| 规格 | 价格 | |
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| 500mg | ||
| 1g | ||
| Other Sizes |
| 靶点 |
GPR88 (EC50 = 25 nM)
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| 体外研究 (In Vitro) |
GPR88 cAMP 功能测定表明 RTI-13951-33 是一种强效、特异性、脑穿透性 GPR88 激动剂，EC50 为 25 nM。在小鼠纹状体膜中，RTI-13951-33 增强 [35S]-GTPγS 结合（EC50，535 nM），但在 GPR88 KO 小鼠的膜中则不然。 RTI-13951-33 对囊泡单胺转运蛋白（VMAT；Ki，4.23 μM）、血清素转运蛋白（SERT；Ki，0.75 μM）和 κ 阿片受体（KOR；Ki，2.29 μM）表现出适度的亲和力。 RTI-13951-33 对 SERT 也具有中等亲和力，其对 SERT 的抑制作用较差（IC50，25.1 ± 2.7 μM）[1]。
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| 体内研究 (In Vivo) |
RTI-13951-33（10 mg/kg，ip）显示出显着的脑渗透性，大鼠血浆和脑中的 t1/2 分别为 48 分钟和 87 分钟 [1]。 RTI-13951-33（10 和 20 mg/kg，腹膜内注射）可剂量依赖性地降低大鼠自我给药模型中的酒精水平反应 [1]。
RTI-13951-33的体内活性。[1] 由于GPR88 KO小鼠表现出对饮酒和寻求行为的增强动机，23我们试图确定RTI-13951-33是否能在体内有效地改变操作性酒精自我给药。雌性Long-Evans大鼠接受了自我给药酒精的训练，如我们最近的出版物所述（15%酒精[v/v]+2%[w/v]蔗糖vs非活性水平）。32-34我们所有的研究都使用了这种甜味酒精浓度，因为我们发现它会随着时间的推移导致稳定的操作反应，并允许动物达到生理相关和适度的酒精摄入量（例如0.7-1.0 g/kg）。在测试的两个最高RTI-13951-33剂量（10和20mg/kg，图4A）下，观察到酒精自我给药显著减少。酒精水平反应的降低与最高剂量（20mg/kg）下的酒精摄入量（g/kg）减少相对应，与10mg/kg剂量下的减少趋势相对应（p=0.05，图4A）。值得注意的是，在自我给药期间测量的非活动杠杆反应（平均值±SEM；赋形剂，0.8±0.3；5 mg/kg剂量，1.1±0.4；10 mg/kg剂量，0.5±0.3；20 mg/kg剂量，0.0±0.0反应）或运动率（图4B）没有影响，35表明酒精自我给药的减少与活动的普遍抑制无关。 |
| 酶活实验 |
[35S]-GTPγS结合试验。[1]
根据我们之前发表的方法，对WT小鼠或GPR88 KO小鼠的膜制剂进行了[35S]-GTPγS结合测定。为了评估整个纹状体区域的[35S]-GTPγS结合，在颈椎脱位后迅速取出大脑，将整个纹状体区域解剖、冷冻并储存在-80°C下直至使用。通过在10体积（mL/g组织湿重）的冰冷0.25 M蔗糖溶液中均质化脑样品来制备膜。然后将获得的悬浮液在2500g下离心10分钟。收集上清液，在含有50mM TrisHCl（pH 7.4）、3mM MgCl2、100mM NaCl和0.2mM EGTA的缓冲液中稀释10倍，然后在23000g下离心30分钟。将颗粒在800μL冰冷的蔗糖溶液（0.32M）中均质化，等分，并保持在-80°C。对于[35S]-GTPγS结合试验，每孔使用2μg蛋白质。在25°C下，在含有30 mM GDP和0.1 nM[35S]-GTPγS的测定缓冲液中，将样品在有和没有测试化合物的情况下孵育1小时。使用液体闪烁计数器对结合放射性进行定量。非特异性结合被定义为在10μM GTPγS存在下的结合；基础结合是指在没有激动剂的情况下结合。数据以高于基础结合的平均活化百分比表示。EC50值使用GraphPad Prism软件计算。 脱靶选择性评估。[1] Eurofins PanLabs根据其标准方案，在针对38个GPCR、离子通道和转运蛋白的放射配体结合分析中，以10μM的单一浓度评估了RTI-13951-33的脱靶谱。