UBP302

GLUK5 (Kd = 402 nM); AMPA receptors (IC50 = 106 μM)
UBP302 is a potent and selective competitive antagonist of kainate receptors, with highest affinity for GluK1-containing receptors (K_i = 0.20 ± 0.03 μM in [³H]kainate binding assays). It exhibits >100-fold selectivity over AMPA receptors (GluA2 K_i > 100 μM) and NMDA receptors [1]

由于发现UBP296是背根上最有效的拮抗剂，因此尝试合成该化合物的S对映体。获得了一小部分纯对映体样品UBP302。正如预测的那样，UBP302比UBP296更有效，拮抗背根上的红藻氨酸反应，表观KD值为402±45 nM。[1]

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S对映体44a/UBP302对天然GLUK5红藻氨酸受体具有主要的拮抗活性，而R对映体44b被发现是无活性的。此外，44b对天然AMPA和大鼠GLUK6受体无活性。
当在背根上的红藻氨酸受体上测试25、38c和44a/UBP302的5-碘类似物时，观察到效力增加。因此，45是本研究中最有效的GLUK5受体拮抗剂，是44a的两倍。化合物39、44a/UBP302和45在HEK293细胞膜中对大鼠GLUK6的[3H]红藻氨酸置换结合试验中未能抑制结合，表明它们对GLUK5和GLUK6具有选择性。此外，在天然AMPA受体的测定中，45只具有微弱的活性，因此对含有红藻氨酸的天然GLUK5与AMPA受体显示出约350倍的选择性（见表1）。对于这一系列拮抗剂，AMPA和GLUK5受体之间的选择性转换在5-碘取代时不如在威拉定激动剂中观察到的那样明显，例如威拉定的5-碘取代导致GLUK5.7d选择性的大幅波动，8这种差异可能是由于配体结合核心的开放和封闭构象之间的结合袋的显著重塑，这从X射线晶体结构中可以明显看出。
本研究中鉴定的GLUK5受体拮抗剂（38a、44a/UBP302和45）比之前描述的十氢异喹啉拮抗剂4和5更有效和更具选择性。此外，45的效力与6相当，6是迄今为止报道的最有效的GLUK5受体拮抗剂。如果冷冻储存，45的单钠盐溶液至少可以稳定一周，并且在体外电生理实验中使用时没有任何分解。我们尚未确定如果全身给药，45是否会稳定[2]。

接触神经毒剂会导致癫痫持续状态（SE）延长，导致脑损伤或死亡。地西泮（DZP）是目前美国食品和药物管理局批准的用于停止神经毒剂诱导的SE的药物。在这里，我们比较了DZP与UBP302[（S）-3-（2-羧基苄基）威拉定；一种含有GluK1亚基的红藻氨酸受体拮抗剂]对梭曼诱导的大鼠癫痫发作、神经病理学和行为缺陷的疗效。暴露后1小时或2小时服用DZP，终止了SE，但癫痫发作复发；因此，梭曼暴露后24小时内SE的总持续时间与未接受抗惊厥药的梭曼暴露大鼠相似（1小时的DZP）或长于（2小时的DZP）。与DZP相比，UBP302以较慢的时间进程停止SE，但显著缩短了24小时内SE的总持续时间。在暴露后1小时接受抗惊厥治疗的组中评估神经病理学和行为。UBP302，而不是DZP，减少了许多脑区的神经元退化，以及基底外侧杏仁核和CA1海马区的神经元损失，并防止了基底外侧杏仁核的中间神经元损失。在开阔场地和梭曼暴露后30天的声惊吓反应中评估焦虑样行为。结果显示，DZP治疗组和未接受抗惊厥治疗组的焦虑样行为有所增加，但UBP302治疗组没有。研究结果反对使用DZP治疗神经毒剂诱导的癫痫发作和脑损伤，并表明靶向含GluK1的受体是一种更有效的方法[3]。

采用 [³H]红藻氨酸对大鼠前脑突触膜进行放射性配体结合实验。将膜与 UBP302 (0.1 nM-100 μM) 和 15 nM [³H]红藻氨酸在 Tris-HCl 缓冲液 (50 mM, pH 7.4) 中于 4°C 孵育 60 分钟。通过 GF/B 滤膜真空抽滤分离结合配体，冰缓冲液洗涤后经液体闪烁计数定量测定 K_i 值 [1]

