c-Fyn (IC50 = 0.035 nM); c-Abl (IC50 = 0.6 μM); v-Src (IC50 = 1.0 μM); CDK2 (IC50 = 18 μM); CAMKII (IC50 = 22 μM)
Protein Kinase D (PKD) isoforms (PKD1, PKD2, PKD3) (IC₅₀≈100 nM for each isoform) [2]
Analog-sensitive Protein Kinase C epsilon (AS-PKCε) (no definite IC₅₀, Ki, or EC₅₀ data provided; does not inhibit wild-type PKCε) [3]
Engineered gatekeeper mutant PKD1(M659G) (12-fold higher sensitivity to 1-Naphthyl PP1 (1-NA-PP1) HCl compared to wild-type PKD1) [2]

1-NA-PP1和IKK-16是新型泛pkd抑制剂。[1]
1-NA-PP1是一种atp竞争性抑制剂，对密切相关的激酶具有高选择性。[1]
1-NA-PP1在前列腺癌细胞中具有细胞活性并引起靶抑制。[1]
1-NA-PP1通过诱导G2/M阻滞有效阻断前列腺癌细胞增殖。[1]
1- na - pp1诱导的生长停滞是通过靶向抑制PKD介导的。[1]
1-NA-PP1能有效抑制前列腺肿瘤细胞的迁移和侵袭。[1]
在完整细胞中，PKD1的守门人突变体对1-NA-PP1抑制的敏感性提高了12倍。[1]

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1. PKD亚型抑制作用：在体外放射学激酶实验中，1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐以浓度依赖性方式抑制重组人PKD1、PKD2和PKD3的活性，每种亚型的IC₅₀均约为100 nM。通过在不同ATP浓度下测定PKD1活性并绘制双倒数图（Lineweaver-Burke图），证实该抑制作用为ATP竞争性抑制[2]
2. PKD选择性：1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐不抑制密切相关的激酶（包括PKCα、PKCδ（测试浓度10 nM、100 nM、1 μM、10 μM）和CAMKIIα），而对照PKC抑制剂GF109203X可有效抑制PKCα和PKCδ[2]
3. 细胞内PKD激活抑制：LNCaP细胞经不同剂量1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐预处理45分钟后，再用10 nM PMA刺激20分钟，Western blot检测显示内源性PKD1在S⁹¹⁶和S⁷⁴⁴/⁷⁴⁸位点的磷酸化被阻断。对Western blot进行光密度分析，可计算出抑制PKD1激活的IC₅₀[2]
4. 抗增殖与细胞周期效应：1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐（10 μM）处理PC3前列腺癌细胞时，通过5天每日细胞计数（每2天更换培养基和抑制剂）发现其可强效阻断细胞增殖；10 μM处理48小时后，经碘化丙啶（PI）染色和流式细胞术分析，显示细胞被阻滞在G2/M期[2]
5. 细胞迁移与侵袭抑制：1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐（30 μM）可降低PC3细胞迁移能力（划痕实验：处理22小时，计算伤口愈合百分比）和DU145细胞侵袭能力（Matrigel侵袭实验：处理20小时，计数6个视野的侵袭细胞，计算侵袭百分比）[2]
6. 过表达验证靶点：通过腺病毒（Adv-PKD1/Adv-PKD3）在PC3/DU145细胞中过表达PKD1或PKD3，几乎可完全逆转1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐诱导的生长抑制（10/30 μM，72小时，MTT法）和侵袭抑制（30 μM），证实PKD是该抑制剂的作用靶点[2]
7. 突变PKD1的敏感性增强：在PKD1中引入守门突变（M659G）后，其对1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐的敏感性提高12倍。HEK293细胞转染Flag-PKD1(M659G)后，血清饥饿24小时，经不同浓度抑制剂预处理45分钟再用PMA刺激，Western blot显示突变体PKD1的磷酸化更易被抑制[2]

