TC-E 5002

Histone demethylase KDM2/7
TC-E 5002 targets the KDM2/7 histone demethylase subfamily, which includes KDM2A, KDM7A, and KDM7B. It inhibits KDM7A with an IC50 of 0.2 μM, KDM7B with an IC50 of 1.2 μM, and KDM2A with an IC50 of 6.8 μM. It is selective for the KDM2/7 subfamily over KDM5A, KDM4C, KDM6A, and KDM4A.

在MALDI检测中，TC-E 5002/化合物9对KDM7B的活性是化合物6的20倍。化合物9与KDM7B活性位点的分子对接表明，化合物9的环丙基通过CH-π或环丙基-π相互作用与Phe 250的苯基相互作用（图2）。此外，化合物9抑制了KDM2A（也称为JHDM1A、FBXL11）、KDM7A（也称为JHDM1D、KIAA1718）和KDM7B，表明其对所有测试的KDM2/7亚家族成员均有抑制作用（表2和表3）。化合物 9 对 KDM2/7 的选择性高于 KDM4A (IC50 > 120 μM)、KDM4C (IC50 = 83 μM)、KDM5A (IC50 = 55 μM) 和 KDM6A（又名 UTX）(IC50 > 100 μM)；但需要注意的是，所用检测条件不同（参见实验部分）。因此，化合物 9 是酶活性测定中发现的最有效的 KDM7B 抑制剂。此外，化合物 13 对 KDM2A 的选择性也高于 KDM7B 和其他测试的同工酶。由于分子建模表明，化合物 9 的环丙烷环周围的空间在 KDM7B 的疏水腔中并不大（图 2），因此，带有苯环的化合物 13 可能难以形成能够与该疏水腔中的苯丙氨酸有效相互作用的构象。另一方面，KDM2A 的疏水腔比 KDM7B 的疏水腔更大（见补充信息图 S2），其中苯环可以有效地与 KDM2A 的疏水性氨基酸残基相互作用。这可能是化合物 13 对 KDM2A 的选择性高于 KDM7B 的原因。[1]

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为了研究 TC-E 5002/化合物 9 是否具有抑制细胞内 KDM7A 和 KDM7B 的活性，我们进行了细胞实验并结合蛋白质印迹分析。由于已知 KDM7 可以催化 H3K27me2、10、11 的去甲基化，因此我们分析了细胞内 H3K27 的甲基化水平。在本研究中，我们使用了N2a细胞，因为已有报道称KDM7在该细胞中表达¹¹。如图3所示，在化合物9存在的情况下，H3K27me2水平呈剂量依赖性升高。尽管整体组蛋白N-甲基化状态的变化可能较为复杂，但H3K27me2水平的升高与KDM7的抑制作用相符。这些结果表明，化合物9能够抑制细胞内的H3K27me2去甲基化，并且有望成为研究KDM7生物学功能的有效工具^[1]。尽管已有报道称RNAi介导的KDM7B敲低能够抑制某些癌细胞的生长⁶，但KDM7B的去甲基化酶功能是否是抑制作用的原因尚不清楚，因为RNAi介导的KDM7B敲低不仅会导致去甲基化酶功能的丧失，还会导致KDM7B其他功能的丧失¹²，包括与非催化结合域相关的功能。首先，我们研究了TC-E 5002/化合物 9对 N2a 细胞生长的抑制活性。在 Western blot 分析中检测到明显的 H3K27 甲基化（图 3）的浓度范围内，观察到化合物 9 对 N2a 细胞生长具有抑制作用（GI50 = 86 μM）（图 4）。因此，这可能表明 KDM7 的去甲基化酶功能参与了该细胞生长过程，然而，需要更有效、更具选择性的化合物来充分阐明这一事实。接下来，我们使用 HeLa 细胞和 KYSE150 细胞对化合物 9 以及前药 1、2 和 3 进行了细胞生长抑制实验（表 3）。据报道，敲低KDM4C可降低细胞增殖^7a，然而，KDM4C抑制剂2、3（表3）及其甲酯前药（GI₅₀ > 500 μM）虽然能够透过细胞膜^7d,13，但并未对所测试的癌细胞的生长抑制产生任何影响。这些结果表明，KDM4C的去甲基化酶活性与癌细胞生长没有直接关联，至少在某些细胞类型中是如此。另一方面，在KYSE150和HeLa细胞系中观察到了KDM2/7亚家族抑制剂9的细胞生长抑制作用（图5）。此外，在观察到细胞生长抑制的浓度范围内，化合物9在HeLa细胞和KYSE150细胞中均引起了H3K27甲基化（图6）。表3所示数据表明，KDM2/7抑制剂值得作为候选抗癌药物进行评估。[1]

