TC-E 5002

Histone demethylase KDM2/7

在MALDI试验中，TC-E 5002/compound 9对KDM7B的活性是6的20倍。化合物9在KDM7B活性位点的对接表明，化合物9的环丙基通过CH−π或环丙基−π相互作用与Phe 250的苯基相互作用（图2）。此外，化合物9抑制KDM2A（也称为JHDM1A， FBXL11）， KDM7A（也称为JHDM1D， KIAA1718）和KDM7B，显示出对所有KDM2/7亚家族成员的抑制作用（表2和3）。化合物9对KDM2/7的选择性超过KDM4A (IC50 > 120 μM), KDM4C (IC50 = 83 μM)， KDM2/7的选择性高于KDM4A (IC50 > 120 μM), KDM4C （IC50 = 83 μM）。KDM5A （IC50 = 55 μM）和KDM6A（也称为UTX） （IC50 > 100 μM）；但请注意使用不同的测定条件（见实验部分）。因此，化合物9是酶分析中发现的最有效的KDM7B抑制剂。此外，化合物13对KDM2A的选择性高于KDM7B和其他同工酶。由于分子模型表明KDM7B疏水口袋中9环丙烷环周围的空间不是很大（图2），因此带有苯基环的化合物13可能很难形成能有效与口袋中的Phe相互作用的构象。另一方面，KDM2A具有比KDM7B更宽敞的疏水口袋（支持信息图S2），其中的苯环可以有效地与KDM2A的疏水氨基酸残基相互作用。这可能是化合物13对KDM2A比KDM7B具有选择性的原因。[1]

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为了研究TC-E 5002/化合物9是否作为KDM7A和KDM7B的抑制剂在细胞中具有活性，我们使用Western blot分析进行了细胞实验。由于已知KDM7可以催化H3K27me2,10,11的去甲基化，因此我们分析了细胞中H3K27的甲基化水平。在这项研究中，我们使用N2a细胞，因为有报道称KDM7在细胞中表达如图3所示，在9的存在下，H3K27me2的水平呈剂量依赖性升高。尽管对全局组蛋白n -甲基化状态变化的解释可能很复杂，但H3K27me2水平的升高与KDM7抑制一致。这些结果表明细胞中H3K27me2的去甲基化受到化合物9的抑制，并且它看起来可以作为探测KDM7.的生物学作用的工具[1]。

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虽然有报道称rnai介导的KDM7B的敲低抑制了一些癌细胞的生长，但目前尚不清楚KDM7B的去甲基化酶功能是否与这种抑制有关，因为rnai介导的KDM7B的敲低不仅会导致去甲基化酶功能的丧失，还会导致KDM7B的其他功能的丧失，12包括与非催化结合域有关的功能。首先，我们研究了TC-E 5002/化合物9对N2a细胞生长的抑制活性。在Western blot分析（图3）检测到明显H3K27甲基化的浓度范围内，化合物9对N2a细胞生长的抑制作用被观察到（GI50 = 86 μM）（图4）。因此，这可能表明KDM7的去甲基化酶功能参与了这种细胞生长，然而，需要更有效和选择性的化合物来充分阐明这一事实。接下来，我们使用HeLa细胞和KYSE150细胞对化合物9以及前药1、2和3进行了细胞生长抑制实验（表3）。也有报道称，KDM4C抑制剂2、3（表3）和它们的甲酯前药（GI50 bb0 500 μM）虽然是细胞膜透性的，但对所测试的癌细胞的生长抑制没有任何影响。这些结果表明，至少在某些细胞类型中，KDM4C的去甲基化酶活性与癌细胞生长没有直接关系。另一方面，KDM2/7亚家族抑制剂9在KYSE150和HeLa细胞系中观察到细胞生长抑制（图5）。此外，化合物9在HeLa细胞和KYSE150细胞中均引起H3K27甲基化，在细胞生长抑制的浓度范围内（图6）。表3所示的数据表明，KDM2/7抑制剂值得作为候选抗癌药物进行评估[1]。