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电生理学。[2]
AMPA受体拮抗剂降低fDR VRP。根据报道的方法制备并使用由颈椎脱位杀死的非巢式1至5天大鼠的半切脊髓。36为了评估AMPA受体拮抗剂的活性，如前所述，测量了化合物在新生大鼠半切脊髓制备中阻断背根诱发腹根电位（fDR VRP）快速成分的能力。11在2 mM MgSO4/50μM（R）-2-氨基-5-膦酰基戊酸（R）-AP5（预孵育30分钟）存在下，构建了测试拮抗剂（5分钟应用）的浓度反应曲线，以阻断NMDA受体。结果以平均值±SEM表示，n=3。在用于测量fDR VRP的整个实验中，还记录了一条缓慢的轨迹，显示了腹根电位的直流偏移。在该痕迹上观察到的去极化表明受试化合物具有激动剂活性。

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新型威拉定衍生物拮抗Kainate对背根C纤维的反应。[2]
如前所述，在红藻氨酸诱导的离体新生大鼠背根反应中，方便地进行了测试含红藻氨酸受体的新型化合物在GLUK5上的拮抗作用的实验。11为了防止红藻氨酸感受器脱敏，在暴露于无葡萄糖灌流培养基20分钟后，用1 mg mL-1刀豆球蛋白A40对背根进行20分钟的灌流。然后在整个实验过程中应用标准的灌流介质。这允许测量外源性激动剂红藻氨酸（施用1分钟）引起的去极化。在拮抗剂存在和不存在的情况下（预孵育30分钟），构建了红藻氨酸的非累积、非连续浓度-反应曲线。

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海马切片的电生理学。[2]
如前所述，细胞外fEPSPs记录在海马脑片的CA3区。11 EPSPs是通过放置在齿状回的电极对苔藓纤维通路进行低频刺激而诱发的。在6至10周龄大鼠的切片中进行了苔藓纤维LTP研究，在NMDA受体拮抗剂（R）-AP5存在的情况下，通过以100 Hz的测试强度进行100次电击来诱导LTP。

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天然AMPA和Kainate受体结合试验。[2]
从雄性Wistar大鼠（250-300g）制备无小脑脑膜制剂。使用0.4 mg/mL蛋白质、增加新化合物浓度以及10 nM[3H]-9或5 nM[3H]SYM2081（[3H]-48）进行结合试验，具体取决于是否研究了AMPA或红藻氨酸受体的选择性。混合物在4°C下孵育40分钟。在1 mM（S）-谷氨酸盐存在下定义非特异性结合。通过使用Brandell细胞采集器用测定缓冲液（50mM Tris-HCl/100mM KCl，pH 7.4）洗涤来去除未结合的放射性配体。使用Wallac闪烁计数器评估结合配体。在GraphPad Prism中构建了每种化合物的浓度-抑制曲线，并得出了IC50值。Ki值使用Cheng-Prussoff方程计算。

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HEK293细胞中重组表达的大鼠GLUK6 Kainate受体结合试验。[2]
对于放射性配体结合研究，使用Lipofectamine 2000用GLUK6 DNA转染HEK293细胞，然后在2天后收获膜，如前所述。11在10 nM[3H]红藻氨酸存在的情况下进行置换放射性配体结合的研究，非特异性结合定义为未被100μM红藻氨酸置换的结合。在10μM、100μM和1 mM的浓度下测试了新化合物，以初步指示其亲和力。生成标准红藻氨酸受体配体（S）-谷氨酸（1）和46的竞争结合曲线，并使用GraphPAD Prism通过迭代非线性回归进行分析。

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[3H]GLUK7的Kainate置换试验。[2]
膜制备。将稳定转染有人GLUK7红藻氨酸受体的粘附HEK293细胞解冻，在10倍体积的冰冷蒸馏水中裂解，并在40000g下离心30分钟。将所得颗粒重新悬浮在>100倍体积的测定缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4）中，并再次在40000g下离心以去除内源性谷氨酸。将所得颗粒重新悬浮在4mL测定缓冲液中，并进行[3H]红藻氨酸结合实验。

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[3H]Kainate置换试验。[2]
在含有125μg膜蛋白、7nM[3H]红藻氨酸、不同浓度的测试化合物和最终体积为200μL的测定缓冲液的硼硅酸盐管中，38a或47抑制了[3H]红藻氨酸的结合。非特异性结合由10mM谷氨酸定义（1）。在4°C下孵育2小时，并通过预浸在0.03%聚乙烯亚胺中的Whatman GF/B过滤器进行快速过滤 终止。用2mL冷测定缓冲液洗涤过滤器3次，并使用液体闪烁计数器测量过滤器上保留的放射性。采用BCA法测定蛋白质。使用GraphPad Prism 3.02（加利福尼亚州圣地亚哥）分析竞争结合曲线，斜率因子设置为1，顶部和底部分别固定为对照[3H]红藻氨酸结合的100%和0%。根据Cheng-Prusoff方程计算试验化合物的离解常数（Ki）。 [3H]Kainate与这些细胞的膜结合，KD=5.3±0.8 nM，Bmax=3.0±0.1 pmol/mg，这是在相同条件下进行的饱和结合实验确定的。