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最近一项研究报道，KDM7B激活HeLa细胞中E2F1转录因子的转录，从而促进细胞周期进程。¹⁴由于TC-E 5002/化合物9可抑制H3K27me2积累的HeLa细胞的生长（表3；图5和图6），我们通过定量RT-PCR检测了化合物9是否能下调HeLa细胞中E2F1的表达。如图7所示，化合物9在80 μM浓度下显著降低了E2F1的mRNA水平，同时HeLa细胞的生长也受到影响。这些数据表明，KDM7B介导的E2F1基因表达调控可能是某些癌细胞生长调控机制之一。[1] 我们还通过FACS分析研究了TC-E 5002/化合物9对细胞周期进程的影响。HeLa细胞和KYSE150细胞与10或100 μM的化合物9孵育24小时后，G2/M期细胞比例呈剂量依赖性降低，而G0/G1期细胞比例呈剂量依赖性增加（图8）。这些结果表明，与化合物9共同培养的HeLa细胞和KYSE150细胞停滞在细胞周期的G0/G1期，这与化合物9下调E2F1表达的结果一致（图7）。 [1]体外实验表明，TC-E 5002 对 KDM7A、KDM7B 和 KDM2A 的抑制 IC50 值分别为 0.2、1.2 和 6.8 μM。它对 KDM2/7 亚家族的选择性高于 KDM4A、KDM4C、KDM5A 和 KDM6A/UTX（IC50 值分别为 >120、83、55 和 100 μM）。体外实验表明，TC-E 5002 可抑制 HeLa 和 KYSE-150 癌细胞的生长。

TC-E 5002 具有体内抗肿瘤活性，可抑制 N2a 神经母细胞瘤细胞的生长。作为一种组蛋白去甲基化酶抑制剂，它通过改变组蛋白甲基化模式来调节基因表达，从而导致细胞增殖和分化发生改变。然而，现有文献中并未提供包括给药方案和动物模型在内的具体体内疗效数据。

KDM7B 抑制试验[1]
将 KDM7B (0.5 mg/mL) 与 150 mM KCl、2.5% 甘油、0.5 mM 二硫苏糖醇、0.05 mM PMSF、2.5 mM 还原型谷胱甘肽、20 μM (+)-Fe(II)-l-抗坏血酸、20 μM ZnCl2、0.5 mM 抗坏血酸、0.5 mM 2-氧代戊二酸和 5 μM H3K4me3K9me2 (ART(Kme3)QTAR(Kme2)STGGKAPRKQL-Cys) 在 8 μL 10 mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.0) 中于 37 °C 孵育 1 小时。加入75 μL基质溶液（5 mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸、37%乙腈和0.12%三氟乙酸）终止反应，并超声处理30 s。然后取1 μL反应混合物点样于样品板上，干燥后，使用Voyager-DE PRO质谱仪进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析。测试化合物的KDM7B抑制活性根据剩余的H3K9me2含量计算。测试化合物的半数抑制浓度 (IC50) 计算为：与添加酶时去除的 H3K9me2 量相比，去除量减半时的化合物浓度（见补充信息图 S7）。

