthio的情况下，用10μM CaCYP51测定Lanosterol结合差异光谱。在1.25%（体积/体积）DMF存在下进行阴性对照测定。测定一式三份，并根据所得CaCYP51底物结合光谱构建Lineweaver Burk图。

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CYP51重构试验和IC50测定。[1]
使用之前描述的含有2.5μM CaCYP51和10μM截短酵母细胞色素P450还原酶的CYP51酶重构系统。通过加入2 ml 15%（wt/vol）KOH的乙醇溶液终止反应，然后在85°C下孵育90分钟。在37°C下温育和加入β-NADPH-Na4之前，通过在5μl DMF中加入不同浓度的伏立康唑、Prothioconazole和Prothioconazole-desthio进行IC50测定。如下所述，提取甾醇底物和产物并通过GC/MS进行分析。

细胞的抗真菌治疗。[1]
白色念珠菌细胞在RPMI 1640 l-谷氨酰胺中生长过夜。起始浓度为1×103个细胞/ml，用于接种含有4μg·ml−1Prothioconazole、4μg•ml−1 Prothioconazole-desthio或1μg•ml-1伏立康唑的RPMI培养基（最终浓度均为1%DMSO）和含有1%DMSO的对照（未处理）。培养物在37°C和200 rpm下孵育过夜，收获细胞，在提取甾醇之前用去离子水洗涤两次。

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从白色念珠菌细胞和生长培养基中固相提取抗真菌药物。[1]
将来自白色念珠菌（ATCC SC5314）过夜培养物的100μl 1×107个细胞/ml的等分试样传代培养到250 ml RPMI l-谷氨酰胺和酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）肉汤中，肉汤中含有8μg·ml-1的终浓度为1%（体积/体积）DMSO的Prothioconazole（和不含任何Prothioconazole的对照），并在37°C和200 rpm下孵育24小时。收集细胞，用去离子水洗涤三次，然后在99:1甲醇：乙酸中超声处理（60秒爆发，60秒静置10分钟）。然后将样品在真空离心机中干燥，并重新悬浮在20%（体积/体积）甲醇中。Sep-Pak药筒（Vac 3 cc，200 mg）通过用6 ml甲醇洗涤，随后用6 ml 20%（体积/体积）甲醇洗涤制备。将提取物分别施加到药筒上，然后用4个连续的1ml体积的40%、60%、80%和100%（体积/体积）甲醇洗涤。每次洗涤时收集洗脱液。

以与细胞提取所述类似的方式制备用于白色念珠菌生长的含有Prothioconazole的培养基提取物、含有Prothioconazole且无细胞的对照培养基提取物，以及含有Prothioconazole且无细胞无菌去离子水提取物。在固相萃取之前，将甲醇加入样品中以达到20%（体积/体积）的最终浓度（标准品在20%[体积/体积]甲醇中稀释）。

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Prothioconazole和Prothioconazole-desthio的鉴别。[1]
样品在Q-Tof Ultima光谱仪上以正离子模式通过ESI-MS和-MS/MS进行分析。样品从纳米ESI金属涂层毛细管中电喷雾，用氩气实现碰撞诱导解离。使用了以下仪器参数：毛细管电压，1.8 kV；碰撞电压，MS为8V（MS/MS为25V）；m/z范围为50至1000；扫描时间2.4秒/次；MCP检测器电压，2100 V。仪器在使用前立即用1 pmol/μl Glu-1-纤维蛋白肽B进行了校准。获得的数据使用MassLynx V4.1软件包进行处理。

通过测量的质量和通过MS/MS获得的裂解模式鉴定了Prothioconazole和Prothioconazole-desthio。发现在80%（体积/体积）甲醇洗脱液中，Prothioconazole和Prothioconazole-desthio标准品最为丰富；因此，通过比较所有样品的80%（体积/体积）甲醇洗脱剂来进行提取分析。