完整的方法和参考资料可以在以下网址找到：http://www.eurofinsdiscoveryservices.com.抑制百分比为两次测定的平均值。当观察到放射性配体的显著位移（在10μM下抑制率>50%）时，构建完整的浓度依赖性位移曲线（一式两份）以产生IC50值。使用MathIQ通过非线性回归分析确定IC50值。平衡解离常数（Ki）使用Cheng-Prusoff方程，使用观察到的受试化合物的IC50、放射性配体的浓度和配体Kd的历史值计算。 [1] NIMH PDSP使用Molecular Devices的神经递质转运蛋白摄取检测试剂盒（R8174）对稳定表达人SERT的HEK293细胞进行神经递质转运子检测。完整协议可在以下网址找到：http://pdspdb.unc.edu/pdspWeb.简而言之，细胞在DMEM+1%透析FBS的384孔黑色透明底细胞培养板上以每孔15000个细胞的密度铺板，总体积为40μl。在用于检测之前，将细胞孵育至少6小时。移除培养基，加入20μL测定缓冲液（20mM HEPES，1×HBSS，pH 7.4），然后加入5μL 5×药物溶液。将平板在37°C下孵育30分钟。孵育后，加入25μL染料溶液，使用FlexStation II（底部读取模式，440 nm激发，520 nm发射，510 nm截止）在37°C下30分钟后测量荧光强度。导出相对荧光单位（RLU）的结果，并将其与Prism 7.0中的药物浓度进行非线性回归绘制，以获得IC50值。 |
| 细胞实验 |
MDCK渗透性测定。[1]
如前所述，MDCK-mdr1细胞在Transwell型过滤器上生长4天，在含有10%胎牛血清和抗生素的DMEM/F12培养基中融合。36,37在包含1×Hank平衡盐溶液、25 mM d-葡萄糖的运输缓冲液中，以10μM的浓度将化合物添加到顶端，并用HEPES缓冲至pH 7.4。样品在37°C下孵育1小时，并从过滤器的顶端和基底侧仔细收集。选择用于MDCK-mdr1细胞测定的化合物在Applied Biosystems API-4000质谱仪上输注，以优化使用多重反应监测（MRM）的分析。还进行了流动注射分析，以优化质谱仪参数。在氮气下，在Turbovap LV上干燥MDCK细胞测定顶端和基底外侧的样品。用Agilent 1100二元泵以0.5 mL/min的流速进行色谱分析。流动相溶剂为a，0.1%甲酸水溶液和B，0.1%甲酸甲醇溶液。初始溶剂条件为10%B 1分钟，然后使用梯度，在5分钟内增加到95%B，然后恢复到初始条件。报告的数据是2到3次测量的平均值。 |
| 动物实验 |
药代动力学分析。[1]
本研究采用雄性Long'Evans大鼠（加拿大蒙特利尔Paraza Pharma公司）进行RTI-13951-33的瞬时药代动力学研究。药物配制于10% DMSO生理盐水中。在药代动力学研究当日早晨，对动物进行称重，并据此计算给药制剂的体积。所有动物均腹腔注射该化合物。在选定的时间点（给药后0.25、0.5、1、2、4、8和24小时），对动物进行麻醉，进行心脏穿刺采集血液用于混合血浆分析，随后用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）进行全身灌注，以清除器官中残留的血液。取出脑组织，并用25%异丙醇水溶液以1:4 (w/v)的比例进行匀浆。将脑匀浆按相应时间点进一步合并，并提取用于LC-MS/MS药物定量分析。样品制备和分析方法如下：取10 μL血浆，加入10 μL 0.5%甲酸水溶液和100 μL内标工作溶液（0.1 μM格列本脲/拉贝洛尔乙腈溶液），涡旋混匀，于4 °C下以10000 g离心25分钟。取100 μL上清液转移至2 mL深孔板中，并用200 μL水稀释。取50 μL脑匀浆，加入10 μL 0.5%甲酸水溶液和100 μL内标工作溶液（0.1 mM格列本脲/拉贝洛尔乙腈溶液），涡旋混匀，于4 °C下以10000 g离心25 min。取200 μL上清液转移至2 mL深孔板中，并用200 μL水稀释。采用Applied Biosystems API 4000高效液相色谱系统进行LC-MS/MS分析。色谱柱为Xbridge BEH C18柱（2.1 mm × 30 mm，2.5 μm）。