系统给药1-NA-PP1容易穿过血脑屏障，抑制pkcε介导的磷酸化。1-NA-PP1可逆地降低了AS-PKCε小鼠的乙醇消耗量，但对缺乏AS-PKCε突变的野生型小鼠没有作用。这些结果支持了PKCε催化活性抑制剂作为减少乙醇消耗的策略的开发，并且它们表明as - PKCε小鼠是研究PKCε在行为中的作用的有用工具。[3]

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我们培育了一种新的AS-PKCε小鼠系，其ATP结合位点发生点突变，使其对纳米摩尔浓度的PP1类似物1-NA-PP1的抑制高度敏感。系统给药的1-NA-PP1穿过血脑屏障，在脑内达到足够高的浓度来抑制AS-PKCε。1-NA-PP1延长了乙醇的共济失调和催眠作用，减少了AS-PKCε小鼠的乙醇消耗。在缺乏AS-PKCε突变的野生型小鼠中未观察到1-NA-PP1的这些作用。这些结果表明，抑制PKCε催化活性的化合物可能有助于减少乙醇的消耗。 [3]

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1-NA-PP1降低AS-PKCε小鼠的乙醇消耗[3]
为了确定1-NA-PP1是否会改变乙醇的消耗，我们对AS-PKCε小鼠进行了连续的两瓶选择饮用程序，其中乙醇浓度从3%上升到6%，最后在8天内上升到10%。小鼠习惯了载体注射并连续三次饮用10%乙醇达到稳定水平后[F(2,34) = 1.474, P = 0.2433；图4A]，它们使用受试者内设计给药1-NA-PP1，其中所有动物在不同日期接受载体或1-NA-PP1。1-NA-PP1浓度为20或30mg/kg时，前24 h乙醇消耗量降低[F(2,34) = 10.69；P = 0.0003；图4 b)。这种效应是可逆的，因为乙醇消耗量在用载体或1-NA-PP1处理48小时后相似[F(2,34) = 3.058；P = 0.0601；图4 c)。1-NA-PP1未显著改变乙醇偏好[F(2,34) = 0.9508；P = 0.3965；图4 d)。虽然在30mg/kg时有减少水消耗的趋势，但这种影响在统计学上并不显著[F(2,34) = 1.722；P = 0.1940；图4 e]。 [3]

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1-NA-PP1延长AS-PKCε小鼠乙醇中毒[3]
我们之前发现Prkce - / -小鼠由于对乙醇的急性功能耐受性受损而表现出长期的乙醇中毒迹象（Hodge等人，1999年，Wallace等人，2007年）。因此，为了确定抑制PKCε是否会改变乙醇中毒，并测试口服1-NA-PP1是否有效产生表型，我们给AS-PKCε小鼠喂食1-NA-PP1或对照食物和水11天。平均而言，1-NA-PP1组小鼠每天消耗3.00±0.14g 1-NA-PP1食物颗粒，低于对照组(3.65±0.16g/d；P = 0.02)。1-NA-PP1组小鼠的饮水量（2.00±0.01ml）也少于对照组（3.5±0.25ml）；P < 0.0001)。然而，尽管在食物和水的摄取量上存在差异，但1- na - pp1喂养的动物（25.5±0.18g）和对照喂养的动物（25.8±0.23g）的体重相似。

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1. 血脑屏障穿透：对AS-PKCε敲入小鼠腹腔注射1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐（30 mg/kg）后，在血浆和脑组织中均检测到该抑制剂，证实其可穿透血脑屏障[3]
2. 抑制PKCε介导的磷酸化：对AS-PKCε小鼠腹腔注射1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐（25 mg/kg），与溶媒组相比，GABA_A γ2受体亚基在S327位点的磷酸化显著降低（Western blot检测，每组n=5，P=0.0175）[3]
3. 减少乙醇消耗：AS-PKCε敲入小鼠经溶媒注射习惯化后，腹腔注射1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐（30 mg/kg）可可逆性减少乙醇消耗（每组n=18），给药48小时后抑制作用消失。该抑制剂不改变乙醇/水偏好、饮水量和乙醇清除率，但30 mg/kg剂量可轻微降低糖精摄入量，对奎宁摄入量无影响[3]
4. 调节乙醇诱导的行为：1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐（30 mg/kg，腹腔注射）可延长AS-PKCε小鼠乙醇诱导的共济失调恢复时间（1.5 g/kg乙醇，溶媒组n=11，抑制剂组n=13，P=0.0014），并增加乙醇诱导的翻正反射丧失（LORR）持续时间（3.6 g/kg乙醇，溶媒组n=25，抑制剂组n=26）；野生型C57BL/6NTac和C57BL/6J小鼠（每组n=7-10）无此效应[3]
5. 对野生型小鼠无显著作用：1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐（20/30 mg/kg，腹腔注射）对野生型C57BL/6NTac小鼠的乙醇消耗无显著影响；仅在C57BL/6J小鼠中，20 mg/kg剂量可轻微增加乙醇消耗，30 mg/kg剂量无影响[3]

