Tau protein aggregation (Ki = 0.12 μM)

除了降低 tau 和 p-tau 表达水平外，无色亚甲基蓝（100 nM，48 h）甲磺酸盐还消除了 Aβ25-35 对 β-A 和腺苷 A1R 表达水平的鼓舞作用 [2]。

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TauRx Therapeutics（新加坡，新加坡共和国）正在开发一种稳定的、还原形式的MTC，TRx 0237（LMTX™）。一项体外研究表明，TRx 0237在0.16μM的浓度下具有破坏从AD脑组织分离的PHF的能力。该值与MT（0.16μM）的结果相同[3]。

在两种过表达不同人类tau蛋白构建体的新型小鼠模型（L1和L66）中比较了MTC和TRx 0237（5-75mg/kg口服3-8周）的体内效果。MTC和TRx 0.237在L1的空间问题解决水迷宫任务中剂量依赖性地挽救了学习障碍并恢复了行为灵活性（MTC的最小有效剂量为35mg MT/kg，TRx 0237为9mg MT/kg），在L66的纠正运动学习中剂量依赖于4 mg MT/kg）。这两种化合物都减少了tau反应性神经元的数量，特别是在L1的海马和内嗅皮层，在L66中更为普遍[3]

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在最近完成的测试tau聚集抑制剂隐色甲硫氨酸双（氢氟烷磺酸盐）（LMTM）的3期试验中，我们发现，根据患者是将LMTM作为单一疗法还是作为对症治疗的补充，治疗反应存在显著差异。[4]


方法[4]
我们研究了单独使用LMTM或在LMTM治疗表达构成AD缠结丝的短tau片段的tau转基因小鼠之前使用慢性利凡斯的明的效果。我们测量了乙酰胆碱水平、突触体谷氨酸释放、突触蛋白、线粒体复合物IV活性、tau病理学和胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫反应性。

结果[4]
单独给予LMTM可增加海马乙酰胆碱（ACh）水平、突触体制剂中谷氨酸的释放、多个脑区突触素水平和线粒体复合物IV活性，减少tau病理，部分恢复基底前脑的ChAT免疫反应性，并逆转空间学习缺陷。除了减少tau聚集病理外，发现利凡斯的明慢性预处理可以减少或消除几乎所有这些影响。LMTM对野生型小鼠海马ACh和突触素水平的影响也降低了。

结论[4]
胆碱酯酶抑制剂对LMTM药理活性的干扰可以在tau转基因小鼠模型中复制，在较小程度上也可以在野生型小鼠中复制。长期使用有症状的药物进行预处理会改变不同递质系统和细胞隔室在多个脑功能水平上对LMTM的广泛脑反应。因此，负相互作用没有单一的位点。相反，胆碱酯酶功能降低引起的慢性神经元激活在多个神经元系统中产生代偿性稳态下调。这减少了与tau聚集病理减少相关的LMTM的广泛治疗反应。由于干扰是由对先前对症治疗的稳态反应决定的，因此无论预期的治疗靶点或作用方式如何，作为现有对症治疗的附加药物，很可能会对其他测试药物产生类似的干扰。目前的研究结果概述了关键结果，这些结果现在提供了一个工作模型来解释对症治疗的干扰。

蛋白质印迹分析[2]
细胞类型：人类 SH-SY5Y 细胞系。
测试浓度：100 nM。
孵化持续时间：48小时。
实验结果： Aβ25-35和TRx 0237共同处理显着逆转了Aβ25-35对tau、p-tau、orexin A和腺苷A1R表达的促进作用。

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SH-SY5Y细胞用或不用tau抑制剂TRx 0237处理。SH-SY5Y细胞被分为阴性对照（SH-SY5Y）和Aβ25-35（SH-SI5Y+Aβ25-35）或TRx 0237（SH-SY-Aβ25-35+TRx 0237]。将SH-SY5Y细胞（1×105个细胞/孔）接种在6孔板中，用载体Aβ25-35或TRx 0237转染48小时。使用前，将Aβ25-35,在无菌生理盐水中稀释至0.5mM的浓度，并在37°C下保持7天，以对肽进行预老化（24）。将老化的Aβ溶液稀释至40µM以供使用[2]。

