PSB-0739 sodium

P2Y12 receptor （Ki = 24.9 nM）

PSB-0739 是一种强竞争性非核苷酸拮抗剂，针对人 P2Y12 受体的 pA2 值为 9.8[2]。在 THP-1 细胞中，PSB-0739 诱导 ADP 浓度-反应曲线平行向右移动，并抑制 ADP 诱导的 Ca2+ 反应，EC50 为 5.4±1.8 μM [3]。

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已经合成了与中等效力、非选择性P2Y（12）受体拮抗剂反应性蓝2（6）相关的蒽醌衍生物，并针对P2Y（13）受体亲和力进行了优化。使用人血小板膜和P2Y（12）受体选择性拮抗剂放射性配体[（3）H]2-丙基硫代腺苷-5'-腺苷酸（1,1-二氯-1-膦酰基甲基-1-膦酰基）酐（[（3”H]PSB-0413）的放射性配体结合分析用于化合物测试。1-氨基-2-磺基蒽醌衍生物在苯胺环的4位带有（对苯氨基）苯胺基取代，在间位带有额外的酸性官能团，显示出高P2Y（12）受体亲和力。这些新的蒽醌衍生物是通过最近开发的铜（0）催化的1-氨基-4-溴蒽醌衍生物与苯胺在磷酸盐缓冲液中在微波辐射下的Ullmann偶联反应获得的。最强效的化合物的K（i）值分别为24.9 nM（1-氨基-4-[4-苯氨基-3-磺基苯氨基]-9,10-二氧代-9,10-二氢蒽-2-磺酸盐，PSB-0739，39）和21.0 nM（1-氨基-4-[-4-苯氨基-3-羧基苯氨基]-9，10-二氧代-9，10-二氢蒽2-磺酸盐，PSB-0702，41）。1-氨基-2-磺基-4-苯胺基蒽醌衍生物似乎没有细胞毒性，如两种人类细胞系（黑色素瘤和星形细胞瘤）的选定衍生物所示。化合物39和41代表了抗血栓药物开发的新先导结构。[1]

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P2Y（12）受体在血小板聚集中起着至关重要的作用。在本研究中，我们分析了重组人P2Y（12）受体上非核苷酸拮抗剂的性质，并寻找参与分子相互作用的氨基酸。通过测量中国仓鼠卵巢细胞中cAMP反应元件（CRE）导向的萤光素酶表达来评估受体功能。毛喉素可加速细胞cAMP的产生；2-甲硫基-ADP用于激活野生型P2Y（12）受体或突变体构建体。2-甲硫基-ADP抑制CRE依赖性萤光素酶表达，IC（50）值约为1nM。在增加浓度下使用的蒽醌衍生物反应性蓝2以与竞争性拮抗相容的方式将2-甲硫基-ADP的浓度响应曲线向右移动（pA（2）值，7.4）。其类似物1-氨基-4-[4-苯氨基-3-磺基苯氨基]-9,10-二氧-9,10-二氢蒽-2-磺酸盐（PSB-0739）显示出明显更高的拮抗效力，pA（2）值为9.8。在表达R256A突变受体的细胞中，反应性蓝2（表观pK（B），5.9）和PSB-0739（表观pK（B））的效力都降低了。纯反应性蓝2的间位和对位异构体以及正异构体西巴克伦蓝3GA也是如此。相比之下，类似物1-氨基-4-[4-苯胺基-苯氨基]-9,10-二氧-9,10-二氢蒽-2-磺酸酯在环D处没有磺酸残基（PSB-0826），在野生型（8.4）和R256A突变受体（8.3）处显示出相似的pK（B）值。总之，研究结果表明，PSB-0739是迄今为止描述的人类P2Y（12）受体上最有效的竞争性非核苷酸拮抗剂。结果还表明，环D上的磺酸残基参与了来自反应性蓝2的拮抗剂与人P2Y（12）受体残基Arg256的相互作用。[2]

