Setrobuvir   中文名称: 塞托布韦

HCV NS5B polymerase; Setrobuvir targets the HCV NS5B RNA-dependent RNA polymerase, an essential enzyme for viral RNA replication . As a non-nucleoside inhibitor (NNI), it binds to the palm region I of the NS5B polymerase, specifically near the Tyr448 residue . Setrobuvir inhibits both de novo RNA synthesis and primer extension, with IC50 values between 4 and 5 nM in cell-free enzymatic assays . The compound shows differential potency across HCV subtypes: it is more potent against genotype 1b than genotype 1a .
Setrobuvir targets the HCV NS5B polymerase by binding to the palm I allosteric site, inhibiting both de novo RNA synthesis and primer extension.

对于携带HCV基因型1b/Con1的亚基因组复制子，非核苷类抑制剂赛曲布韦（ANA598）与HCV聚合酶的掌状口袋结合，其EC50值在纳摩尔范围内。影响拇指结合非核苷类抑制剂活性的突变并不影响赛曲布韦的活性，赛曲布韦似乎能够限制从头RNA合成和引物延伸[1]。

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在无细胞酶活性测定中，赛曲布韦对基因型1a和1b的重组HCV NS5B聚合酶表现出强效抑制作用，其IC50值低于纳摩尔。在基于 Huh-7 细胞的 HCV 复制子检测中，塞特罗布韦对基因型 1b（Con1 株）的 EC50 值为 3 nM，对基因型 1a（H77 株）的 EC50 值为 52 nM，且无明显的细胞毒性（CC50 ~100 μM）。该化合物对赋予蛋白酶抑制剂、核苷类聚合酶抑制剂和其他结合于不同位点的非核苷类抑制剂耐药性的突变仍保持完全活性。塞特罗布韦在体外还与干扰素-α 以及代表性的 HCV 蛋白酶和聚合酶抑制剂表现出协同作用。
在体外，塞特罗布韦能有效抑制 HCV NS5B 聚合酶活性，对从头 RNA 合成和引物延伸的 IC50 值均在 4 至 5 nM 之间。它对含有 HCV 基因型 1b/Con1 的亚基因组复制子表现出强大的抗病毒活性，EC50 值在纳摩尔范围内。

在一项 I 期单药治疗研究中，每日两次分别给予 200 mg、400 mg 和 800 mg 的赛曲布韦，持续 3 天，可快速且持续地降低 HCV RNA 水平。病毒动力学模型显示，赛曲布韦的 EC50 值和病毒清除率在 HCV 1b 和 1a 亚型感染患者中存在显著差异，导致 1b 基因型感染患者的病毒载量下降幅度更大。在一项 IIb 期研究中，赛曲布韦联合聚乙二醇干扰素和利巴韦林治疗，在初治患者中实现了 78% 的完全早期病毒学应答 (cEVR)，在既往部分应答/复发患者中实现了 76% 的 cEVR，而安慰剂联合标准治疗组的 cEVR 率分别为 56% 和 44%。值得注意的是，29% 的既往无应答患者在接受赛曲布韦联合标准治疗后达到了持续病毒学应答（cEVR）。
在体内，赛曲布韦已在丙型肝炎病毒感染动物模型中显示出抗病毒活性。它已在丙型肝炎的临床试验中进行评估，通常与其他直接抗病毒药物（DAA）联合使用以增强疗效。

表面等离子共振。[1]
所有分析物结合实验均使用Biacore T100仪器进行，采用预先用N-羟基琥珀酰亚胺酯和1-乙基-3-(3-二氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化的CM5传感器芯片。1bΔ21 NS5B蛋白及其变体经5分钟注入后固定，标称密度约为9,000个响应单位。随后注入乙醇胺7分钟使表面失活。化合物注入的缓冲液包含25 mM HEPES（pH 7.4）、10 mM MgCl₂、150 mM NaCl、0.01% Tween 20、0.05% β-巯基乙醇和5% DMSO。所有化合物均表现出饱和的1:1结合行为。对于竞争性结合实验，实验设计包括：首先注入饱和浓度的第一分析物（160 nM filibuvir），然后立即注入等摩尔比的分析物混合物（160 nM filibuvir 加 160 nM VX-222 或 Setrobuvir (RO-5466731；ANA-598)）。