样本批次处理[1]
提取样本分批次处理，每批次包含六个校准标准品（10.0 至 20,000 ng/mL）、质控样品、提取物储存稳定性样品和对照（空白）样品。处理后，每个标准品被分成两份，一份在每次分析运行的开始，另一份在运行的结束。每次运行共处理 48 个样本/标准品。每个动物样本的分析准备包括两次独立的提取，一次提取用于定量排泄的亚甲蓝，另一次提取用于定量亚甲蓝/TRx 0237。为了制备用于提取亚甲蓝的样本，将 200 μL 1M NaCl 溶液和 100 μL 碱性蓝 3 内标溶液加入到 0.5 mL 尿液的聚丙烯管中。轻轻涡旋混合管内溶液。向每个试管中加入4 mL 1,2-二氯乙烷，振荡15分钟后，用台式离心机离心5分钟。用聚乙烯移液管将1,2-二氯乙烷层转移至一个干净的4 mL聚丙烯小瓶中，并用Savant Speedvac样品浓缩仪（中温）蒸干。向每个小瓶中加入200 μL 0.1%三氟乙酸溶液和100 μL乙腈，超声处理6分钟后，转移至聚丙烯自动进样器小瓶内衬中。随后进行第二次萃取，以去除样品中的亚甲基蓝/TRx 0237（亚甲基蓝转化为亚甲基蓝后）。为了将亚甲基蓝还原为亚甲基蓝，向试管中加入1001 μL 1N HCl溶液。将试管浸入沸水中20分钟，然后冷却至室温。将氧化生成的亚甲基蓝提取出来，并采用与原始样品提取相同的方法进行分析制备。

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海马乙酰胆碱测定[4]
动物在接受利伐斯的明（0.5 mg/kg/天，皮下注射Alzet微型泵）治疗2周后，再接受LMTM（双（氢甲磺酸盐）亮氨酸甲硫铵）（5 mg/kg/天，灌胃，持续2周）治疗。通过植入式微透析探针和细胞外液高效液相色谱分析（HPLC）测定海马中乙酰胆碱（ACh）的水平。实验结束后，取出脑组织，进行组织学评估，以确认插管位置正确。

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用于研究对症治疗与LMTM之间负相互作用的治疗方案旨在模拟临床情况，即受试者在接受LMTM治疗前，首先长期接受胆碱酯酶抑制剂或美金刚治疗（图1）。在每日灌胃给予赋形剂或利伐斯的明5周后，进行联合治疗。部分组接受了LMTM单药治疗，而其他组仅接受了LMTM单药治疗。[4]

野生型和L1雌性小鼠（每组n=7-16）预先接受利伐斯的明（0.1或0.5 mg/kg/天）或载体灌胃治疗5周。在接下来的6周内，在上述每日治疗方案中加入LMTM（5和15 mg/kg），同样通过灌胃给药（图1）。随后处死动物，进行免疫组织化学和其他组织分析，具体方法见文献[36]。虽然小鼠5 mg/kg/天的剂量在血浆中母体MT的Cmax水平上约相当于人类8 mg/天，但该剂量已接近对病理和行为产生影响的阈值。通常需要更高的剂量15 mg/kg/天才能使LMTM在L1小鼠模型中完全有效。这可能与MT在小鼠体内的半衰期短得多有关。小鼠（4 小时）与人类（老年人 37 小时）相比。

据称，TRx0237 的药代动力学和耐受性优于 MTC，但目前尚无令人信服的证据支持这一说法。在健康志愿者中，食物存在下 TRx0237 的口服吸收优于 MTC，但这一结果并未转化为更高的中枢神经系统药物浓度，因为在小型猪中，给予 33 mg/kg（约 5 μM）的 MT 或 TRx0237 后，二者脑内药物浓度几乎相同。另一方面，目前尚无关于 TRx0237 在人体脑脊液中浓度的相关数据。也缺乏关于 TRx0237 在人体中的安全性和耐受性的可靠数据，因此无法将其与 MTC 进行直接比较。体外对比数据显示，LMT-二氢溴酸盐的治疗指数（LD50/EC50 比值）为 92，LMT-二氢甲磺酸盐的治疗指数为 179，而 MTC 的治疗指数为 110。我们认为，这些体外差异并不显著，不足以转化为药理学或临床上的差异。就疗效而言，转基因小鼠 tau 蛋白病模型的药理学研究并未显示两种化合物之间存在显著差异。事实上，45 mg/kg 剂量的 MTC 或 TRx0237 产生了相同的行为效应。[3]