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KDM4C 抑制活性测定[1]
使用 0.6 mg/mL 的酶测定 KDM4C 抑制活性。化合物溶解于 DMSO 中。反应混合物中 DMSO 的最终浓度低于 3.3%，并证实 3.3% 的 DMSO 不会影响 KDM4C 活性。同时进行仅含 DMSO 的反应作为对照。反应混合物 (94.6 μL) 包含除 H3K9me3 肽和 2-酮戊二酸以外的所有物质，并预孵育 5 分钟。然后加入5.4 μL含有0.93 mM H3K9me3肽和3.7 mM 2-酮戊二酸的溶液启动反应。酶活性测定方法如上所述。将抑制剂存在下测得的酶活性与对照组的酶活性之比作图，横坐标为log[抑制剂]。为了确认测试化合物对KDM4C活性的降低并非由于其对偶联酶FDH的抑制，我们检测了测试化合物对FDH活性的影响。反应混合物（0.1 mL）包含20 mM HEPES-KOH缓冲液（pH 7.5）、50 μM甲醛、1 mM 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸、1 mM还原型谷胱甘肽、0.1 mg/mL BSA、0.1 mg/mL FDH以及固定浓度的123 μM测试化合物。FDH活性通过监测APADH的生成来测定，方法如上所述。在测试化合物存在下，FDH活性与不存在化合物时相似。

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KDM4A抑制试验[1]
KDM4A活性采用FDH偶联法测定，方法与KDM4C相同，不同之处在于反应在384孔板（Nunc）中进行，最终体积为30 μL，KDM4A的最终浓度为0.37 mg/mL。

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KDM5A抑制试验[1]
KDM5A活性采用FDH偶联法测定，方法与KDM4C相同，不同之处在于反应在384孔板（Nunc）中进行，最终体积为30 μL，并加入H3K4me3肽，KDM5A的最终浓度为0.64 mg/mL。

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KDM2A抑制试验[1]
测试化合物对KDM2A的抑制活性按照文献[1]所述方法进行测定。参考文献 (4).

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KDM6A 抑制测定[1]
使用 Epigenase JMJD3/UTX 去甲基化酶活性/抑制测定试剂盒进行 KDM6A 酶活性测定。根据供应商提供的操作规程，将试剂盒提供的材料、100 μM 的待测化合物和 KDM6A（300 ng/孔）加入到包被有三甲基化组蛋白底物的孔中。将混合物在 37 °C 下孵育 120 分钟。酶反应结束后，每个孔依次加入捕获抗体反应 60 分钟，再加入检测抗体反应 30 分钟。最后，依次加入显色液和终止液，并使用 ARVO X3 酶标仪测量每个孔的吸光度（450 nm）。测试化合物的 KDM6A 抑制活性通过吸光度读数计算得出。

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KDM7A 抑制测定[1]
KDM7A 测定采用 MALDI 和 K27me2 肽作为底物，在与参考文献 (4) 相同的条件下进行。

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TC-E 5002 的体外酶活性测定包括测量组蛋白去甲基化酶活性。将重组 KDM2/7 酶与组蛋白底物和不同浓度的 TC-E 5002 一起孵育。通过检测甲醛的释放或使用基于抗体的甲基化组蛋白标记检测来定量去甲基化活性。IC50 值由浓度-反应曲线计算得出。

RNA 分离和半定量 RT-PCR[1]
将 HeLa 细胞分别用 0.238% DMSO 或浓度为 30 μM 和 80 μM 的 TC-E 5002/化合物 9 处理 48 小时。使用 RNAzol 试剂盒，按照制造商的说明书从 HeLa 细胞中分离总 RNA。使用 ReverTra Ace 反转录酶从总 RNA 合成第一链 cDNA。然后使用 2720 型 PCR 仪对所得 cDNA 进行半定量 PCR (semi-qPCR) 分析。引物针对所检测的基因具有特异性，其序列如下：
GAPDH 450bp 引物(F)：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′ (20mer) 引物(R)：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′ (20mer)
E2F1 435bp 引物(F)：5′-ACTCCTCGCAGATCGTCATCATCT-3′(24mer) 引物(R)：5′-GGACGTTGGTGATGTCATAGATGCG-3′(25mer)
循环参数为：94 °C 预变性 2 分钟，然后进行 28 个循环（E2F1）或 20 个循环（GAPDH），每个循环包括 98 °C 变性 10 秒、60 °C 退火 30 秒和 68 °C 延伸 30 秒，最后在 68 °C 下延伸 1 分钟。

