TRAP-6   中文名称: 凝血酶受体激活肽6

PAR1/rotease activating receptor 1 (IC50 = 96 nM)
Protease-activated receptor 1 (PAR1) [1]

在异源表达PAR1的非洲爪蟾卵母细胞中，TRAP-6（0.01-10 μM）可触发钙动员[1]。TRAP-6（0.01-10 μM）可激活人血小板30分钟[1]。在大鼠或兔中，TRAP-6（100 μM）不会引起血小板聚集、释放颗粒内容物、改变形状或产生血栓素[2]。在异源表达人PAR1的非洲爪蟾卵母细胞中，肽SFLLRN触发钙动员的EC50值比激活PAR4的GYPGQV低约两个数量级。SFLLRN对PAR4没有活性。[1]在人血小板中，SFLLRN（10 μM）可诱导血小板聚集，可通过光透射率的变化来测量。 [1]
- 在室温下，将血小板与 SFLLRN (100 μM) 在前列腺素 E1 存在下预孵育 30 分钟（不搅拌），可使血小板对后续 SFLLRN (500 μM) 的刺激产生耐受性，但不影响其对 PAR4 激活肽 GYPGKF (500 μM) 的反应性。[1]
- SFLLRN 对 PAR1 的脱敏作用显著抑制了血小板对 1 nM 凝血酶的聚集反应，但对 30 nM 凝血酶的聚集反应基本无效（仅略微减缓聚集）。[1]

在肌动蛋白麻醉的大鼠中，TRAP（1 mg/kg；静脉注射）可引起双相血压反应[3]。

大鼠富血小板血浆（PRP）体外血小板聚集实验[3]
雄性大鼠（250–300 g）用硫喷妥钠（100 mg/kg，腹腔注射）麻醉。切开腹部后，暴露主动脉，并用21G多样本真空采血管针在主动脉分叉前方穿刺。将供体血液（9 ml）收集到两个柠檬酸盐真空采血管（含0.5 ml 3.2%柠檬酸钠缓冲液）中。离心（130×g，15分钟）后，取出富血小板血浆，用于2.1.1节所述的聚集实验。在使用氨甲环酸的实验中，血小板在用激动剂刺激前先与氨甲环酸孵育2分钟。为了确定用TRAP预处理是否会导致凝血酶诱导的血小板聚集脱敏，将大鼠富血小板血浆与100 μM TRAP在37°C下孵育5分钟，然后用0.1 U/ml凝血酶进行刺激。

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聚集试验[3]
血小板聚集试验在双通道Chronolog血小板聚集仪中进行。简而言之，将0.48 ml富血小板血浆加入比色皿中，并在37°C下孵育5分钟。通过向血小板中加入人TRAP或大鼠肽（SFFLRN）或凝血酶来启动聚集，然后在IBM计算机上监测5分钟的聚集反应，并借助Aggro/LINK软件通过浊度法确定聚集峰值。

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血小板聚集和分泌测定：使用洗涤后的人血小板。在脱敏研究中，将从第一沉淀中重悬的血小板在室温下与 SFLLRN (100 μM) 和前列腺素 E1 一起孵育 30 分钟，不搅拌，然后离心洗涤。聚集程度通过激动剂处理后透光率的增加来测量。分泌程度通过光聚集法测定 ATP 释放量来测量。[1]
- 非洲爪蟾卵母细胞功能测定：将 25 ng PAR1 cDNA 显微注射到每个卵母细胞中。测量肽触发的 45Ca 释放。数据以相对于基线的倍数增加表示。PAR1 的表面表达使用抗 FLAG 单克隆抗体进行测量。[1]

大鼠体内血压反应[3]
如上所述，对大鼠进行麻醉并准备进行静脉注射。此外，对左侧颈动脉进行插管（PE-50），并使用连接至 Grass 多导生理记录仪的 Statham 压力传感器记录血压。在肾切除大鼠中，进行侧正中切口，分离肾动脉，并用丝线环绕血管以便结扎。经过 30 分钟的平衡期后，进行以下实验之一。

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TRAP 对血压的影响[3]
静脉推注给予赋形剂（0.1 ml 生理盐水）或 TRAP（1 mg/kg），并监测 30 分钟内的血压变化。

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NG-硝基L-精氨酸甲酯 (L-NAME) 对TRAP血压反应的影响 [3]
首先记录TRAP（1 mg/kg，静脉注射）的对照血压反应。待血压恢复至基线水平后，开始静脉输注L-NAME（0.3 mg/kg/min×30 min，溶于生理盐水）。输注25分钟后，再次给予大鼠TRAP（1 mg/kg，静脉注射），并记录血压变化。

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[1]. Protease-activated receptors 1 and 4 mediate activation of human platelets by thrombin. J Clin Invest. 1999 Mar;103(6):879-87.

[2]. Rabbit and rat platelets do not respond to thrombin receptor peptides that activate human platelets. Blood. 1993 Jul 1;82(1):103-6.

[3]. Disparate effects of thrombin receptor activating peptide on platelets and peripheral vasculature in rats. Eur J Pharmacol. 1998 May 22;349(2-3):237-43.