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使用重组酶的无细胞生化酶活性测定法评估了 Setrobuvir 对 HCV NS5B 聚合酶的抑制活性。表达并纯化了源自 HCV 基因型 1a 和 1b 临床分离株的重组 NS5B 聚合酶。通过监测放射性标记核苷酸掺入 RNA 模板来测定聚合酶活性。测试了不同浓度的 Setrobuvir，并使用非线性回归分析从浓度-反应曲线计算了 IC50 值。研究发现，塞特罗布韦能够抑制RNA从头合成和引物延伸，IC50值介于4至5 nM之间。
塞特罗布韦的体外酶活性测定采用纯化的重组HCV NS5B聚合酶。将该酶与RNA模板、引物和核苷酸底物（包括放射性标记或荧光标记的核苷酸）在不同浓度的塞特罗布韦存在下进行孵育。通过测量核苷酸掺入正在延伸的RNA链的情况来确定聚合酶活性的抑制程度（IC50）。

利用表达HCV复制子的细胞测定EC50值。[1]
将含有复制子的Huh7.5细胞用胰蛋白酶消化后，以40,000个细胞/孔的密度接种于48孔板中。次日更换培养基，并向细胞中加入七种不同浓度的抑制剂，每两组抑制剂在200 μl完全培养基中以3倍或10倍的稀释度进行稀释，每个浓度设置三个复孔。48小时后，使用TRIzol试剂从复制子细胞中提取总RNA，并通过实时逆转录PCR (RT-PCR)定量病毒RNA。第一链cDNA合成使用1 μg总RNA、莫洛尼鼠白血病病毒(NEB)和4 μM随机9核苷酸(nt)引物混合物。 RT-PCR采用Bio-Rad IQ SYBR Green试剂盒，引物为HCV 5′-UTRsense（5′-AGC CAT GGC GTT AGT ATG AGT GTC-3′）和5′-UTRanti（5′-ACA AGG CCT TTC GCG ACC CAA C-3′）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的检测分别使用正义和反义寡核苷酸5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′和5′-TGG GAT TTC CAT TGA TGA CA-3′。所有反应混合物均在95℃加热10分钟，随后进行40个循环的PCR反应，每个循环包括95℃ 15秒、55℃ 20秒和72℃ 30秒。如前所述，将各组的倍数变化和百分比变化与对照组的值进行比较。使用GraphPad Prism软件，通过非线性回归分析和对数曲线拟合计算使HCV RNA复制子水平降低50%的有效药物浓度（EC50）。

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重组HCV聚合酶的表达和纯化。[1]
如前所述，将缺失C端21个氨基酸的HCV NS5B蛋白（命名为1bΔ21）克隆到pET-21b载体中。该构建体包含一个C端六组氨酸标签，以方便蛋白纯化。通过对野生型1bΔ21表达质粒进行定点诱变，构建了L419M、M423T和I482L耐药突变体。重组蛋白 1bΔ21 及其衍生突变蛋白的表达和纯化采用大肠杆菌提取物，纯化方法为：先用 Talon 金属亲和树脂进行纯化，再用 Mono S 柱进行纯化，具体步骤参照 Chinnaswamy 等人的描述。蛋白浓度采用 Nanodrop 分光光度计进行定量，随后通过 SDS-PAGE 和牛血清白蛋白滴定系列实验检测蛋白纯度和浓度。

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基于凝胶的 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (RdRp) 活性测定（使用小 RNA 模板）。 [1]
RdRp 活性测定在 20 μl 反应体系中进行，该体系包含 20 mM 谷氨酸钠（pH 8.2）、12.5 mM 二硫苏糖醇、4 mM MgCl2、1 mM MnCl2、0.5% Triton X-100、0.2 mM GTP、0.1 mM ATP 和 UTP、3.3 nM [α-32P]CTP、40 nM 重组 RNA 聚合酶、100 nM PE46 和 50 nM LE19p。反应混合物在 30°C 下孵育 1 小时，然后用苯酚-氯仿抽提终止反应，最后在 5 μg 糖原和 0.3 M NaO-乙酸钠（pH 5.2）存在下进行 RNA 的乙醇沉淀。 RNA产物经7.5 M尿素-20%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。信号由PhosphorImager检测，并使用ImageQuant软件进行定量。50%抑制浓度（IC50）采用GraphPad Prism软件，通过对数曲线拟合的非线性回归分析计算得出。

