CDK4 (IC50 = 1 nM); CDK6 (IC50 = 40 nM)

G1T28 是一种高效、特异性的 CDK4/6 抑制剂，可防止 RB 被磷酸化并导致排他性、可逆性 G1 停滞。 G1T28 通过在体外和体内激活 caspase 3/7 保护 RB 感受态细胞免受化疗引起的损伤（通过 γH2AX 测量）和凋亡。 [1]

G1T28 在小鼠和犬骨髓中以剂量和时间依赖性方式调节体内 HSPC 增殖。接受 G1T28 预处理的小鼠的全血细胞计数 (CBC) 可以更快地从化疗中恢复。此外，G1T28 并没有保护 RB 缺陷的肿瘤免受化疗的影响，而是增强了抗肿瘤作用。 [1]

Nanosyn CDK体外检测[1]
化合物在Nanosyn，股份有限公司的CDK2-CYCLIN A、CDK2-CYCLIN E、CDK4-CYCLIN D1、CDK6-CYCLIN D3、CDK5-p25、CDK5-p35、CDK7-CYCLEIN H-MAT1和CDK9-CYCLIN T激酶测定中进行测试。使用微流体激酶检测技术完成测定。这些化合物在ATP的Km处以12点剂量反应形式进行了单次测试。使用的磷酸受体底物肽浓度为1μmol/L，星孢菌素用作所有测定的参考化合物。

---

KINOMEscan primary screen和Kd测定[1]
在DiscoveRx使用他们的KINOMEscan和scanMAX筛查技术对G1T28进行了分析。简而言之，G1T28在表1所述的生化IC50的100倍和1000倍下进行测试。所有对90%以上抑制有反应的靶激酶都作为个体进行了Kd测定测试。

---

HS68、WM2664 和 A2058 细胞的处理包括 300 nM Trilaciclib (G1T28) 或 DMSO (0.1%)，持续 4、8、16 或 24 小时。在 1× 放射免疫沉淀测定缓冲液中使用 1× HALT 蛋白酶和磷酸酶抑制剂，制备全细胞提取物。根据制造商的说明，使用该试剂盒测定总蛋白浓度。如前所述，制备蛋白质用于蛋白质印迹分析。针对总 RB 和 β-微管蛋白的抗体作为上样对照进行评估 [1]。

将终浓度为 10、30、100、300、1,000 或 3,000 nM 的 Trilaciclib (G1T28) 应用于 HS68 细胞，持续 24 小时。收获后，细胞保存在冰冷的甲醇中。使用 PBS-CMF（不含钙镁）+1% BSA、Fraction V、20 μg 碘化丙啶和 50 μg RNAse A 对固定细胞进行染色。在 Cyan ADP 分析仪上处理样品后，使用软件完成细胞周期分析[1]。

---

蛋白质印迹[1]
HS68、WM2664和A2058细胞用300 nmol/L G1T28或DMSO（0.1%）处理4、8、16或24小时。使用含有1x HALT蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1倍放射免疫沉淀测定缓冲液制备全细胞提取物。根据制造商的说明，使用双辛可宁酸（BCA）蛋白质检测试剂盒测定总蛋白质浓度。将15微克蛋白质在70°C下热变性10分钟，用Novex NuPAGE SDS-PAGE凝胶系统溶解，并通过电印迹转移到0.45μm硝化纤维膜上。将膜封闭在LiCor膜封闭缓冲液中，并与1:1000稀释的兔抗pRb（Ser807/811）抗体和1:2000稀释的小鼠抗MAPK抗体一起孵育过夜，作为负载对照。第二抗体是山羊抗兔（680RD）和山羊抗小鼠（800CW），稀释度为1:15000。将印迹孵育1小时，洗涤并使用LiCor ImageStudio软件（版本4.0.21）成像。
对于H69、MCF7、SupT1和ZR75-1蛋白质印迹分析，如前所述处理蛋白质。评估了作为负载对照的总RB和β-微管蛋白抗体。使用稀释度为1:15000的山羊抗兔二抗。

---

细胞周期分析[1]
HS68细胞用终浓度为10、30、100、300、1000或3000 nmol/L的G1T28处理24小时。收集细胞并将其固定在冰冷的甲醇中。固定细胞用20μg碘化丙啶、50μg RNA酶A在PBS-CMF（无钙镁）+1%BSA组分V（Fisher Scientific）中染色。在Cyan ADP分析仪上处理样品，并使用FlowJo软件（版本10.0.8；Tree Star）完成细胞周期分析。

