CDK4 (IC50 = 1 nM); CDK6 (IC50 = 40 nM)
Trilaciclib targets CDK4 and CDK6, two key regulators of the cell cycle. It is a highly potent, selective, and reversible inhibitor that binds to the ATP-binding pocket of these kinases. The compound has IC50 values of 1 nM for CDK4/cyclin D1 and 4 nM for CDK6/cyclin D3. By inhibiting CDK4 and CDK6, trilaciclib prevents the phosphorylation of the retinoblastoma (Rb) protein, thereby blocking the G1-to-S phase transition of the cell cycle. This cell cycle arrest is transient and reversible, allowing hematopoietic stem and progenitor cells to be protected during chemotherapy exposure while tumor cells, which are often dependent on CDK4/6 for proliferation, may also be directly inhibited.

G1T28 是一种高效且特异性的 CDK4/6 抑制剂，它能阻止 RB 蛋白磷酸化，并导致特异性的、可逆的 G1 期阻滞。G1T28 能够保护具有 RB 表达能力的细胞免受化疗诱导的损伤（通过 γH2AX 水平检测）和凋亡，其机制是通过激活 caspase 3/7，无论是在体外还是体内。[1]
体外实验表明，trilaciclib 是一种强效的 CDK4/6 激酶活性抑制剂。它能通过诱导 G1 期细胞周期阻滞，有效抑制多种癌细胞系的增殖。在基于细胞的实验中，该化合物展现出保护造血祖细胞免受化疗药物细胞毒性作用的能力。这种细胞保护作用是其作用机制的关键特征，因为它有助于在化疗期间保护骨髓，从而降低骨髓抑制的发生率。

G1T28 在小鼠和犬骨髓中均以剂量和时间依赖的方式调节造血干细胞/祖细胞 (HSPC) 的增殖。接受 G1T28 预处理的小鼠，其全血细胞计数 (CBC) 可更快地从化疗中恢复。此外，G1T28 不仅不会保护 RB 缺陷型肿瘤免受化疗的影响，反而会增强其抗肿瘤作用。[1]
体内研究表明，trilaciclib 可降低动物模型和临床试验中化疗引起的血液毒性。它能诱导造血干细胞和祖细胞发生强烈的 G1 期细胞周期阻滞，从而保护它们免受化疗的损害。这可降低中性粒细胞减少症、贫血和血小板减少症的严重程度和持续时间。该化合物在化疗前静脉给药。其短效特性使得药物从体内清除后，细胞周期进程能够迅速恢复正常。

Nanosyn CDK体外活性测定[1]
化合物由Nanosyn公司进行CDK2-细胞周期蛋白A、CDK2-细胞周期蛋白E、CDK4-细胞周期蛋白D1、CDK6-细胞周期蛋白D3、CDK5-p25、CDK5-p35、CDK7-细胞周期蛋白H-MAT1和CDK9-细胞周期蛋白T激酶活性测定。该测定采用微流控激酶检测技术完成。化合物在ATP的Km值下，以12点剂量-反应形式进行单次重复测试。磷酸受体底物肽的浓度为1 μmol/L，所有测定均以星形孢菌素作为参考化合物。

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KINOMEscan初筛和Kd测定[1]
G1T28在DiscoveRx公司使用其KINOMEscan和scanMAX筛选技术进行分析。简而言之，G1T28 的测试浓度分别为表 1 中所述的生化 IC50 值的 100 倍和 1000 倍。所有抑制率超过 90% 的靶激酶均作为独立样本进行 Kd 测定。

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HS68、WM2664 和 A2058 细胞的处理包括用 300 nM Trilaciclib (G1T28) 或 0.1% DMSO 处理 4、8、16 或 24 小时。使用 1× HALT 蛋白酶和磷酸酶抑制剂以及 1× 放射免疫沉淀分析缓冲液制备全细胞提取物。根据制造商的说明，使用试剂盒测定总蛋白浓度。蛋白质的制备方法如前所述，用于 Western blot 分析。抗总RB和β-微管蛋白的抗体被用作上样对照[1]。
trilaciclib的体外酶或受体结合（非细胞）测定包括测量其对CDK4和CDK6激酶活性的抑制作用。这些测定使用纯化的重组CDK4/cyclin D1和CDK6/cyclin D3复合物以及肽底物，并在ATP存在下进行。底物的磷酸化采用放射性（例如，33P-ATP）或荧光法进行测定。将化合物与酶和底物在不同浓度下孵育，并测定IC50值。据报道，trilaciclib对CDK4/cyclin D1的IC50值为1 nM，对CDK6/cyclin D3的IC50值为4 nM。