吸收、分布和排泄
单次口服低剂量丙硫菌唑后，雄性大鼠的吸收率（三唑标记）约为94%。根据48小时三唑标记的排泄过程外推，估计48小时苯基标记的吸收率约为90%。血浆放射性时间进程数据显示，单次口服低剂量后吸收迅速，雄性和雌性大鼠的血浆峰浓度均出现在给药后0.33至0.66小时之间。单次口服高剂量后，雄性和雌性大鼠的血浆峰浓度均出现在给药后0.66至1.00小时之间。苯基标记的丙硫菌唑的吸收速度略快，雄性大鼠单次口服低剂量后，血浆峰浓度出现在0.16至0.33小时之间；雄性和雌性大鼠重复口服低剂量后，血浆峰浓度均出现在0.16小时。血浆浓度曲线出现波动，表明放射性物质经历了肠肝循环。这种效应在雌性大鼠中更为显著。与雄性大鼠相比，雌性大鼠的吸收也略有延迟。单次口服低剂量168小时后，大鼠体内残留放射性较低。对于三唑标记物，雄性大鼠的组织和胴体中回收了1.5%的给药剂量，雌性大鼠中回收了0.4%。肝脏、胴体和胃肠道中的组织浓度最高。在所有其他检测的组织中，残留放射性水平在0.0004%至0.07%之间。对于苯基标记（仅用于雄性），在组织和胴体中回收了5.8%的给药剂量。组织中放射性水平最高的是胃肠道、肝脏和胴体。在所有其他检测的组织中，残留放射性水平在0.0001%至0.05%之间。重复口服低剂量48小时后，大鼠体内残留放射性也很低，雄性大鼠在组织和胴体中回收了3.8%的给药剂量，雌性大鼠回收了0.8%。组织中放射性水平最高的是肝脏、胃肠道和胴体。在所有其他检测的组织中，残留放射性水平在0.0002%至0.05%之间。雄性大鼠的全身累积量以及肝脏累积量始终高于雌性大鼠。单次口服高剂量后168小时，大鼠体内残留放射性也很低，雄性和雌性大鼠的尸体和组织中回收的放射性剂量均为给药剂量的0.11%。雄性和雌性大鼠的全身放射性累积量大致相同，但雄性大鼠的肝脏放射性累积量更高。两种标记物和两种性别的主要排泄途径均为粪便。单次口服低剂量（三唑标记）后，两种性别大鼠的总回收率约为给药剂量的94-95%，其中雄性大鼠10%、雌性大鼠16%的给药剂量经尿液排出，雄性大鼠84%、雌性大鼠78%的给药剂量经粪便排出。苯基标记组（仅限雄性大鼠）中，5%的给药剂量经尿液排出，85%经粪便排出，总回收率约为90%。在胆管插管三唑标记组（仅限雄性）中，约90%的给药剂量在24-48小时内经胆汁排出。在苯基标记组（仅限雄性）中，约81%的给药剂量在24小时后经胆汁排出，93%在48小时后排出。
在全身放射自显影分布研究中，雄性动物给药后1小时达到峰值浓度，并持续下降直至168小时处死。雌性动物的吸收略有延迟，部分组织在给药后8小时达到峰值浓度。肝脏中药物浓度最高（雄性最高达 1.78 g/g，雌性最高达 0.97 μg/g），其次是肾脏（肾髓质，最高达 0.64 g/g）、棕色/肾周脂肪（最高达 0.36 μg/g）、甲状腺（最高达 0.23 μg/g）和肾上腺（最高达 0.27 μg/g）。所有其他组织的峰值浓度均低于 0.13 μg/g。给药后 24 至 168 小时内放射性浓度迅速下降，表明药物持续从组织中清除。