在稳定表达人 GluK1 受体的 HEK293 细胞上进行全细胞电压钳记录。细胞用含 UBP302 (0.01-100 μM) 的细胞外液灌流 60 秒，随后与红藻氨酸 (30 μM) 共处理。在 -70 mV 保持电位下测量电流以生成浓度抑制曲线 [1]

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使用重组人AMPA和Kainate受体亚型进行钙荧光分析。[2]
AMPA受体测定。在60℃的实验前1或2天，将稳定表达人AMPA受体的HEK293细胞接种到聚-d-赖氨酸涂覆的96孔板中 000 细胞/孔（1天）或30个 000 细胞/孔（2天）。用100μL的测定缓冲液洗涤细胞3次，该缓冲液由不含酚红的Hanks平衡盐溶液组成，添加了20 mM HEPES和3.7 mM CaCl2（最终[CaCl2]=5 mM）。然后将板在室温下在含有8μM Fluo3 AM染料的40μL测定缓冲液中孵育2-3小时。染料孵育后，用100μL测定缓冲液冲洗细胞一次。最后，向孔中加入50μL的测定缓冲液，其中包括AMPA受体增效剂LY392098（10μM；用于防止AMPA受体脱敏），并使用荧光成像板读数器测量荧光。FLIPR首先加入50μL含LY392098的测定缓冲液，3分钟后再次加入100μL含LY392098缓冲液。38a是在第一次添加时没有激动剂的情况下添加的，在第二次添加时有100μM谷氨酸盐（1）的情况下加入的。

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Kainate受体测定。[2]
所有受体克隆在HEK293细胞中稳定表达。GLUK5（Q）/GLUK2细胞系是通过使用pMNLZRS/IB逆转录病毒表达载体将编码人GLUK2亚基的cDNA逆转录病毒感染到表达GLUK5的细胞系中而创建的。先前已经描述了稳定表达克隆的GLUK5（Q）37或GLUK6（Q）受体亚基38或共表达GLUK5和GLUK6的HEK293细胞系。之前已经通过[3H]红藻氨酸与完整细胞的饱和结合来确定所有转染细胞系的红藻氨酸受体表达水平。特定[3H]红藻氨酸结合的Bmax值如下：  GLUK5（Q）1.7±0.5 pmol/mg；GLUK5（R）/6（Q），8±2 pmol/mg；GLUK5（Q）/GLUK2，0.6±0.1 pmol/mg；GLUK6（Q），2.7±0.3 pmol/mg；GLUK6（Q）/GLUK2，1.7±0.3 pmol/mg。
在刀豆蛋白a.11存在的情况下，使用荧光成像板读数器进行细胞生长和离子流入研究。在第一次添加时，在没有激动剂的情况下添加拮抗剂38a，在第二次添加时添加100μM谷氨酸。使用GraphPad Prism 3.02软件分析38a的浓度-响应曲线，斜率因子固定为1，顶部和底部分别固定为100%和0%抑制。根据Cheng-Prusoff方程，根据抑制100μM谷氨酸诱导的钙内流的IC50值计算解离常数（Kb）：
其中[Glu]是谷氨酸（1）（100μM）和EC50的浓度 Glu是谷氨酸在给定细胞系中引发钙内流的EC50值，由与38a浓度反应曲线在同一平板上运行的谷氨酸浓度反应曲线确定。

