THI0019

THI0019 是通过对先前发现的 α4β1 拮抗剂进行两次结构修饰而生成的。THI0019 大大增强了培养细胞系和原代祖细胞在静态和流动条件下对 α4β1 配体 VCAM-1 和 CS1 的粘附。此外，THI0019 促进了细胞在 VCAM-1 上的滚动和扩散以及细胞向 SDF-1α 的迁移。分子建模预测该化合物在与配体结合位点重叠的 α/β 亚基界面处结合，从而表明该化合物必须在配体结合时被取代。为了支持该模型，使用了一种经过修饰以包含光反应性基团的 THI0019 类似物来证明当交联到整合素时，该化合物表现为拮抗剂而不是激动剂。此外，THI0019 与相关整合素 α4β7 以及 α5β1 和 αLβ2 表现出交叉反应性。当与 αLβ2 交联时，THI0019 的光反应性类似物仍是一种激动剂，这与它与 α/β 亚基界面结合而不是与 αL 亚基插入（“I”）结构域中的配体结合位点结合一致。将祖细胞与 THI0019 等化合物共同给药可能提供一种增强干细胞治疗的机制。[1]

平行板流动分离试验
将重组人 VCAM-1（10 μg/ml 或 5 μg/ml，0.1 m NaHCO3 溶液）在 4 °C 下过夜固定在从 15 × 100 mm 聚苯乙烯培养皿切下的 24 × 50 mm 载玻片上。用 PBS 清洗载玻片，在室温下用 2% (w/v) BSA 封闭 2 小时，然后组装到平行板流动室中。对于分离试验，将载体、10 μm THI0019、10 μg/ml mAb TS2/16 或每种的组合与 Jurkat 细胞在低亲和力运行缓冲液中混合，然后将 2.0 × 106 个细胞注入流动室并让其在载玻片上停留 10 分钟。使用计算机控制的注射泵（哈佛仪器）将线性梯度递增的剪切流拉过粘附细胞 300 秒。每 50 秒计算一次剪切应力。剪切应力（达因/cm2）定义为 (6 μQ)/(wh2)，其中 μ 是介质的粘度（0.007）；Q 是流速（cm3/s）；w 是腔室宽度（0.3175 cm），h 是腔室高度（0.01524 cm）。每 50 秒用数字显微镜 (VI-470 电荷耦合器件摄像机；Optronics Engineering) 在倒置尼康 DIAPHOT-TMD 显微镜上以 ×20 记录一次附着的细胞数，并绘制成时间图。[1]

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细胞滚动测定
将基质细胞 (M2-10B4) 接种在从 125 毫升组织培养瓶中切下的 24 × 50 毫米载玻片上，在标准组织培养条件下培养过夜，并组装到平行板流动室中。将 TF1 细胞 (2.0 × 106) 与载体或 10 μm THI0019 在运行缓冲液中混合，然后注入平行板流动室系统。对系统施加 0.5 达因/cm2 的恒定剪切流 300 秒，并用数字显微镜记录滚动穿过基质细胞单层的 TF1 细胞。然后使用 Imaris Bitplane 软件（版本 7.6.1）分析数字记录，以确定单个细胞在单层上移动的速度。观察区域为 500 μm，仅包括移动至少 400 μm 的细胞。细胞速度定义为移动距离除以移动该距离的时间。[1]

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迁移测定
迁移测定在 3 μm 孔径 Transwells（24 孔，Costar，马萨诸塞州剑桥）中进行。上室在 50 μl TBS 中预涂 3 μg/ml 纤连蛋白或 10 μg/ml VCAM-1，在 4 °C 下过夜，然后在室温下用 2% BSA 封闭 1 小时。用迁移培养基（RPMI 1640 培养基，添加 1% FBS、100 单位/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）清洗后，上室中装有 160 μl 迁移培养基中的 Jurkat 细胞（2 × 105 个细胞）。下室含有 600 μl 迁移培养基，添加 10 μg/ml SDF-1α 以诱导趋化性。将 Jurkat 细胞与载体（1% DMSO）或 THI0019 以所示浓度混合，然后立即加入上室。在 37 °C、5% CO2 下孵育 4 小时后，取出上室，收集下室中的细胞并在血细胞计数器上计数。结果表示为迁移的细胞总数。[1]

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THI0019 与 α4β7 晶体结构的计算机对接
在 16 核 2.4 GHz AMD Operon 系统上使用 Modeling Suite 2012 来可视化 THI0019 与整合素模型的结合。从 α4β7 的晶体结构开始生成 Glide 对接模型。从蛋白质数据库下载结构 3v4v 并读入 Maestro 。删除除 A（α4）和 B（β7）之外的所有链。使用程序默认值进行基本的蛋白质制备，另外填充缺失的侧链并删除杂原子中 5 Å 以外的水分子。在链 A 中的 Ser-559 和链 B 中的 Cys-455 中发现了缺失的原子。模型蛋白质部分的完整制备包括以下内容：1)基本蛋白质制备； 2) 杂原子状态的分配；3) H 键分配，包括 PROPKA；4) 将少于三个 H 键的水删除为非水；5) Impref“仅 H”最小化；6) Impref“最小化所有”至均方根偏差 = 0.5。对于 THI0019，使用默认标准和 Epik 电离对结构（导入为 SDF 文件）执行 Lig PREP 计算。使用基于晶体结构配体的默认设置生成 Glide Grid。此外，还为金属离子指定了约束。为晶体结构配体提交了虚拟筛选工作流程，然后为 THI0019 提交了虚拟筛选工作流程。虚拟筛选工作流程涉及与 Glide XP 模式对接，从三个额外构象开始，然后使用 Prime MMGBSA ΔGbind 重新评分。[1]

Small molecule agonist of very late antigen-4 (VLA-4) integrin induces progenitor cell adhesion. J Biol Chem 2013 Jul 5;288(27):19414-28.

C29H35N3O7S2

601.733

601.19

C, 57.89; H, 5.86; N, 6.98; O, 18.61; S, 10.66

1378532-99-0

67704761

Solid powder

4.7

172

2

9

16

41

835

2

CCCC[C@@H](COC(=O)N(CC1=CC=CS1)CC2=CC=CS2)NC(=O)N[C@@H](CC(=O)OC)C3=CC4=C(C=C3)OCO4

QWDGYRDMZTZEHQ-URXFXBBRSA-N

InChI=1S/C29H35N3O7S2/c1-3-4-7-21(18-37-29(35)32(16-22-8-5-12-40-22)17-23-9-6-13-41-23)30-28(34)31-24(15-27(33)36-2)20-10-11-25-26(14-20)39-19-38-25/h5-6,8-14,21,24H,3-4,7,15-19H2,1-2H3,(H2,30,31,34)/t21-,24-/m0/s1

methyl (3S)-3-(1,3-benzodioxol-5-yl)-3-[[(2S)-1-[bis(thiophen-2-ylmethyl)carbamoyloxy]hexan-2-yl]carbamoylamino]propanoate

THI-0019; THI0019; THI 0019;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。