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使用HCV亚基因组复制子系统评估了setrobuvir在细胞培养中的抗病毒活性。将携带1b基因型（Con1株）或1a基因型（H77株）HCV亚基因组复制子的Huh-7细胞（人肝癌细胞）接种于检测板中。将细胞与系列稀释的setrobuvir在37°C、5% CO₂条件下孵育3天。孵育后，通过测量荧光素酶活性或实时PCR定量HCV复制。 EC50 值（使 HCV RNA 复制减少 50% 所需的浓度）由浓度-反应曲线计算得出。同时，采用 CellTiter-Glo 或 MTT 法平行评估细胞毒性，以确定 CC50 值。Setrobuvir 对基因型 1b 的 EC50 值为 3 nM，对基因型 1a 的 EC50 值为 52 nM，CC50 值约为 100 μM。
Setrobuvir 的体外细胞试验采用 HCV 亚基因组复制子细胞系（例如，携带 HCV 基因型 1b 复制子的 Huh-7 细胞）。将细胞用该化合物处理 48-72 小时，并通过实时 RT-PCR 或检测整合到复制子中的报告基因（例如，荧光素酶）来定量病毒 RNA 复制。病毒 RNA 或报告信号的减少用于计算 EC50 值。

为了支持临床开发，研究人员在大鼠和猴子身上开展了塞特罗布韦的临床前毒理学研究。Anadys Pharmaceuticals公司完成了大鼠26周和猴子39周的长期慢性毒理学研究，结果令人满意，支持在临床研究中进行长达一年的给药。提供的搜索结果中未包含有关具体给药方案、动物模型和终点的详细信息。
塞特罗布韦的体内动物研究采用具有人源化肝脏且易感HCV感染的嵌合小鼠模型进行。此外，也可使用其他HCV相关病毒（例如牛病毒性腹泻病毒，BVDV）的动物模型。该化合物经口服给药，并随时间推移测量血清中的病毒载量以评估其抗病毒疗效。

塞特罗布韦具有口服生物利用度，体外代谢稳定性良好，在人肝微粒体和猴肝微粒体中，当微粒体蛋白浓度为0.5 mg/mL时，其半衰期超过60分钟。临床研究中，塞特罗布韦的给药剂量分别为每日两次，每次200 mg、400 mg和800 mg。利用健康志愿者和丙型肝炎病毒（HCV）感染患者的药代动力学数据，建立了具有一级吸收和滞后时间的双室药代动力学模型。该化合物的分子量为560.62 g/mol，分子式为C25H25FN4O6S2。计算得到的ALogP值为2.98，表明其具有中等亲脂性。
塞特罗布韦是一种口服活性化合物。临床前动物和人体药代动力学研究已对其吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特征进行了表征。它已在临床试验中作为HCV联合治疗的一部分进行了评估。详细的药代动力学参数可从临床研究报告中获取。

塞特罗布韦在临床研究中展现出良好的安全性。在一项纳入283例患者的IIb期研究中，因不良事件而停止治疗的患者比例在接受塞特罗布韦联合聚乙二醇干扰素/利巴韦林治疗的患者（5.6%）和接受安慰剂联合标准治疗的患者（5.9%）之间相似。两组患者的不良事件特征相似，所报告的不良事件与单独接受干扰素和利巴韦林治疗的患者所报告的不良事件相似。塞特罗布韦组39%的患者出现皮疹（98%为轻度或中度），而对照组为22%。两组均未报告4级皮疹。在大鼠（26周）和猴子（39周）中进行的临床前毒理学研究结果良好，支持长期给药。根据材料安全数据表，塞特罗布韦被归类为非危险物质或混合物。美国国家毒理学计划 (NTP)、国际癌症研究机构 (IARC)、美国职业安全与健康管理局 (OSHA) 和美国政府工业卫生学家协会 (ACGIH) 均未发现该药物具有致癌性。
作为临床开发项目的一部分，已生成了塞曲布韦的全面毒理学数据。为支持其在人体临床试验中的应用，已开展了包括遗传毒性、安全性药理学以及在啮齿类和非啮齿类动物中重复给药毒性研究在内的标准临床前安全性评估。

[1]. Biochemical study of the comparative inhibition of hepatitis C virus RNA polymerase by VX-222 and filibuvir. Antimicrob Agents Chemother. 2012;56(2):830‐837.

[2]. SARS-CoV-2 RNA dependent RNA polymerase (RdRp) targeting: an in silico perspective. J Biomol Struct Dyn. 2021 Jun;39(9):3204-3212.