将终浓度分别为 10、30、100、300、1000 或 3000 nM 的 Trilaciclib (G1T28) 应用于 HS68 细胞，持续 24 小时。收集细胞后，将其保存在冰冷的甲醇中。使用 PBS-CMF（不含钙镁）+1% BSA（V 级）、20 μg 碘化丙啶和 50 μg RNA 酶 A 对固定细胞进行染色。使用 Cyan ADP 分析仪[1] 处理样品后，使用软件完成细胞周期分析。

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蛋白质印迹[1]
将 HS68、WM2664 和 A2058 细胞用 300 nmol/L G1T28 或 DMSO (0.1%) 处理 4、8、16 或 24 小时。使用含有 1× HALT 蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 1× 放射免疫沉淀分析缓冲液制备全细胞提取物。根据制造商的说明，使用 BCA 蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。取 15 μg 蛋白，在 70°C 下热变性 10 分钟，然后通过 Novex NuPAGE SDS-PAGE 凝胶系统进行电泳分离，并通过电转印转移至 0.45 μm 硝酸纤维素膜。将膜在 LiCor 膜封闭缓冲液中封闭，并与稀释度为 1:1000 的兔抗 pRb (Ser807/811) 抗体和稀释度为 1:2000 的鼠抗 MAPK 抗体（作为上样对照）在 4℃ 下孵育过夜。二抗为山羊抗兔抗体 (680RD) 和山羊抗小鼠抗体 (800CW)，稀释度为 1:15,000。印迹孵育 1 小时后，洗涤并使用 LiCor ImageStudio 软件（版本 4.0.21）成像。
对于 H69、MCF7、SupT1 和 ZR75-1 的蛋白质印迹分析，蛋白质处理方法如前所述。使用抗总 RB 和 β-微管蛋白抗体作为上样对照。山羊抗兔二抗的稀释度为 1:15,000。

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细胞周期分析[1]
将 HS68 细胞用终浓度为 10、30、100、300、1,000 或 3,000 nmol/L 的 G1T28 处理 24 小时。收集细胞并用冰冷的甲醇固定。固定后的细胞用含 20 μg 碘化丙啶、50 μg RNA酶 A 的 PBS-CMF（不含钙镁）+ 1% BSA V级（Fisher Scientific）溶液染色。样品在 Cyan ADP 分析仪上进行处理，并使用 FlowJo 软件（版本 10.0.8；Tree Star）完成细胞周期分析。

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细胞增殖[1]
将 SupT1、MCF7、ZR-75-1、A2058 和 H69 细胞以每孔 1000 个细胞的密度接种于 Costar 3903 96 孔板中。24 小时后，加入浓度为 10 μmol/L 至 1 nmol/L 的 G1T28，共设置 9 个浓度点。4 天或 6 天后，按照制造商的建议，使用 CellTiter-Glo 试剂盒测定细胞活力。使用 BioTek Synergy2 多功能酶标仪处理孔板，并使用 GraphPad Prism 5 统计软件分析数据。

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γH2AX 和 caspase-3/7 激活[1]
对于 γH2AX 检测，将 30,000 个 HS68 细胞接种于 12 孔板的每个孔中，并在 37°C 下孵育 24 小时。将细胞与 10、30、100、300 或 1,000 nmol/L 的 G1T28 或二甲基亚砜（DMSO，作为溶剂对照）孵育 16 小时。随后，向孔板中加入化疗药物 [5 μmol/L 依托泊苷、1 μmol/L 多柔比星、100 μmol/L 卡铂、156 nmol/L 喜树碱或 250 nmol/L 紫杉醇]。对于γH2AX，在化疗8小时后收集细胞进行分析。按照制造商的说明，使用H2AX磷酸化检测试剂盒固定和染色细胞。使用FACSCalibur流式细胞仪和FlowJo分析软件对γH2AX阳性的HS68细胞进行定量。
对于体外caspase-3/7检测，将HS68、H69和SHP77细胞以每孔1000个细胞的密度接种于Costar 3903 96孔板中。将细胞与10、30、100、300或1000 nmol/L的G1T28或二甲基亚砜（DMSO，作为溶剂对照）孵育16小时。随后，按照先前描述的方法加入化疗药物，并在化疗后48小时直接在孔板中进行分析。使用 Caspase-Glo 3/7 检测系统，并按照制造商推荐的说明，测定 Caspase-3/7 的诱导情况。
体外细胞实验采用造血祖细胞和癌细胞系进行 trilaciclib 的检测。造血祖细胞（例如 CD34+ 细胞）在有或无化疗药物的情况下用该化合物处理。评估细胞活力、凋亡和集落形成能力以评价其细胞保护作用。用该化合物处理癌细胞系以评估其直接抗增殖作用。使用流式细胞术进行细胞周期分析以评估 G1 期阻滞。使用 MTT 或 CCK-8 等标准检测方法测量该化合物对细胞增殖的影响。