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代谢/代谢物
口服丙硫菌唑后，大鼠体内发生广泛的代谢。在尿液、粪便和胆汁中鉴定出 18 种代谢物和母体化合物。丙硫菌唑的生物转化主要包括三种反应类型：脱硫、苯基氧化羟基化和葡萄糖醛酸结合。代谢物的鉴定率占给药剂量的26%至63%。由于粪便提取困难，无法实现更高的代谢物分离和鉴定率，因为67%至79%的给药剂量残留在固体中无法提取的残渣中。丙硫菌唑的主要排泄途径是粪便，占给药剂量的22%至53%。母体化合物丙硫菌唑在粪便中含量最高（占给药剂量的1%至22%），其次是丙硫菌唑脱硫代谢物（占给药剂量的3%至16%）。所有其他粪便代谢物均低于给药剂量的7%。未在粪便中检测到1,2,4-三唑代谢物。主要的尿代谢产物是丙硫康唑-S-或O-葡萄糖醛酸苷（占给药剂量的0.1-8%），且主要在女性体内排泄。单次口服低剂量和/或高剂量后，1,2,4-三唑代谢产物占给药剂量的0.8-2.3%。其余尿代谢产物占给药剂量的0-1.4%。丙硫康唑-S-或O-葡萄糖醛酸苷是胆汁中最丰富的代谢产物，约占给药剂量的46%。该代谢产物仅在女性体内经尿液排泄，但在男性体内胆汁中也有发现。胆汁中的葡萄糖醛酸代谢产物占给药剂量的8-10%。母体化合物占给药剂量的3-5%。胆汁中未检测到1,2,4-三唑代谢物。
在一项代谢研究中，研究了丙硫菌唑脱硫的吸收、分布、代谢和排泄。给药后4分钟即可开始从胃肠道吸收放射性测试物质。1.5小时时观察到最大浓度为0.052 μg/g。肝脏和胃肠道中观察到的放射性含量最高，这可能是由于持续的肠肝循环所致。其余组织中的放射性含量低于1%。超过90%的给药放射性剂量经胆汁和尿液排出。呼出的二氧化碳中回收的放射性物质极少。大部分给药放射性剂量经粪便排出，少量经尿液排出。皮肤中仅含有微量的回收放射性物质，而胴体和胃肠道中分别含有高达4%和2.25%的放射性物质。48小时时，放射性物质的排泄可能尚未完全，因为此时体内放射性残留总量为给药剂量的5%至6%。消除半衰期为44.3小时，平均停留时间为48.2小时。这些观察结果表明，放射性物质在消除前重新分布到血浆中的过程缓慢，这与10.9 mL/min/kg体重的总清除率和1.4 mL/min/kg体重的肾清除率相符。在胆管插管动物中，经十二指肠内给予放射性剂量后，分别在24小时和48小时后，胆汁中检测到给药剂量的84%至85%。在这些动物中，48小时后尿液排泄量占给药剂量的近6%，而粪便排泄量占给药剂量的2%。在混合胆汁样本中，观察到18个放射性HPLC峰，占给药剂量的84.3%。分离并鉴定了5种化合物，而其余13种代谢物未被鉴定，占给药剂量的44.7%。/丙硫菌唑脱硫/
在全身放射自显影实验中，证实了受试物质的快速吸收。一小时后吸收尚未完全。放射自显影图还显示，血液浓度低于脂肪组织中的浓度，表明丙硫菌唑脱硫及其代谢物可能具有亲脂性。在整个观察期内，胃壁黏膜均观察到放射性，这被认为是吸收的放射性物质经胆汁分泌回胃腔的迹象。肌肉、心脏、肺、脑、甲状腺和骨骼的矿物质部分显示出少量放射性。睾丸的放射性分布模式表明该器官内存在血液循环。一些腺体器官，包括包皮腺和肾上腺，观察到中等量的放射性。牙龈也观察到放射性增强，但其生理意义尚不明确。1小时时观察到的放射性分布在48小时内基本保持一致，尽管由于排泄而有所下降。肾皮质的放射性含量远高于肾盂，表明放射性物质在十二指肠被重吸收。此外，被吸收的放射性物质可能并未转化为极性足够强的代谢物，从而无法通过肾脏排出。这导致放射性测试物质更多地通过肝脏。 /丙硫菌唑脱硫/
有关丙硫菌唑（共6种代谢物）的更多代谢/代谢物（完整）数据，请访问HSDB记录页面。

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生物半衰期
消除半衰期为44.3小时。 ... /丙硫菌唑脱硫/

非人类毒性值
大鼠（雄性、雌性）口服LD50 ≥ 6200 mg/kg（丙硫菌唑原药）
虹鳟鱼LC50 1.83 mg/L/96 小时
大鼠吸入LC50 > 4990 mg/m³ /持续时间未指定/
大鼠（雄性、雌性）皮肤LD50 ≥ 2000 mg/kg

[1]. Prothioconazole and prothioconazole-desthio activities against Candida albicans sterol 14-α-demethylase. Appl Environ Microbiol. 2013 Mar;79(5):1639-45.