---

细胞增殖[1]
SupT1、MCF7、ZR-75-1、A2058和H69细胞以每孔1000个细胞的速度接种在Costar 3903 96孔板上。24小时后，按照制造商的建议，在平板上以10μmol/L至1nmol/L的九点剂量浓度给药G1T28。4或6天后，使用CellTiter-Glo测定法测定细胞存活率。在BioTek Synergy 2多模读板器上处理板，并使用GraphPad Prism 5统计软件分析数据。

---

γH2AX和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7的激活[1]
对于γH2AX测定，每孔将30000个HS68细胞铺在12孔板上，并在37°C下孵育24小时。将细胞与10、30、100、300或1000 nmol/L G1T28或二甲亚砜作为载体对照孵育16小时。随后对平板进行化疗[5μmol/L依托泊苷、1μmol/L阿霉素、100μmol/L卡铂、156 nmol/L喜树碱或250 nmol/L紫杉醇]。对于γH2AX，在暴露于化疗8小时后收获细胞进行分析。按照制造商的说明，使用H2AX磷酸化检测试剂盒固定和染色细胞。使用FACSCalibur流式细胞仪和FlowJo分析软件定量γH2AX阳性HS68细胞。
对于体外胱天蛋白酶-3/7测定，HS68、H69和SHP77细胞以每孔1000个细胞的速度接种在Costar 3903 96孔板上。将细胞与10、30、100、300或1000 nmol/L G1T28或二甲亚砜作为载体对照孵育16小时。随后，如前所述，对钢板进行化疗，并在化疗治疗后48小时直接在钢板中进行分析。按照制造商的建议说明，使用Caspase-Glo 3/7检测系统测量Caspase-3/7诱导。

小鼠：将H69细胞植入雌性无胸腺裸鼠体内，观察直至开始治疗。当肿瘤大小达到150 mm³时，小鼠每周五天接受不同剂量的曲拉西利（100 mg/kg）和拓扑替康治疗，持续四周。治疗后60天内测量肿瘤大小。若肿瘤负荷在60天内达到过高水平，则对所有小鼠实施安乐死。采用公认的方法处理和检测接受拓扑替康或盐酸曲拉西利治疗的小鼠血浆中拓扑替康和曲拉西利的含量。

---

植入H69细胞后，观察雌性无胸腺裸鼠直至开始治疗。当肿瘤足够大（150 mm³）时，小鼠每周五天接受不同剂量的拓扑替康和盐酸曲拉西利（G1T28）治疗，持续四周。治疗后最多进行 60 天的肿瘤测量。如果小鼠的肿瘤负荷在 60 天内过大，则对其进行安乐死。采用既定程序，处理并检测接受拓扑替康或盐酸曲拉西利治疗的小鼠血浆中这两种药物的浓度[1]。

---

体外洗脱实验[1]
将 HS68 细胞接种于 60 mm 培养皿中 24 小时后，用终浓度为 300 nmol/L 的 G1T28 处理 24 小时。用 PBS-CMF 洗涤孔板两次，然后更换新鲜培养基。将细胞继续培养至一系列时间点（洗脱后 t = 16、24、40、48 小时）。实验结束后，收集细胞，固定并染色，用于细胞周期分析，方法如前所述。

---

G1T28 在小鼠骨髓中的药效学评估[1]
8 周龄雌性 FVB/N 小鼠单次口服赋形剂（20% Solutol，Sigma-Aldrich）或 50、100 或 150 mg/kg 的 G1T28，11 或 23 小时后腹腔注射 100 μg 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷 (EdU)。注射 EdU 1 小时后处死小鼠（即 G1T28 总处理时间为 12 或 24 小时），使用生物素标记的抗小鼠谱系抗体和抗生物素微珠（Miltenyi Biotec）分离谱系阴性细胞 (Lin−)。按照制造商的说明对 Lin− 细胞进行 EdU 染色。

---

小鼠外周血中 5-FU 和 G1T28 的分析[1]
FVB/N 雌性小鼠单次口服给予载体或 150 mg/kg 的 G1T28，30 分钟后腹腔注射单剂量 150 mg/kg 的 5-氟尿嘧啶 (5-FU)。从第 6 天开始，每 2 天测量一次血细胞计数 (CBC)。报告的数据来自第 6 天（血小板）、第 10 天 [白细胞 (WBC)、中性粒细胞 (Neu)、淋巴细胞 (Lymph)] 或第 16 天 [红细胞 (RBC)]。