一项针对9名轻度至中度阿尔茨海默病患者的TRx0237（250 mg/天，持续4周）安全性和耐受性研究于2012年9月启动，但于2013年4月终止，据报道是由于行政原因（ClinicalTrials.gov 注册号：NCT01626391）（表1）。目前有三项TRx0237的III期安慰剂对照研究正在进行中（表1）。第一项研究正在评估200 mg/天的剂量对700名被诊断为全因痴呆或可能患有阿尔茨海默病的患者的影响，并采用认知功能ADAS-Cog 11量表和临床阿尔茨海默病合作研究-临床总体印象变化量表（ADCS-CGIC）作为主要疗效指标（ClinicalTrials.gov 注册号：NCT01689233）。第二项研究正在评估每日150毫克和250毫克剂量对833名轻度至中度阿尔茨海默病患者的疗效，并以ADAS-Cog 11和ADCS-CGIC作为主要终点（ClinicalTrials.gov注册号：NCT01689246）。第三项III期临床试验正在评估每日200毫克剂量对220名行为变异型额颞叶痴呆（bvFTD）患者的疗效（ClinicalTrials.gov注册号：NCT01626378）。该试验采用改良版ADCS-CGIC量表作为临床疗效指标，并采用修订版阿登布鲁克认知检查量表作为认知功能指标。最后，一项针对已完成 TRx0237 II 期或 III 期临床试验的受试者的开放标签扩展研究正在评估该化合物的长期安全性（ClinicalTrials.gov 注册号：NCT02245568）（表 1）。为了保持盲法，III 期临床试验使用了含有 4 mg TRx0237 作为尿液和粪便着色剂的“活性安慰剂”片剂。总体而言，这些 III 期临床试验正在 22 个国家的 250 个中心招募 1753 名患者，其中一项试验（ClinicalTrials.gov 注册号：NCT01689246）预计将于 2016 年上半年公布结果，另外两项试验（ClinicalTrials.gov 注册号：NCT01689233 和 NCT01626378）预计将于 2016 年下半年公布结果。[3]

[1]. Determination of methylene blue and leucomethylene blue in male and female Fischer 344 rat urine andB6C3F1 mouse urine. J Anal Toxicol. 2005 Jan-Feb;29(1):28-33.

[2]. Amyloid β and tau are involved in sleep disorder in Alzheimer's disease by orexin A and adenosine A(1) receptor. Int J Mol Med. 2019 Jan;43(1):435-442.

[3]. Tau aggregation inhibitors: the future of Alzheimer's pharmacotherapy? Expert Opin Pharmacother. 2016;17(4):457-61.

[4]. Mechanisms of Anticholinesterase Interference with Tau Aggregation Inhibitor Activity in a Tau-Transgenic Mouse Model. Curr Alzheimer Res. 2020 Mar;17(3):285–296.

甲磺酸氢甲基硫氨酸是一种小分子药物，目前已完成最多III期临床试验（涵盖所有适应症），并有2个在研适应症。

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本研究开发了一种液相色谱法，用于测定雄性和雌性Fischer 344大鼠尿液以及雄性和雌性B6C3F1小鼠尿液中的亚甲蓝和无色亚甲蓝，以支持毒代动力学研究。该方法经过验证，并用于分析尿液样本，以进行初步剂量范围探索研究。该方法在尿液中浓度范围为10.0至20,000 ng/mL时得到验证。浓度高达75,000 ng/mL的样本在稀释至校准曲线范围内时，回收率良好。为验证方法的重现性和耐用性，制备了六组F344雄性大鼠尿液校准标准品。在不同的储存条件下测定了样品提取物的稳定性。在动物样本分析过程中，观察到可能存在的代谢过程。尽管亚甲蓝三水合物中含有大量杂质，但从服用亚甲蓝三水合物的啮齿动物尿液样本中检测到的亚甲蓝B含量显著高于直接添加亚甲蓝的啮齿动物尿液样本。这一观察结果提示亚甲蓝可能通过N-去甲基化代谢转化为亚甲蓝B。[1]睡眠障碍已被证实是阿尔茨海默病（AD）的核心组成部分，而脑组织中β淀粉样蛋白（Aβ）的积累是AD的重要病理特征。然而，Aβ如何影响AD相关的睡眠障碍尚不清楚。本研究利用动物和细胞模型进行实验，以检测睡眠障碍与Aβ之间的关联。结果发现，给予Aβ25-35可显著减少小鼠的非快速眼动睡眠，同时增加其觉醒时间。此外，逆转录-定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹分析显示，与对照组小鼠相比，AD小鼠脑组织中tau蛋白、磷酸化tau蛋白（p-tau）、食欲素A和食欲素神经元表达的腺苷A1受体（A1R）的表达水平显著上调。此外，体外研究表明，与对照组细胞相比，Aβ25-35处理的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中tau蛋白、p-tau蛋白、食欲素A和腺苷A1R的表达水平也显著升高。此外，tau蛋白抑制剂TRx 0237显著逆转了Aβ25-35对tau蛋白、p-tau蛋白、食欲素A和腺苷A1R表达水平的促进作用，而腺苷A1R或食欲素A的敲低也抑制了Aβ25-35介导的AD中tau蛋白和p-tau蛋白的表达水平。这些结果表明，Aβ和tau蛋白可能被视为阿尔茨海默病（AD）病理中睡眠障碍的新型生物标志物，它们通过调节食欲素A和腺苷A1R的表达水平发挥作用。[2]