2-[2-(1-氯环丙基)-3-(2-氯苯基)-2-羟丙基]-1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-硫酮是三唑类化合物，其结构为1,2,4-三唑-3-硫酮在2位被2-(1-氯环丙基)-3-(2-氯苯基)-2-羟丙基取代。它属于一氯苯类、三唑类、叔醇类、环丙烷类和硫代羰基化合物。

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作用机制
丙硫菌唑是一种内吸性脱甲基抑制剂类杀菌剂，属于三唑啉硫酮类杀菌剂。 ……它通过抑制羊毛甾醇或24-亚甲基二氢甾醇14位的去甲基化作用来对抗易感真菌，羊毛甾醇和24-亚甲基二氢甾醇均为真菌甾醇的前体；也就是说，它通过干扰麦角甾醇的生物合成发挥作用（麦角甾醇是维生素D2的前体，也是真菌细胞壁的重要组成部分）。

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与丙硫菌唑脱硫相比，丙硫菌唑体外对CaCYP51的抑制作用较弱，这促使人们进一步研究其作用机制。研究发现，在用丙硫菌唑处理的白色念珠菌培养物的细胞和培养基中均存在丙硫菌唑脱硫。因此，丙硫菌唑治疗期间观察到的抗真菌作用是由于其脱硫产物的存在。我们的结果还表明，在含有丙硫菌唑的YPD培养基和RPMI培养基中均检测到了脱硫类似物，但在含有丙硫菌唑的无菌去离子水中，经37℃培养24小时后未检测到。因此，丙硫菌唑易于转化为脱硫形式，并发挥抗真菌作用。可以推测，丙硫菌唑作为农业杀菌剂的高效性也得益于致病真菌细胞内相对无活性的丙硫菌唑代谢为活性极高的脱硫形式，以及在宿主细胞内代谢。对三唑啉硫酮类化合物的进一步研究可能有助于开发此类新型抗真菌化合物，用于临床治疗或作为更有效的作物保护化合物，并促进对杀菌剂前体或前药策略价值的思考。[1]

C14H15CL2N3OS

344.25

343.031

C, 48.85; H, 4.39; Cl, 20.60; N, 12.21; O, 4.65; S, 9.31

178928-70-6

6451142

White to light yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

486.7±55.0 °C at 760 mmHg

139.1-144.5°

248.2±31.5 °C

0.0±1.3 mmHg at 25°C

1.698

1.77

85.93

2

2

5

21

458

0

MNHVNIJQQRJYDH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C14H15Cl2N3OS/c15-11-4-2-1-3-10(11)7-14(20,13(16)5-6-13)8-19-12(21)17-9-18-19/h1-4,9,20H,5-8H2,(H,17,18,21)

2-[2-(1-chlorocyclopropyl)-3-(2-chlorophenyl)-2-hydroxypropyl]-1H-1,2,4-triazole-3-thione

Proline 480 SC Fungicide; JAU 6476; Prothioconazole; 178928-70-6; 3H-1,2,4-Triazole-3-thione, 2-[2-(1-chlorocyclopropyl)-3-(2-chlorophenyl)-2-hydroxypropyl]-1,2-dihydro-; JAU 6476; Prothioconazole [ISO:BSI]; 2-[2-(1-Chlorocyclopropyl)-3-(2-chlorophenyl)-2-hydroxypropyl]-1,2-dihydro-3H-1,2,4-triazole-3-thione; UNII-27B9FV58IY; PROLINE 480 SC Fungicide; Prothioconazole

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。