索曼给药及药物治疗。[3]
将索曼（频哪醇甲基膦酰氟化物）溶于冷生理盐水中，单次皮下注射（154 µg/kg，约为LD50的1.4倍；Jimmerson等，1989）给7至8周龄的大鼠。为提高存活率，在索曼暴露前30分钟，给大鼠腹腔注射HI-6 [1-(2-羟亚氨基甲基吡啶鎓)-3-(4-氨基甲酰基吡啶鎓)-2-氧杂丙烷二氯化物；125 mg/kg]。HI-6是一种双吡啶肟，可重新激活被抑制的乙酰胆碱酯酶（AChE），主要作用于外周（Bajgar，2005）。大鼠暴露于梭曼后1分钟内，同时肌注硫酸阿托品（2 mg/kg；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯），以最大程度地减少外周毒性作用。暴露于梭曼的大鼠被随机分为三组：一组未接受任何后续治疗（除肟类药物预处理和阿托品注射外；梭曼组），一组在暴露于梭曼1小时后肌注地西泮（10 mg/kg；梭曼+地西泮组），以及一组在暴露于梭曼1小时后腹腔注射UBP302（250 mg/kg；梭曼+UBP302组）。部分暴露于梭曼的大鼠在暴露前10天已植入脑电图监测电极（植入步骤见下文）。在植入电极的大鼠中，部分大鼠在暴露于梭曼后1小时或2小时分别接受了DZP或UBP302（剂量与上述相同）的给药；因此，对于植入电极的大鼠，共分为两组梭曼+DZP组和两组梭曼+UBP302组（分别对应两个抗惊厥治疗时间点；样本量见结果部分）。对照组动物接受了HI-6和阿托品的治疗，但注射的是生理盐水而非梭曼（对照组）。对于梭曼+UBP302组，由于之前没有全身注射UBP302的研究，我们只能根据自身的观察结果来确定剂量。首先，我们测试了100 mg/kg的剂量；该浓度可以抑制癫痫发作，但起效非常缓慢（超过3小时才能终止癫痫活动）。在对对照组大鼠（未暴露于梭曼的大鼠）也测试了该浓度后，我们最终确定了250 mg/kg的剂量。与地西泮（DZP）即使在 10 mg/kg 的剂量下也能产生镇静作用不同，给予对照组大鼠 250 mg/kg 的 UBP302 仅导致其总体活动量轻微下降。

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行为学实验。[3]
在给予索曼 30 天后，分别对索曼组、索曼 + 地西泮组、索曼 + UBP302 组和对照组的动物进行旷场实验和声惊吓实验。在旷场实验装置（40 × 40 × 30 cm 透明有机玻璃实验箱）中，按照先前描述的方法（Aroniadou-Anderjaska 等，2012；Prager 等，2014）评估焦虑样行为，并遵循 Faraday 等（2001）的实验程序。在测试前一天（索曼暴露后第 29 天），动物在实验装置中适应 20 分钟。在测试当天，将大鼠置于开放场地中央，使用Accuscan Electronics红外光电系统测量并记录其20分钟的活动情况。数据自动采集并传输至装有“Fusion”软件的计算机。分析的运动量（以厘米为单位的行进距离）、总运动时间和在开放场地中央停留的时间。焦虑行为以在中央停留时间占总运动时间的百分比来衡量。受试大鼠在暴露后第29天进行适应性训练，并在第二天进行测试。

脑室内注射UBP302（50 nmol）未引起对照组大鼠出现明显的神经毒性，Fluoro-Jade B染色结果显示，神经元损伤评分分别为0.3 ± 0.1和0.2 ± 0.1（评分范围0-4）[3]

[1]. Characterisation of UBP296: a novel, potent and selective kainate receptor antagonist. Neuropharmacology. 2004 Jul;47(1):46-64.

[2]. Synthesis and pharmacology of willardiine derivatives acting as antagonists of kainate receptors. J Med Chem. 2005 Dec 1;48(24):7867-81.

[3]. The limitations of diazepam as a treatment for nerve agent-induced seizures and neuropathology in rats: comparison with UBP302. J Pharmacol Exp Ther. 2014 Nov;351(2):359-72.

为了制备选择性拮抗含GLUK5亚基的红藻氨酸受体的药物，我们合成了一系列带有酸性基团的N3-苄基取代基的威拉地因衍生物。研究发现，UBP296是脊髓中天然含GLUK5亚基的红藻氨酸受体的强效选择性拮抗剂，其活性主要来源于S对映体（UBP302）。在表达人红藻氨酸受体亚基的细胞中，UBP296选择性地抑制了谷氨酸诱导的、含有同源或异源GLUK5亚基的细胞的钙离子内流。放射性配体置换结合实验表明，威拉地因类似物能够置换[3H]红藻氨酸与大鼠GLUK6、GLUK2或GLUK6/GLUK2的结合，IC50值均大于100 μM。利用拮抗剂结合形式的GLUK5和GLUK6的同源模型，解释了UBP296对GLUK5的选择性。在大鼠海马切片中，UBP296在低于直接影响AMPA受体介导的突触传递阈值的浓度下，可逆地阻断了ATPA诱导的突触传递抑制。在含有2 mM（而非4 mM）Ca2+的培养基中，UBP296也完全阻断了苔藓纤维长时程增强（LTP）的诱导。这些数据进一步证实了含GLUK5的红藻氨酸受体在苔藓纤维LTP中的作用。总之，UBP296是迄今为止报道的最有效且选择性最高的含GLUK5红藻氨酸受体拮抗剂。[1]