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FACS分析[1]
将 5 × 10⁵ 个细胞用指定浓度的 TC-E 5002/化合物 9 在含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中处理 24 小时，然后用胰蛋白酶消化收集细胞。离心收集细胞，用冰冷的 70% 乙醇固定，用磷酸盐缓冲液洗涤，并重悬于 0.5 mL 含碘化丙啶 (10 μg/mL) 和 RNase A (0.2 mg/mL) 的磷酸盐缓冲液中。在 25 °C 下孵育 30 分钟后，使用 JSAN 流式细胞仪分析细胞。每个样本计数 30000 个事件。使用 FlowJo 软件进行数据分析。

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对于体外细胞实验，培养 HeLa 和 KYSE-150 等癌细胞系，并用不同浓度的 TC-E 5002 处理。使用 MTT 或类似方法评估细胞活力和增殖。使用特异性抗体通过 Western blot 检测组蛋白甲基化水平。通过 qRT-PCR 或 RNA-seq 分析基因表达变化。

TC-E 5002 的体内动物研究通常采用免疫缺陷小鼠的肿瘤异种移植模型。将癌细胞皮下植入小鼠体内，待肿瘤形成后，根据药代动力学研究确定的剂量，通过口服或腹腔注射给药。每周测量两次肿瘤体积，并评估肿瘤组织中的组蛋白甲基化和基因表达变化。

TC-E 5002 的分子式为 C15H27NO4，分子量为 285.38。它是一种小分子抑制剂，在 DMSO 中具有良好的溶解性。现有文献中对其详细的药代动力学参数（吸收、分布、代谢、排泄、半衰期）描述尚不充分。该化合物仅供研究使用。

现有文献中并未提供TC-E 5002的具体毒性数据。作为一种组蛋白去甲基化酶抑制剂，其安全性预计与表观遗传调控相关。该化合物仅供研究使用，不得用于人体或临床治疗。若要进行治疗开发，则需要进行标准的毒理学评估。

[1]. Identification of the KDM2/7 histone lysine demethylase subfamily inhibitor and its antiproliferative activity. J Med Chem. 2013 Sep 26;56(18):7222-31.

组蛋白N(ε)-甲基赖氨酸去甲基酶KDM2/7已被确定为潜在的癌症治疗靶点。基于KDM7B的晶体结构，我们设计并合成了一系列带有烷基链的羟肟酸类似物。酶活性测定表明，化合物9能有效抑制KDM2A、KDM7A和KDM7B，IC50值分别为6.8、0.2和1.2 μM。尽管KDM4抑制剂对所测试的癌细胞没有显示出任何作用，但KDM2/7亚家族抑制剂9却表现出抗增殖活性，表明KDM2/7抑制剂具有作为抗癌药物的潜力。我们鉴定了一种新型的KDM2/7亚家族抑制剂9，有望将其作为先导化合物，用于开发更有效、更具选择性的KDM2/7抑制剂。这类抑制剂可作为抗癌药物的候选药物，也可作为研究KDM2/7亚家族在细胞中生物学功能的工具。 [1]

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TC-E 5002 是一种选择性组蛋白去甲基化酶 KDM2/7 亚家族抑制剂。它对 KDM7A、KDM7B 和 KDM2A 的抑制 IC50 值分别为 0.2、1.2 和 6.8 μM。该化合物具有抗肿瘤活性，可在体外抑制癌细胞的生长。目前，该化合物被用作研究工具，用于研究 KDM2/7 组蛋白去甲基化酶在癌症和其他疾病中的作用。尚未有获批的治疗用途报道。

C15H27NO4

285.38

285.194

C, 63.13; H, 9.54; N, 4.91; O, 22.42

1453071-47-0

71735843

White to off-white solid powder

87 °C

3.209

77.84

2

4

12

20

302

0

NEHSERYKENINRH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H27NO4/c17-14(16(20)12-11-15(18)19)8-6-4-2-1-3-5-7-13-9-10-13/h13,20H,1-12H2,(H,18,19)

3-[9-cyclopropylnonanoyl(hydroxy)amino]propanoic acid

TCE 5002; TC E 5002; 1453071-47-0; TC-E 5002; N-(9-Cyclopropyl-1-oxononyl)-N-hydroxy-beta-alanine; 3-(9-CYCLOPROPYL-N-HYDROXYNONANAMIDO)PROPANOIC ACID; KDM2/7-IN-1; CHEMBL2424812; NCDM-64; MFCD28166486; TC-E 5002

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。