---

小鼠骨髓中Caspase-3/7的激活[1]
C57Bl/6雌性小鼠分别单次口服载体、50 mg/kg或100 mg/kg的G1T28，30分钟后腹腔注射2 mg/kg的依托泊苷。治疗6小时后处死小鼠并收集骨髓。按照先前描述的方法，使用每孔100,000个骨髓细胞评估Caspase-3/7的激活。

---

G1T28和拓扑替康在RB缺陷型肿瘤中的疗效[1]
将H69细胞植入雌性无胸腺裸鼠体内，并监测直至开始治疗。一旦肿瘤达到可接受的大小（150 mm3），小鼠每周接受5天不同剂量的G1T28和拓扑替康联合治疗，持续4周。治疗后最多60天测量肿瘤大小。所有在60天内肿瘤负荷过重的实验小鼠均被实施安乐死。所有实验方案均已获得IACUC批准，并在南德克萨斯加速研究治疗中心（START）完成。接受G1T28和/或拓扑替康治疗的小鼠血浆中的拓扑替康和G1T28水平，由Bioanalytical Systems, Inc.采用既定方法进行处理和分析。

吸收、分布和排泄
trilaciclib 的 Cmax 和 AUC 与剂量成正比增加。
放射性标记剂量的 79.1% 从粪便中回收，其中 7% 为未改变的母体化合物。放射性标记剂量的 14% 从尿液中回收，其中 2% 为未改变的母体化合物。
trilaciclib 的稳态分布容积为 1130 L。
trilaciclib 的清除率为 158 L/h。

---

代谢/代谢物
关于 trilaciclib 代谢的数据尚不明确，但预计其代谢广泛。

---

生物半衰期
trilaciclib 的平均末端半衰期约为 14 小时。

肝毒性
在接受细胞毒性化疗的晚期癌症患者中，trilaciclib 的上市前临床试验显示，trilaciclib 组 17% 的患者出现血清 AST 升高，而安慰剂组为 14%。AST 升高通常为自限性且程度较轻，超过正常值上限 (ULN) 5 倍的情况并不常见，
可能性评分：E（不太可能是临床上明显的肝损伤的原因）。

---

蛋白结合
目前尚无关于 trilaciclib 蛋白结合的数据。

[1]. Preclinical Characterization of G1T28: A Novel CDK4/6 Inhibitor for Reduction of Chemotherapy-Induced Myelosuppression. Mol Cancer Ther. 2016 May;15(5):783-93.

药效学
Trilaciclib适用于降低广泛期小细胞肺癌患者在接受含铂类和依托泊苷或拓扑替康的化疗方案前发生化疗诱导的骨髓抑制的概率。其作用持续时间短，约为16小时，且治疗指数窄。应告知患者注射部位反应、超敏反应和间质性肺病的风险。

C24H30N8O

446.55

446.254

C, 64.55; H, 6.77; N, 25.09; O, 3.58

1374743-00-6

Trilaciclib hydrochloride;1977495-97-8

68029831

White to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.765

0.87

91.2

2

7

3

33

707

0

N1(CCN(C)CC1)C1C=NC(NC2N=C3C(=CN=2)C=C2C(NCC4(CCCCC4)N23)=O)=CC=1

PDGKHKMBHVFCMG-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H30N8O/c1-30-9-11-31(12-10-30)18-5-6-20(25-15-18)28-23-26-14-17-13-19-22(33)27-16-24(7-3-2-4-8-24)32(19)21(17)29-23/h5-6,13-15H,2-4,7-12,16H2,1H3,(H,27,33)(H,25,26,28,29)

4-[[5-(4-methylpiperazin-1-yl)pyridin-2-yl]amino]spiro[1,3,5,11-tetrazatricyclo[7.4.0.02,7]trideca-2,4,6,8-tetraene-13,1'-cyclohexane]-10-one

G1T-28; G1T28; Trilaciclib; 1374743-00-6; G1T28; 2'-((5-(4-methylpiperazin-1-yl)pyridin-2-yl)amino)-7',8'-dihydro-6'H-spiro[cyclohexane-1,9'-pyrazino[1',2':1,5]pyrrolo[2,3-d]pyrimidin]-6'-one; Trilaciclib [USAN]; U6072DO9XG; UNII-U6072DO9XG; 4-[[5-(4-methylpiperazin-1-yl)pyridin-2-yl]amino]spiro[1,3,5,11-tetrazatricyclo[7.4.0.02,7]trideca-2,4,6,8-tetraene-13,1'-cyclohexane]-10-one; G1T 28; Cosela

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 2~6.8 mg/mL (4.5~15.3 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。