小鼠：将H69细胞植入雌性无胸腺裸鼠体内，观察直至开始治疗。当肿瘤大小达到150 mm³时，小鼠每周五天接受不同剂量的曲拉西利（100 mg/kg）和拓扑替康治疗，持续四周。治疗后60天内测量肿瘤大小。若肿瘤负荷在60天内达到过高水平，则对所有小鼠实施安乐死。采用公认的方法处理和检测接受拓扑替康或盐酸曲拉西利治疗的小鼠血浆中拓扑替康和曲拉西利的含量。

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植入H69细胞后，观察雌性无胸腺裸鼠直至开始治疗。当肿瘤足够大（150 mm³）时，小鼠每周五天接受不同剂量的拓扑替康和盐酸曲拉西利（G1T28）治疗，持续四周。治疗后最多进行 60 天的肿瘤测量。如果小鼠的肿瘤负荷在 60 天内过大，则对其进行安乐死。采用既定程序，处理并检测接受拓扑替康或盐酸曲拉西利治疗的小鼠血浆中这两种药物的浓度[1]。

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体外洗脱实验[1]
将 HS68 细胞接种于 60 mm 培养皿中 24 小时后，用终浓度为 300 nmol/L 的 G1T28 处理 24 小时。用 PBS-CMF 洗涤孔板两次，然后更换新鲜培养基。将细胞继续培养至一系列时间点（洗脱后 t = 16、24、40、48 小时）。实验结束后，收集细胞，固定并染色，用于细胞周期分析，方法如前所述。

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G1T28 在小鼠骨髓中的药效学评估[1]
8 周龄雌性 FVB/N 小鼠单次口服赋形剂（20% Solutol，Sigma-Aldrich）或 50、100 或 150 mg/kg 的 G1T28，11 或 23 小时后腹腔注射 100 μg 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷 (EdU)。注射 EdU 1 小时后处死小鼠（即 G1T28 总处理时间为 12 或 24 小时），使用生物素标记的抗小鼠谱系抗体和抗生物素微珠（Miltenyi Biotec）分离谱系阴性细胞 (Lin−)。按照制造商的说明对 Lin− 细胞进行 EdU 染色。

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小鼠外周血中 5-FU 和 G1T28 的分析[1]
FVB/N 雌性小鼠单次口服给予载体或 150 mg/kg 的 G1T28，30 分钟后腹腔注射单剂量 150 mg/kg 的 5-氟尿嘧啶 (5-FU)。从第 6 天开始，每 2 天测量一次血细胞计数 (CBC)。报告的数据来自第 6 天（血小板）、第 10 天 [白细胞 (WBC)、中性粒细胞 (Neu)、淋巴细胞 (Lymph)] 或第 16 天 [红细胞 (RBC)]。

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小鼠骨髓中Caspase-3/7的激活[1]
C57Bl/6雌性小鼠分别单次口服载体、50 mg/kg或100 mg/kg的G1T28，30分钟后腹腔注射2 mg/kg的依托泊苷。治疗6小时后处死小鼠并收集骨髓。按照先前描述的方法，使用每孔100,000个骨髓细胞评估Caspase-3/7的激活。

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G1T28和拓扑替康在RB缺陷型肿瘤中的疗效[1]
将H69细胞植入雌性无胸腺裸鼠体内，并监测直至开始治疗。一旦肿瘤达到可接受的大小（150 mm3），小鼠每周接受5天不同剂量的G1T28和拓扑替康联合治疗，持续4周。治疗后最多60天测量肿瘤大小。所有在60天内肿瘤负荷过重的实验小鼠均被实施安乐死。所有实验方案均已获得IACUC批准，并在南德克萨斯加速研究治疗中心（START）完成。接受G1T28和/或拓扑替康治疗的小鼠血浆中的拓扑替康和G1T28水平由Bioanalytical Systems, Inc.采用既定方法进行处理和分析。
trilaciclib的体内动物实验采用化疗诱导骨髓抑制的小鼠模型进行。小鼠接受化疗药物（如拓扑替康或铂类药物）治疗，部分小鼠事先接受trilaciclib治疗。监测包括白细胞、红细胞和血小板计数在内的血液学参数。评估骨髓细胞密度和祖细胞含量。此外，还在异种移植模型中评估肿瘤生长情况，以确认细胞保护作用不会影响化疗的抗肿瘤疗效。