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ADP诱发的THP-1细胞内Ca2+反应（EC50 2.7μM）被PLC（U73122）或肌/内质网Ca2+-ATP酶（thapsigargin）的抑制所消除。MRS2578治疗后ADP诱发的Ca2+反应的丧失（IC50 200 nM）表明P2Y6受体在介导ADP诱发的钙反应中起着重要作用。百日咳毒素治疗或两种化学上不同的拮抗剂（替卡格雷，IC50 5.3μM；PSB-0739，IC50 5.6μM）抑制P2Y12受体均可减弱ADP诱发的反应。在siRNA介导的P2Y12基因敲除后，ADP诱发的反应受到抑制。抑制腺苷酸环化酶（SQ22536）后，P2Y12拮抗剂的抑制作用完全逆转。在新鲜分离的人CD14+单核细胞中证实了P2Y12受体的表达。 结论和意义：总的来说，这些数据表明，P2Y12受体激活通过抑制人单核细胞中的腺苷酸环化酶活性，积极调节P2Y6受体介导的细胞内Ca2+信号传导。[3]

在低剂量的PSB-0739（0.01-0.3 mg/kg，鞘内注射）下观察到显着且剂量依赖性的抗痛觉过敏作用。 [4]指出最小有效剂量（mED）为0.1 mg/kg。

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在这项研究中，研究者探讨了P2Y12受体（P2Y12R）在炎症和神经性疼痛的啮齿动物模型以及急性热伤害感受中的作用。与阻断重组人P2Y12R的活性相关，大多数P2Y12R拮抗剂在大鼠足底注射CFA后和坐骨神经部分结扎后，剂量依赖性地缓解了机械性痛觉过敏。在热板试验中，它们还导致了热伤害感受阈值的增加。在疼痛研究中评估的六种P2Y12R拮抗剂中，选择性P2Y12受体拮抗剂PSB-0739在鞘内应用时最有效。大鼠足内注射CFA后，P2Y12R mRNA和IL-1β蛋白在大鼠后爪和腰椎脊髓中呈时间依赖性过表达。这伴随着后爪TNF-α、IL-6和IL-10的上调PSB-0739（0.3mg/kg i.t.）减弱了CFA诱导的后爪细胞因子和脊髓IL-1β的表达。膈下迷走神经切断术和α7烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂MLA阻断了PSB-0739（i.t.）对疼痛行为和外周细胞因子诱导的影响。6-OHDA预处理阻断交感神经不影响PSB-0739的作用PSB-0739在镇痛剂量下，不影响运动协调和血小板聚集。小鼠P2Y12R的基因缺失再现了P2Y12R拮抗剂对炎症和神经性疼痛模型中的机械性痛觉过敏、急性热伤害和脊髓IL-1β诱导的影响。在这里，研究者报告了P2Y12R在炎性疼痛中的强烈参与。P2Y12R拮抗的抗痛觉过敏作用可以通过抑制中枢和外周细胞因子的产生来介导，并涉及α7受体介导的传出途径[4]。

P2Y12放射性配体结合分析[1]
[3H]PSB-0413的前体按照描述和定制标记合成，比活性分别为74 Ci/mmol或94 Ci/mmol。如前所述，使用5 nM[3H]PSB-0413和100μg蛋白质在pH 7.4的50 mM Tris-HCl缓冲液中进行放射性配体结合分析，最终体积为400μL。初步确定了10μM试验化合物的竞争性。将混合物在室温下孵育1小时，然后通过GF/B过滤器过滤。用1mM ADP测定非特异性结合。对于强效化合物，使用至少6-7个不同的浓度，跨越3个数量级，确定了浓度-抑制曲线。至少进行了三个独立的实验，每个实验一式三份。

细胞活力测定 [3]
细胞类型： THP-1 单核细胞系
测试浓度： 10 nM、100 nM、1 μM、10 μM
孵育时间：
实验结果：ADP诱导的反应减弱(IC50=5.4±1.8 μM)。