塞曲布韦已在临床试验中用于治疗慢性丙型肝炎。非利布韦和VX-222是非核苷类抑制剂（NNI），它们与丙型肝炎病毒（HCV）RNA依赖性RNA聚合酶的拇指II变构口袋结合。这两种化合物在临床试验中均显示出显著疗效，因此深入了解其抑制机制至关重要。本研究发现，非尼韦和VX-222分别以70 nM和5 nM的半数有效浓度（EC50）抑制HCV 1b/Con1亚基因组复制子。使用多种RNA模板进行的生化分析表明，这两种化合物优先抑制引物依赖性RNA合成，对从头RNA合成几乎没有影响。非尼韦和VX-222与HCV聚合酶的解离常数分别为29 nM和17 nM。研究人员分析了拇指II口袋中三种潜在耐药突变对这两种化合物抑制作用的影响。在亚基因组复制子和酶活性测定中，RNA聚合酶中的M423T突变使对非尼韦的耐药性至少提高了100倍。这种耐药性是由于突变酶与非尼韦的结合亲和力（K_d）降低了250倍。相比之下，VX-222的抑制活性仅受M423T突变的轻微影响，但受I482L突变的影响更为显著。[1] 迫切需要针对SARS-CoV-2的新疗法。如今，COVID-19感染正在全球造成巨大的健康危机。核苷酸抑制剂在对抗多种病毒感染方面已显示出良好的疗效。本研究利用分子建模、分子对接和动力学模拟方法构建了病毒蛋白RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）模型，并测试了其与一些临床批准药物和候选药物的结合亲和力。结合计算后，采用分子动力学模拟平衡系统，以确保成功复现先前的研究结果，并纳入RdRp的动力学信息，以了解其如何影响结合。结果表明，索非布韦、利巴韦林、加利地西韦、瑞德西韦、法匹拉韦、头孢呋辛、替诺福韦和羟氯喹均能有效结合SARS-CoV-2 RdRp。此外，西曲布韦、YAK和IDX-184表现出更佳的结合效果，四种新型IDX-184衍生物也显示出与SARS-CoV-2 RdRp结合的良好前景。因此，迫切需要开发能够选择性结合并抑制SARS-CoV-2蛋白的药物。目前已有几种获得FDA批准的抗病毒药物可以帮助我们完成降低COVID-19风险的任务。化合物2和3可能与SARS-CoV-2 RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）紧密结合，因此可能对治疗COVID-19有效。[2]
塞曲布韦（Setrobuvir）也称为ANA-598和RO-5466731。它是一种非核苷类抑制剂（NNI），可与HCV聚合酶的掌状口袋结合。它曾被开发用于治疗慢性丙型肝炎病毒感染。其研发状态可能终止或被更新的HCV疗法取代。

C25H25FN4O6S2

560.6154

560.12

C, 53.56; H, 4.50; F, 3.39; N, 9.99; O, 17.12; S, 11.44

1071517-39-9

135565932

Typically exists as solid at room temperature

4.725

162

3

9

5

38

1270

4

FC1C=CC(CN2C3C(C4CC3CC4)C(O)=C(C3=NC4C=CC(NS(C)(=O)=O)=CC=4S(=O)(=O)N3)C2=O)=CC=1

DEKOYVOWOVJMPM-RLHIPHHXSA-N

InChI=1S/C25H25FN4O6S2/c1-37(33,34)28-17-8-9-18-19(11-17)38(35,36)29-24(27-18)21-23(31)20-14-4-5-15(10-14)22(20)30(25(21)32)12-13-2-6-16(26)7-3-13/h2-3,6-9,11,14-15,20,22,28,31H,4-5,10,12H2,1H3,(H,27,29)/t14-,15+,20+,22-/m0/s1

N-[3-[(1R,2S,7R,8S)-3-[(4-fluorophenyl)methyl]-6-hydroxy-4-oxo-3-azatricyclo[6.2.1.02,7]undec-5-en-5-yl]-1,1-dioxo-4H-1λ6,2,4-benzothiadiazin-7-yl]methanesulfonamide

RG-7790; ANA-598; RG7790; ANA598; RO5466731; RO-5466731; RO 5466731; 1071517-39-9; Setrobuvir [USAN]; Setrobuvir [USAN:INN]; Setrobuvir [INN]; Setrobuvir (USAN); T5B2GI8F84; Setrobuvir

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。