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天然产物willardiine (8)是AMPA受体激动剂，而5-碘willardiine (10)是选择性红藻氨酸受体激动剂。为了制备红藻氨酸受体和AMPA受体的拮抗剂，我们合成了在尿嘧啶环N3位带有取代基的willardiine类似物。结果表明，N3-4-羧基苄基取代的类似物(38c)对新生大鼠脊髓中的AMPA受体和含GLUK5亚基的红藻氨酸受体具有相同的拮抗活性。N3-2-羧基苄基取代的类似物(38a)在天然大鼠和人重组AMPA和红藻氨酸受体亚型上均表现出强效且选择性的GLUK5亚基红藻氨酸受体拮抗活性。GLUK5红藻氨酸受体拮抗活性主要存在于S对映体(UBP302/44a)中，而R对映体(44b)几乎没有活性。化合物 44a 的尿嘧啶环 5-碘取代得到化合物 45，发现其对 GLUK5 的效力和选择性均有所提高。[2] 一系列新型 N3-取代的威拉地因类似物已被证实是红藻氨酸受体和/或 AMPA 受体拮抗剂。化合物 27 和 38c 是中等效力的 AMPA 受体拮抗剂，但这两个化合物对含 GLUK5 的红藻氨酸受体的拮抗作用也相似。更重要的是，化合物 38a、UBP302/44a 和 45 是强效且选择性的 GLUK5 受体拮抗剂。这三种化合物有望作为药理学工具，用于研究含 GLUK5 的红藻氨酸受体的生理和病理生理作用。事实上，化合物 38a 和 44a 已被用于证实含 GLUK5 的红藻氨酸受体在苔藓纤维长时程增强 (LTP) 中的作用。[2]

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神经毒剂暴露引起的癫痫发作需要医疗干预，否则可能导致严重的脑损伤甚至死亡。地西泮 (DZP) 是目前美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准的治疗神经毒剂诱发癫痫的药物。本研究表明，如果在暴露于梭曼后 1 小时给予大鼠 DZP，癫痫发作可有效终止，但很快复发，导致暴露后 24 小时内癫痫持续状态 (SE) 的总持续时间与未接受抗惊厥药物治疗的梭曼暴露大鼠的 SE 总持续时间无显著差异。此外，如果在暴露于梭曼后 2 小时给予 DZP，则接受 DZP 治疗的大鼠的 SE 总持续时间长于未接受抗惊厥药物治疗的大鼠。地西泮（DZP）治疗后癫痫复发的后果在神经病理学分析和行为学测试中均有体现。因此，除暴露后30天海马CA1区退化神经元数量较少外，地西泮治疗并未对神经元退化和死亡提供任何保护作用。相比之下，使用GluK1拮抗剂UBP302治疗可缩短暴露后24小时内癫痫持续状态（SE）的总持续时间，并保护大多数受检脑区免受神经元损伤。焦虑测试也显示，UBP302（而非地西泮治疗）可预防梭曼暴露后30天焦虑样行为的增加。[3]

C15H15N3O6

333.2961

333.096

C, 54.05; H, 4.54; N, 12.61; O, 28.80

745055-91-8

6420161

White to off-white solid powder

-3.2

144.62

3

7

6

24

576

1

C1=CC=C(C(=C1)CN2C(=O)C=CN(C2=O)C[C@@H](C(=O)O)N)C(=O)O

UUIYULWYHDSXHL-NSHDSACASA-N

InChI=1S/C15H15N3O6/c16-11(14(22)23)8-17-6-5-12(19)18(15(17)24)7-9-3-1-2-4-10(9)13(20)21/h1-6,11H,7-8,16H2,(H,20,21)(H,22,23)/t11-/m0/s1

2-[[3-[(2S)-2-amino-2-carboxyethyl]-2,6-dioxopyrimidin-1-yl]methyl]benzoic acid

2-({3-[(2S)-2-amino-2-carboxyethyl]-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahydropyrimidin-1-yl}methyl)benzoic acid; (alphaS)-alpha-Amino-3-[(2-carboxyphenyl)methyl]-3,4-dihydro-2,4-dioxo-1(2H)-pyrimidinepropanoic acid; (alphaS)-alpha-Amino-3-((2-carboxyphenyl)methyl)-3,4-dihydro-2,4-dioxo-1(2H)-pyrimidinepropanoic acid; 2-((3-((2S)-2-amino-2-carboxyethyl)-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahydropyrimidin-1-yl)methyl)benzoic acid; 684-600-3; UBP 302; 745055-91-8; UBP-302;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。