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MTT分析[1]
从175cm2培养瓶中分离细胞，并使用Neubauer血细胞计数器计数。然后将它们重新悬浮在生长培养基中，在10mL的培养基中得到总共2×105个细胞。将细胞悬浮液（100μL）加入96孔板的每个孔中，以获得每孔2000个细胞的最终浓度，并在37°C、5%CO2和95%湿度下孵育24小时。96孔板的外孔填充有200μL无细胞培养基，以防止蒸发。24小时后，取出培养基，每孔加入180μL新鲜生长培养基。在DMSO中制备试验化合物（5-氟尿嘧啶、12和16）的储备溶液（10 mM），并用培养基稀释至10倍的终浓度。然后向每个孔中加入试验化合物溶液（20μL）。DMSO的最终浓度为1%。化合物12和16的浓度分别为0.1、1和100μM。对于5-氟尿嘧啶，确定了全剂量-抑制曲线。将细胞在适当药物的存在下孵育72-144小时。然后将40μL新鲜制备的MTT磷酸盐缓冲盐水储备溶液（5mg/mL）加入每个孔中，孵育细胞1小时。孵育时间结束后，取出含有MTT的培养基，向每个孔中加入100μL DMSO，以溶解形成的晶体。随后使用具有690nm参考滤光片的UV Multiwell-reader Multiscan分光光度计在570nm处测量分光光度吸光度。使用Microsoft Excel和Graphpad Prism 4对数据进行分析。通过比较含有化合物处理细胞的孔的吸光度与不含任何药物的含有1%DMSO的孔的吸光率（=100%存活率）来评估结果。所有实验均在至少3-8个单独的实验中进行了三次。

动物/疾病模型：雄性Wistar大鼠，150-250克，每组6-8只大鼠[4]
剂量：0.01、0.03、0.1、0.3毫克/千克
给药途径：鞘内注射(it)
实验结果：机械效应表现在0.01-0.1毫克/千克范围内出现剂量依赖性的痛觉过敏抑制。

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动物接受腹腔注射或鞘内注射以下几种不同剂量的P2Y12R拮抗剂：MRS2395（0.03–1 mg/kg）、氯吡格雷（1–60 mg/kg）、噻氯匹定（3–100 mg/kg）、坎格瑞洛（0.1–3 mg/kg）、PSB-0739（0.01–1 mg/kg）或活性蓝2（0.1–3 mg/kg）。每只动物仅注射一次。药物剂量的选择基于既往研究的推断（Marteau等，2003；Takasaki等，2001；Vasiljev等，2003）。鞘内注射按照Mestre等人的方法进行。 （1994）：该方法无需麻醉即可将药物直接注射到中枢神经系统，避免损伤脊髓。简而言之，注射操作为：一手托住动物，另一手将连接有250 μL Hamilton注射器（带重复注射装置）的23 G1″针头插入L5和L6椎体背侧之间。每次注射5 μL的PSB-0739溶液或生理盐水。[4]

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为了评估膈下迷走神经切断术对疼痛行为的影响，在术前测量PWT作为基线，并在术后第十天足底注射CFA之前立即测量PWT。随后，将新鲜配制的完全弗氏佐剂（CFA，100 μL，50%）皮内注射到动物的右后爪，并在治疗两天后测量PWT。随后，动物接受鞘内注射选择性P2Y12R拮抗剂PSB-0739（0.3 mg/kg）或生理盐水，并再次测量PWT。[4]

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选择性P2Y12R拮抗剂PSB-0739（0.3 mg/kg）在CFA后机械性痛觉过敏测量前15分钟注射，而非前药P2Y12受体拮抗剂坎格瑞洛（3 mg/kg）在CFA后机械性痛觉过敏测量前30分钟腹腔注射。在48小时或96小时进行行为学测试后，将大鼠断头处死。选择这些时间点是为了代表炎症的急性期（48小时）和亚急性期（96小时）（Parra等人，2002）。 [4]

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加速旋转杆测试[4]
本研究使用体重140-190克、未经药物和测试的雄性Wistar大鼠。运动协调性测试在IITC旋转杆装置上进行，该装置可同时测试五只大鼠。该装置由五个隔间组成，隔间之间由直径8厘米的旋转杆隔开，旋转杆位于装置底座上方25厘米处。动物的运动协调性测试持续300秒，线性加速度从5转/分逐渐增加到25转/分。在实验开始前，大鼠连续两天每天进行三次（每次300秒）旋转杆适应性测试。在测试当天，给药前30分钟测定大鼠的跌倒潜伏期，基线潜伏期小于60秒的大鼠被排除在研究之外。随后，对动物进行腹腔注射（3 mg/kg 坎格瑞洛/生理盐水）或鞘内注射（0.3 mg/kg PSB-0739/生理盐水）无菌生理盐水或拮抗剂处理。腹腔注射后 30 分钟或鞘内注射后 15 分钟，在 300 秒的测试时间内再次测量跌落潜伏期。跌落潜伏期以秒为单位表示。

[1]. High-affinity, non-nucleotide-derived competitive antagonists of platelet P2Y12 receptors. J Med Chem. 2009 Jun 25;52(12):3784-93.