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸25%异丙醇/乙腈溶液。初始条件为 5% B 溶液，保持 0.1 分钟，随后在 1.4 分钟内线性梯度增加至 95% B 溶液。95% B 溶液保持 2.5 分钟，随后在 2.55 分钟内线性梯度增加至 98% B 溶液。98% B 溶液保持 3.15 分钟后，恢复至初始条件。 自我给药训练和测试。[1] 雌性 Long-Evans 大鼠双笼饲养于通风笼中，笼内提供充足的水和食物。饲养室保持 12 小时光照/12 小时黑暗循环，光照时间为 07:00。实验中，我们使用与之前发表的文献32-34中描述的相同的自我给药和训练程序对大鼠（酒精自我给药实验组 n = 8，蔗糖自我给药实验组 n = 7）进行了训练。自我给药实验每周进行 5 天（周一至周五），每次 30 分钟。实验采用固定比率 2 (FR2) 的强化程序，即每按压一次操作杆，即可获得 0.1 mL 酒精溶液注入液体容器。非活动操作杆的按压会被记录，但不会产生任何预设后果。在自我给药实验期间，我们使用红外光束测量大鼠的运动活性，该光束将行为实验箱分割成四个平行区域。测试仅在大鼠自我给药行为稳定后进行（即，测试前实验期间的总按压次数变化不超过 15%），且所有大鼠在测试前均有 5 个月的酒精自我给药史。大鼠在自我给药实验前 30 分钟腹腔注射 RTI-13951-33。每个实验均采用重复测量设计，每只大鼠以随机顺序接受每种剂量，且两次测试之间至少间隔一次自我给药实验。药物。[1] 15% (v/v) 乙醇 + 2% (w/v) 蔗糖溶液的制备方法为：将 95% (v/v) 乙醇和蔗糖溶于自来水中。RTI-13951-33 溶于无菌 0.9% 生理盐水中，以 1 mL/kg 的剂量腹腔注射。 |
| 药代性质 (ADME/PK) |
药代动力学研究。[1]
基于效价、受体选择性和体外ADME特性，我们进一步开展了RTI-13951-33的瞬时药代动力学(PK)测试，以评估该化合物是否具有足够的脑暴露量。大鼠腹腔注射10 mg/kg RTI-13951-33后，药物迅速被吸收进入体循环，在给药后15分钟（首次采样时间点）达到血浆峰浓度（Cmax = 874 ng/mL，表3）。脑组织浓度在60分钟达到峰值，Cmax为287 ng/mL，随后以87分钟的表观半衰期从脑组织中消除。通过AUC0-inf比值计算得出，脑组织与血浆的AUC比值为0.5。 30 分钟时，脑浓度为 242 ng/mL (527 nM)，表明 RTI-13951-33 具有足够的脑渗透性，可用于 GPR88 调节，因为其在 cAMP 功能测定中的 EC50 为 25 nM。 |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
孤儿G蛋白偶联受体GPR88在纹状体中高表达。利用GPR88基因敲除小鼠的研究表明，该受体与酒精渴求和饮酒行为有关。迄今为止，由于缺乏适用于体内研究的高效选择性激动剂，GPR88激活的生物学效应仍不清楚。本研究报道了首个高效、选择性且能穿透血脑屏障的GPR88激动剂RTI-13951-33 (6)的发现。RTI-13951-33在体外cAMP功能测定中EC50值为25 nM，并且在所测试的38种GPCR、离子通道和神经递质转运体中均未观察到明显的脱靶活性。与(1R,2R)-2-PCCA (2)相比，RTI-13951-33具有更高的水溶性，并且具有良好的药代动力学特性，适用于行为学评估。最后，腹腔注射RTI-13951-33可显著降低大鼠的酒精自我给药行为和酒精摄入量，且呈剂量依赖性，对运动和蔗糖自我给药行为无影响。[1] 综上所述，我们基于2-PCCA骨架开发了一种高效、选择性强且能穿透血脑屏障的GPR88激动剂RTI-13951-33 (6)。体外药理学评价表明，RTI-13951-33在GPR88 cAMP功能测定中表现出极高的活性，并且基于我们对38种GPCR、离子通道和转运蛋白的筛选数据，未发现明显的脱靶活性；此外，在利用GPR88敲除小鼠纹状体膜进行的GTPγS结合测定中，RTI-13951-33也未表现出激动剂信号活性。RTI-13951-33具有良好的水溶性和良好的脑穿透药代动力学特性。 RTI-13951-33 在大鼠酒精自我给药模型中显示出显著的降低酒精摄入量的疗效。重要的是，在自我给药实验期间，未观察到对运动能力的影响，表明酒精自我给药量的减少与整体活动抑制无关。此外，我们证实了酒精与自然奖励之间存在特异性，GPR88激动剂在相同剂量下可降低酒精自我给药量，但对蔗糖自我给药量无影响，这支持了GPR88信号通路在调节酒精强化作用中的作用。目前正在利用野生型（WT）和GPR88敲除（KO）小鼠，在酒精饮酒和渴求行为的小鼠模型中进一步研究RTI-13951-33，以评估其体内靶向特异性。综上所述，GPR88代表了一种新的药物靶点，应在开发酒精使用障碍新疗法方面进行深入研究。[1]