由于凝血酶和血小板在心肌梗死和其他病理过程中发挥着关键作用，因此鉴定和阻断凝血酶激活的血小板受体一直是重要的研究目标。目前已知的凝血酶蛋白酶激活受体（PAR）有三种：PAR1、PAR3 和 PAR4。PAR1 在人血小板中发挥作用，而最近发现的一种 PAR4 激活肽可以激活人血小板，提示 PAR4 也可能在这些细胞中发挥作用。PAR1 和 PAR4 是否是凝血酶激活人血小板的主要机制，或者 PAR3 或其他受体是否也参与其中，目前尚不清楚。我们研究了 PAR1、PAR3 和 PAR4 在血小板中的作用。在人血小板中检测到了 PAR1 和 PAR4 的 mRNA 和蛋白表达。激活其中任何一个受体都足以触发血小板分泌和聚集。单独使用拮抗剂、阻断抗体或脱敏疗法抑制PAR1可阻断1 nM凝血酶诱导的血小板活化，但对30 nM凝血酶诱导的血小板活化仅有轻微抑制作用。单独使用阻断抗体抑制PAR4在两种凝血酶浓度下均无显著影响。值得注意的是，同时抑制PAR1和PAR4几乎完全抑制了血小板分泌和聚集，即使在30 nM凝血酶浓度下也是如此。这些观察结果表明，PAR1和PAR4介导了血小板中大部分（如果不是全部）的凝血酶信号传导，阻断这些受体的拮抗剂可能是一种有效的抗血栓药物。[1]

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人血小板在短至6个氨基酸残基的肽（SFLLRN）的作用下即可聚集，并被诱导释放其颗粒内容物形成血栓素。这些肽段对应于凝血酶裂解后新释放的凝血酶受体的N端。利用洗涤后的血小板，我们发现纤维蛋白原可以增强SFLLRN（2至6 μmol/L）诱导的这些反应。然而，SFLLRN和SFLLRNNPNDKYEPF对洗涤后的兔或大鼠血小板没有影响，尽管它们对人凝血酶完全敏感。浓度高达100 μmol/L的肽段不会诱导兔或大鼠血小板的形态改变、聚集、颗粒内容物释放或血栓素生成。SFLLRN不影响二磷酸腺苷（ADP）或低浓度凝血酶诱导的血小板聚集程度。猪血小板在50 μmol/L SFLLRN刺激下表现出可逆性聚集，这种聚集可被纤维蛋白原增强，但不会引起致密颗粒内容物的释放。豚鼠血小板在25或50 μmol/L SFLLRN刺激下出现聚集和颗粒内容物释放，但在较低浓度SFLLRN刺激下仅出现形态变化。因此，这些实验表明，尽管兔和鼠血小板对人凝血酶有完全反应，但它们对能完全激活先前报道的人凝血酶受体的凝血酶受体肽缺乏功能性反应；猪和豚鼠血小板对这些凝血酶受体肽也无完全反应。结果提示，兔和鼠（或许还有豚鼠和猪）的血小板通过另一种受体对凝血酶产生反应，这种受体也被认为存在于人血小板上。[2]

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在小鼠中评估了凝血酶受体激活肽SFLLRN (TRAP)的血液动力学和血小板效应。TRAP在体外（富血小板血浆）或体内肺微循环中均未能使大鼠血小板聚集。相反，TRAP可使洗涤后的人血小板聚集。在用硫喷妥钠麻醉的大鼠中，静脉注射TRAP（1 mg/kg）可引起血压的双相反应，其特征是初始降压反应（-25 ± 3 mmHg，持续15-30秒）后出现显著升压反应（50 ± 7 mmHg，持续2-3分钟）。血压升高归因于总外周阻力增加，因为心输出量保持不变。此外，在脊髓横断的大鼠中仅观察到升压反应，表明TRAP直接诱导平滑肌收缩。因此，大鼠血小板与人血小板的区别在于，大鼠血小板对TRAP具有抵抗性，而大鼠血管系统对TRAP高度敏感。这些观察结果表明，尽管大鼠血管系统上的凝血酶受体可能与人血小板上的受体相似，但大鼠血小板中的受体和/或偶联机制似乎与人血小板中的不同。[3] SFLLRN 是一种合成肽，模拟凝血酶切割 PAR1 后暴露的新氨基末端的前六个氨基酸。它作为 PAR1 激动剂发挥作用，无需蛋白水解即可激活受体。[1] SFLLRN 对 PAR1 的激活足以触发人血小板的分泌和聚集。[1] SFLLRN 已被用作多种细胞类型中 PAR 功能的药理学探针。 [1]
- 围绕 PAR1 的系链配体序列 SFLLRN 进行的迭代研究，已开发出强效的肽类拮抗剂（例如 BMS200261），这些拮抗剂能够阻断 SFLLRN 本身以及低浓度凝血酶对人血小板的活化作用。[1]

C34H56N10O9

748.88

748.423

C, 54.53; H, 7.54; N, 18.70; O, 19.23

141136-83-6

9831933

Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn; H-Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-OH

SFLLRN; H-SFLLRN-OH

White to off-white solid powder

1.834

334.04

11

11

24

53

1270

6

CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CO)N

HAGOWCONESKMDW-FRSCJGFNSA-N

InChI=1S/C34H56N10O9/c1-18(2)13-23(30(49)40-22(11-8-12-39-34(37)38)29(48)44-26(33(52)53)16-27(36)46)42-31(50)24(14-19(3)4)43-32(51)25(41-28(47)21(35)17-45)15-20-9-6-5-7-10-20/h5-7,9-10,18-19,21-26,45H,8,11-17,35H2,1-4H3,(H2,36,46)(H,40,49)(H,41,47)(H,42,50)(H,43,51)(H,44,48)(H,52,53)(H4,37,38,39)/t21-,22-,23-,24-,25-,26-/m0/s1

L-seryl-L-phenylalanyl-L-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-L-asparagine

TRAP 6; TRAP6; TRAP-6; Thrombin receptor activator peptide 6; Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn; 141136-83-6; L-Seryl-L-phenylalanyl-L-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-L-asparagine; Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn; MFCD00238172; SFLLRN; (2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-4-oxobutanoic acid; SFLLRN; SFLLRN-OH

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~25 mg/mL (~33.38 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。