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最近一项研究报道，KDM7B激活HeLa细胞中E2F1转录因子的转录，从而促进细胞周期的进展因为TC-E 5002/化合物9降低了H3K27me2积累的HeLa细胞的生长(表3；图5和图6)，我们通过定量RT-PCR检测化合物9是否下调了HeLa细胞中E2F1的表达。如图7所示，化合物9显著降低80 μM时E2F1 mRNA水平，影响HeLa细胞的生长。这些数据提示kdm7b介导的E2F1基因表达调控可能是某些癌细胞生长调控的机制之一[1]

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KDM7B抑制试验[1]
KDM7B （0.5 mg/mL）与150 mM KCl、2.5%甘油、0.5 mM二硫苏糖醇、0.05 mM PMSF、2.5 mM谷胱甘肽还原形式、20 μM (+)-Fe(II)-l-抗坏血酸、20 μM ZnCl2、0.5 mM抗坏血酸、0.5 mM 2-氧葡萄糖酸和5 μM H3K4me3K9me2 (ART（Kme3)QTAR(Kme2)STGGKAPRKQL-Cys）在8 μL 10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中37℃孵育1小时。加入75 μL的基质溶液（5 mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸、37%乙腈、0.12%三氟乙酸）停止反应，超声30 s。将1 μL的反应混合物点染在样品板上，干燥后使用Voyager-DE PRO进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析。测试化合物的KDM7B抑制活性由H3K9me2的残留量计算。测试化合物的50%抑制浓度（IC50）计算为去除一半H3K9me2的浓度与添加酶时去除的浓度（辅助信息图S7）。

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KDM4C抑制试验[1]
用0.6 mg/mL酶测定kdm4c抑制活性。这些化合物溶解在二甲基亚砜中。反应混合物中DMSO的终浓度均小于3.3%，证实了3.3%的DMSO对KDM4C活性没有影响。与DMSO单独反应也作为对照。反应混合物（94.6 μL），除H3K9me3肽和2-氧戊二酸外，其余物质均含有，预孵育5min，然后加入5.4 μL的0.93 mM H3K9me3肽和3.7 mM 2-氧戊二酸溶液开始反应。酶活性测定方法如上所述。在抑制剂存在的情况下，测量的酶活性与对照组的酶活性之比根据log [inhibitor]绘制。为了证实测试化合物对KDM4C活性的降低不是由于抑制偶联酶FDH，我们检查了测试化合物对FDH活性的影响。反应混合物（0.1 mL）中含有HEPES-KOH 20 mM、pH 7.5、甲醛50 μM、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸1 mM、还原性谷胱甘肽1 mM、牛血清白蛋白0.1 mg/mL、FDH 0.1 mg/mL和固定浓度123 μM的测试化合物。FDH活性是通过监测APADH的形成来测量的，如上所述。存在试验化合物时的FDH活性与不存在试验化合物时相似。

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KDM4A抑制试验[1]
KDM4A活性的测定采用了KDM4C的fdhh偶联法，不同之处是反应在384孔板（Nunc）中以30 μL的终体积进行，KDM4A的终浓度为0.37 mg/mL。

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KDM5A抑制试验[1]
KDM5A活性测定采用与KDM4C相同的fdh偶联法，不同之处是与H3K4me3肽在384孔板（Nunc）中以30 μL的终体积进行反应，KDM5A终浓度为0.64 mg/mL。

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KDM2A抑制试验[1]
实验化合物对KDM2A的抑制活性根据文献(4)报道的方法进行测定。

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KDM6A抑制试验[1]
KDM6A酶检测采用表观igenase JMJD3/UTX去甲基酶活性/抑制测定试剂盒。根据供应商的方案，将随试剂盒提供的材料、100 μM的测试化合物和KDM6A （300 ng/孔）添加到涂覆三甲基化组蛋白底物的孔中。在37℃下孵育120分钟。酶反应后，每孔与捕获抗体反应60分钟，与检测抗体反应30分钟。最后，依次将显影液和停止液加入孔中，用ARVO X3酶标仪测量每孔的吸光度（450 nm）。根据吸光度值计算受试化合物的KDM6A抑制活性。