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在过去的十年中，多项抗Aβ药物的临床试验均以失败告终，这挑战了Aβ积累是AD病理级联反应起始事件的假设，并凸显了开发新型治疗方法和靶点的必要性。在TAI类药物中，MT属于二氨基吩噻嗪类化合物，该类化合物在体外具有TAI活性。MTC（MT以氧化形式MT+给药）在一项探索性II期双盲剂量范围临床试验中进行了研究，该试验纳入了321名轻度至中度AD患者。在24周时，临床和分子影像学终点均显示，MT的最低有效剂量为138 mg/天。研究发现，该剂量治疗可预防局部脑血流量下降，尤其是在内侧颞叶结构和颞顶叶区域。由于MT最高剂量的递送受到剂量依赖性溶解和吸收限制的影响，因此需要进行四项I期研究和两项临床前体外及体内研究，以彻底解决II期试验中测试的MT形式的生物利用度限制，从而为TRx0237用于AD治疗的III期试验奠定基础。据称TRx0237的药代动力学和耐受性优于MTC，但尚未提供令人信服的证据支持这一说法。在健康志愿者中，与MTC相比，TRx0237在进食后具有更好的口服吸收，但这并未转化为更高的中枢神经系统药物浓度，因为在小型猪中，给予33 mg/kg（约5 μM）的MT或TRx0237后，脑内药物浓度几乎相同。另一方面，目前尚无关于TRx0237在人体脑脊液中浓度的相关数据。也缺乏关于TRx0237在人体中安全性和耐受性的可靠数据，因此无法与MTC进行直接比较。体外对比数据显示，LMT-二氢溴酸盐的治疗指数（LD50/EC50比值）为92，LMT-二氢甲磺酸盐的治疗指数为179，而MTC的治疗指数为110。我们认为，这些体外差异并不显著，不足以转化为药理学或临床上的差异。在疗效方面，转基因小鼠tau蛋白病模型的药理学研究并未显示两种化合物之间存在显著差异。事实上，45 mg/kg剂量的MTC或TRx0237产生了相同的行为学效应[3]。

C16H21BR2N3S

447.233

444.982

C, 42.97; H, 4.73; Br, 35.73; N, 9.40; S, 7.17

951131-15-0

613-11-6;1236208-20-0 (mesylate);61-73-4 (chloride);951131-15-0 (HBr);

23651551

Solid powder

43.8

3

4

2

22

304

0

Br.Br.S1C2C=C(C=CC=2NC2C=CC(=CC1=2)N(C)C)N(C)C

JAUPSVVTGFBHTN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H19N3S.2BrH/c1-18(2)11-5-7-13-15(9-11)20-16-10-12(19(3)4)6-8-14(16)17-13/h5-10,17H,1-4H32*1H

N3,N3,N7,N7-Tetramethyl-10H-phenothiazine-3,7-diamine dihydrobromide

TRX-0237; Leucomethylene Blue dihydrobromide; TRX-0237 dihydrobromide; TRX0237; TRX 0237; 951131-15-0; Leucomethylene Blue dihydrobromide; TRx0237; E79ZM68IOZ; Leukomethylene Blue dihydrobromide; Hydromethylthionine (dihydrobromide); Reduced methylene Blue dihydrobromide; N3,N3,N7,N7-Tetramethyl-10H-phenothiazine-3,7-diamine dihydrobromide; TRX-0237 HBr; Leukomethylene Blue dihydrobromide; Reduced methylene Blue dihydrobromide; Hydromethylthionine HBr

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。