[2]. Interaction of new, very potent non-nucleotide antagonists with Arg256 of the human platelet P2Y12 receptor. J Pharmacol Exp Ther. 2009 Nov;331(2):648-55.

[3]. P2Y 12 receptor modulation of ADP-evoked intracellular Ca2+ signalling in THP-1 human monocytic cells. Br J Pharmacol.2018 Jun;175(12):2483-2491.

[4]. Central P2Y12 receptor blockade alleviates inflammatory and neuropathic pain and cytokine production in rodents. Neurobiol Dis. 2014 Oct;70(100):162-78.

总之，我们开发了一类新型高效、竞争性的非核苷酸类P2Y12受体拮抗剂。其中活性最强的化合物对人血小板P2Y12受体的Ki值在纳摩尔级以下，并且对其他P2受体亚型具有选择性。这些新化合物可作为药理学工具，用于研究外周和脑部P2Y12受体的作用。我们已鉴定出该类化合物中的几个成员，例如化合物39/PSB-0739和41，它们构成了用于开发抗血栓药物的新型先导化合物。[1] 目前用于治疗炎症性和神经性疼痛的主要局限性不仅在于疗效不足，还在于治疗剂量范围内会出现不良副作用（Negus等人，2006）。重要的是，即使使用高于相应化合物最小有效剂量（mED）的剂量，我们也没有检测到本研究中使用的最强效的P2Y12R拮抗剂对运动协调性的任何急性影响。另一方面，腹腔注射镇痛剂量的坎格瑞洛（cangrelor），而非注射PSB-0739，对离体血小板聚集具有显著的抑制作用，考虑到P2Y12R拮抗剂对该过程的已知抑制作用（Schumacher等人，2007），这一结果并不令人意外。然而，鉴于血液中P2Y12R的占有率与动脉血栓的形成密切相关，这种作用也可以被视为对心血管风险的保护作用，而非副作用。研究发现，PSB-0739不仅没有抑制血小板聚集，反而增强了血小板聚集，这表明P2Y12R拮抗剂的镇痛作用可以通过充分渗透到中枢神经系统而增强，且不会增加出血风险。总之，我们的研究结果为将中枢P2Y12R作为治疗炎症性和神经性疼痛的潜在方法提供了理论依据。[4]

C26H17N3NA2O8S2

609.5345

609.025

C, 51.23; H, 2.81; N, 6.89; Na, 7.54; O, 21.00; S, 10.52

1052087-90-7

44583582

Green to dark green solid powder

6.228

215.38

3

11

4

41

1120

0

[Na+].[Na+].C1=CC=C(NC2=CC=C(NC3=CC(S([O-])(=O)=O)=C(N)C4C(C5=CC=CC=C5C(=O)C3=4)=O)C=C2S([O-])(=O)=O)C=C1

QBLLYXXXOJUNCV-UHFFFAOYSA-L

InChI=1S/C26H19N3O8S2.2Na/c27-24-21(39(35,36)37)13-19(22-23(24)26(31)17-9-5-4-8-16(17)25(22)30)29-15-10-11-18(20(12-15)38(32,33)34)28-14-6-2-1-3-7-14;;/h1-13,28-29H,27H2,(H,32,33,34)(H,35,36,37);;/q;2*+1/p-2

disodium;1-amino-4-(4-anilino-3-sulfonatoanilino)-9,10-dioxoanthracene-2-sulfonate

PSB0739 sodium; PSB-0739; PSB 0739; 1052087-90-7; PSB-0739 Sodium; 1-Amino-9,10-dihydro-9,10-dioxo-4-[[4-(phenylamino)-3-sulfophenyl]amino]-2-anthracenesulfonic acid sodium salt; CHEMBL455536; disodium;1-amino-4-(4-anilino-3-sulfonatoanilino)-9,10-dioxoanthracene-2-sulfonate; sodium 1-amino-9,10-dioxo-4-((4-(phenylamino)-3-((sodiooxy)sulfonyl)phenyl)amino)-9,10-dihydroanthracene-2-sulfonate; PSB 0739

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~3.33 mg/mL (~5.46 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。