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KDM7A抑制试验[1]
使用MALDI和K27me2肽作为底物，在与文献(4)相同的条件下进行KDM7A测定。

RNA的分离与半qrt - pcr [1]
以浓度为30 μM和80 μM的0.238% DMSO或TC-E 5002/化合物9处理HeLa细胞48 h。按照制造商的方案，使用RNAzol从HeLa细胞中分离总RNA。利用ReverTra Ace从总RNA合成第一链cDNA。利用2720热循环器 进行半定量PCR （semi-qPCR）分析。引物是针对被测基因的特异性引物，其序列如下：
GAPDH 450bp引物(F): 5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 ‘ （20mer）引物(R): 5 ’ - accacagtccatgccatca3 ' (20mer)
E2F1 435bp引物(F): 5 ' -ACTCCTCGCAGATCGTCATCATCT-3 ‘ （24mer）引物(R): 5 ’ - ggacgttggtgatgtcatagatggcg -3 ' (25mer)
循环参数为94°C 2 min，然后是28 (E2F1), 20 （GAPDH）循环，98°C 10 s, 60°C 30 s, 68°C 30 s，最后延长至68°C 1 min。

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流式细胞仪分析[1]
细胞（5 × 105）用TC-E 5002/化合物9在指定浓度的RPMI 1640和10%胎牛血清中处理24 h，然后通过胰蛋白酶化收获。离心收集细胞，用70%乙醇冷冻固定，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，用0.5 mL含碘化丙啶（10 μg/mL）和RNase A （0.2 mg/mL）的磷酸盐缓冲盐水重悬。最终在25°C孵育30分钟后，使用JSAN流式细胞仪分析细胞。每个样本总共统计了30000个事件。使用FlowJo软件对数据进行分析。

[1]. Identification of the KDM2/7 histone lysine demethylase subfamily inhibitor and its antiproliferative activity. J Med Chem. 2013 Sep 26;56(18):7222-31.

组蛋白N(ε)-甲基赖氨酸去甲基酶KDM2/7已被确定为潜在的癌症治疗靶点。基于KDM7B的晶体结构，我们设计并制备了一系列带有烷基链的羟肟酸类似物。酶活性测定表明，化合物9能有效抑制KDM2A、KDM7A和KDM7B，其IC50值分别为6.8、0.2和1.2 μM。虽然KDM4抑制剂对所测试的癌细胞没有显示出任何作用，但KDM2/7亚家族抑制剂9表现出抗增殖活性，表明KDM2/7抑制剂具有作为抗癌药物的潜力。我们鉴定了一种新型KDM2/7亚家族抑制剂9，它有望作为先导化合物用于开发更有效、更具选择性的KDM2/7抑制剂。此类抑制剂既可作为抗癌药物的候选药物，也可作为研究 KDM2/7 亚家族在细胞中生物学作用的工具。[1]

C15H27NO4

285.38

285.194

C, 63.13; H, 9.54; N, 4.91; O, 22.42

1453071-47-0

71735843

White to off-white solid powder

87 °C

3.209

77.84

2

4

12

20

302

0

NEHSERYKENINRH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H27NO4/c17-14(16(20)12-11-15(18)19)8-6-4-2-1-3-5-7-13-9-10-13/h13,20H,1-12H2,(H,18,19)

3-[9-cyclopropylnonanoyl(hydroxy)amino]propanoic acid

TCE 5002; TC E 5002; 1453071-47-0; TC-E 5002; N-(9-Cyclopropyl-1-oxononyl)-N-hydroxy-beta-alanine; 3-(9-CYCLOPROPYL-N-HYDROXYNONANAMIDO)PROPANOIC ACID; KDM2/7-IN-1; CHEMBL2424812; NCDM-64; MFCD28166486; TC-E 5002

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。