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| 分子式 |
C28H33N3O3
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|---|---|
| 分子量 |
459.579927206039
|
| 精确质量 |
459.252
|
| 元素分析 |
C, 73.18; H, 7.24; N, 9.14; O, 10.44
|
| CAS号 |
2244884-08-8
|
| 相关CAS号 |
RTI-13951-33 hydrochloride
|
| PubChem CID |
134813902
|
| 外观&性状 |
Typically exists as solid at room temperature
|
| LogP |
2.8
|
| tPSA |
77.7
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
1
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
5
|
| 可旋转键数目(RBC) |
10
|
| 重原子数目 |
34
|
| 分子复杂度/Complexity |
630
|
| 定义原子立体中心数目 |
4
|
| SMILES |
C[C@H]([C@@H](CN(C1=CC=C(C=C1)C2=CC=C(C=C2)COC)C(=O)[C@@H]3C[C@H]3C4=CC=CC=N4)N)OC
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| InChi Key |
XCHHIKJEGXHKLQ-UJTWYAIMSA-N
|
| InChi Code |
InChI=1S/C28H33N3O3/c1-19(34-3)26(29)17-31(28(32)25-16-24(25)27-6-4-5-15-30-27)23-13-11-22(12-14-23)21-9-7-20(8-10-21)18-33-2/h4-15,19,24-26H,16-18,29H2,1-3H3/t19-,24-,25-,26-/m1/s1
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| 化学名 |
(1R,2R)-N-[(2R,3R)-2-amino-3-methoxybutyl]-N-[4-[4-(methoxymethyl)phenyl]phenyl]-2-pyridin-2-ylcyclopropane-1-carboxamide
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| 别名 |
RTI-13951-33; RTI13951-33; 2244884-08-8; RTI-1395133; CHEMBL4595209; SCHEMBL24543088;
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.1759 mL | 10.8795 mL | 21.7590 mL | |
| 5 mM | 0.4352 mL | 2.1759 mL | 4.3518 mL | |
| 10 mM | 0.2176 mL | 1.0879 mL | 2.1759 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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