吸收、分布和排泄
trilaciclib 的 Cmax 和 AUC 与剂量成正比增加。79.1% 的放射性标记剂量从粪便中回收，其中 7% 为未代谢的母体化合物。14% 的放射性标记剂量从尿液中回收，其中 2% 为未代谢的母体化合物。trilaciclib 的稳态分布容积为 1130 L。trilaciclib 的清除率为 158 L/h。代谢/代谢物：trilaciclib 的代谢数据尚不完全清楚，但预计其代谢广泛。生物半衰期：trilaciclib 的平均末端半衰期约为 14 小时。
trilaciclib 的药代动力学 (PK) 特性表现为半衰期短、清除迅速。该化合物的分子量为 446.55，分子式为 C24H30N8O。该化合物微溶于水和二甲基亚砜（DMSO）。该化合物通过静脉注射给药，其药代动力学特征为分布和消除迅速。其半衰期短是该化合物设计的关键特征，可实现短暂的细胞周期阻滞，并在药物清除后迅速恢复细胞正常功能。该粉末在-20°C下可稳定保存长达3年。

肝毒性
在接受细胞毒性化疗的晚期癌症患者中，trilaciclib 的上市前临床试验显示，trilaciclib 组 17% 的患者出现血清 AST 升高，而安慰剂组为 14%。AST 升高通常为自限性且程度较轻；超过正常值上限 (ULN) 5 倍的情况并不常见。概率评分：E（不太可能是造成临床显著肝损伤的原因）。蛋白结合：目前尚无 trilaciclib 蛋白结合的数据。
trilaciclib 的毒理学数据表明，其总体耐受性良好。最常见的不良反应与其作用机制相关，包括疲劳、恶心和头痛。作为一种 CDK4/6 抑制剂，它也可能引起中性粒细胞减少症，尽管其主要目的是减少化疗引起的骨髓抑制。该化合物的短效性和可逆性使其具有良好的安全性。正在进行的临床试验正在评估长期安全性数据。

[1]. Preclinical Characterization of G1T28: A Novel CDK4/6 Inhibitor for Reduction of Chemotherapy-Induced Myelosuppression. Mol Cancer Ther. 2016 May;15(5):783-93.

药效学
Trilaciclib适用于降低广泛期小细胞肺癌患者在接受铂类化疗方案联合依托泊苷或拓扑替康治疗前发生化疗诱导骨髓抑制的概率。其作用持续时间短，约为16小时，且治疗指数窄。应告知患者注射部位反应、超敏反应和间质性肺病的风险。
其他信息：Trilaciclib以商品名Cosela上市。它是一种首创疗法，适用于降低广泛期小细胞肺癌成人患者在接受含铂/依托泊苷方案或含拓扑替康方案治疗前发生化疗诱导骨髓抑制的概率。目前也在研究其在其他类型癌症中保护骨髓和增强免疫系统功能的潜力。该化合物也称为G1T28。

C24H30N8O

446.55

446.254

C, 64.55; H, 6.77; N, 25.09; O, 3.58

1374743-00-6

Trilaciclib hydrochloride;1977495-97-8

68029831

White to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.765

0.87

91.2

2

7

3

33

707

0

N1(CCN(C)CC1)C1C=NC(NC2N=C3C(=CN=2)C=C2C(NCC4(CCCCC4)N23)=O)=CC=1

PDGKHKMBHVFCMG-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H30N8O/c1-30-9-11-31(12-10-30)18-5-6-20(25-15-18)28-23-26-14-17-13-19-22(33)27-16-24(7-3-2-4-8-24)32(19)21(17)29-23/h5-6,13-15H,2-4,7-12,16H2,1H3,(H,27,33)(H,25,26,28,29)

4-[[5-(4-methylpiperazin-1-yl)pyridin-2-yl]amino]spiro[1,3,5,11-tetrazatricyclo[7.4.0.02,7]trideca-2,4,6,8-tetraene-13,1'-cyclohexane]-10-one

G1T-28; G1T28; Trilaciclib; 1374743-00-6; G1T28; 2'-((5-(4-methylpiperazin-1-yl)pyridin-2-yl)amino)-7',8'-dihydro-6'H-spiro[cyclohexane-1,9'-pyrazino[1',2':1,5]pyrrolo[2,3-d]pyrimidin]-6'-one; Trilaciclib [USAN]; U6072DO9XG; UNII-U6072DO9XG; 4-[[5-(4-methylpiperazin-1-yl)pyridin-2-yl]amino]spiro[1,3,5,11-tetrazatricyclo[7.4.0.02,7]trideca-2,4,6,8-tetraene-13,1'-cyclohexane]-10-one; G1T 28; Cosela

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 2~6.8 mg/mL (4.5~15.3 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。