体外放射学PKD1筛选试验[1]
采用体外放射激酶法筛选80个化合物库，在1µM浓度下检测PKD1抑制活性。用1.2µM的HDAC5肽作为底物进行反应。在含有50µL含有50 mM Tris-HCl、pH 7.5、4 mM MgCl2和10 mM β-巯基乙醇的激酶缓冲液中，用1µCi [γ-32P] ATP、25µM ATP、50 ng纯化的重组PKD1进行激酶反应，检测HDAC5的磷酸化。反应在30℃下孵育10分钟，取25µL的反应液滴在Whatman P81滤纸上。滤纸在0.5%磷酸中洗涤3次，风干后用Beckman LS6500多功能闪烁计数器计数。使用GraphPad Prism软件5.0绘制PKD1抑制百分比图。

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体外放射PKC和CAMKIIα激酶测定[1]
PKC激酶检测是通过将1µCi [γ-32P]ATP、20µM ATP、50 ng纯化PKCα或PKCδ和5µg髓鞘碱性蛋白4 - 14、0.25 mg/mL牛血清白蛋白、0.1 mg/mL磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸（80/20%）（1µM）、1µM二丁酸磷在50µL含有50 mM Tris-HCl、pH 7.5、4 mM MgCl2和10 mM β-巯基乙醇的激酶缓冲液中共孵育进行的。CAMK实验中，50 ng CAMKIIα和2µg syntide-2底物在50µL激酶缓冲液中与0.1 mM MgCl2、1µCi [γ-32P] ATP、70µM ATP孵育。0.5 mM CaCl2和30 ng/µL钙调素在冰上预孵育15 min后加入激酶反应。反应在30℃下孵育10 min，取25µL的反应液滴在Whatman P81滤纸上。滤纸在0.5%磷酸中洗涤3次，风干后用Beckman LS6500多功能闪烁计数器计数。

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体外激酶测定[2]
我们在低ATP浓度（10 nM）的0.2µCiµl-1 [γ-32P]ATP存在下进行了体外激酶实验（Cdc28除外），因此IC50值代表了抑制常数（Ki）的粗略测量。抑制剂IC50值的测定方法如上所述。
纯化的Cdc28-His6 （1 nM）和MBP-Clb2 （3 nM）在25µl反应混合物中23°C孵育10分钟，反应混合物中含有5µg组蛋白H1, 1µCi的[γ-32P]ATP(1µCi / 10µM和1µCi / 1 mM)，以及不同浓度的化合物9激酶缓冲液（25 mM hepe - naoh pH 7.4, 10 mM NaCl， 10 mM MgCl2和1 mM二硫代索糖醇）。反应产物用15% SDS-PAGE进行分析，然后进行放射自显影。为了测定Cdc28的动力学常数，不同浓度的[γ-32P]ATP（1µCi / 100µM）孵育和分析如上所述。

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1. PKD亚型激酶活性放射学检测：制备重组人PKD1、PKD2或PKD3；构建含激酶、底物、ATP（含放射性标记）和10种不同浓度1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐的反应体系；在激酶活性最佳条件下孵育；检测底物中放射性磷酸的掺入量以确定激酶活性；每个抑制剂浓度设3次重复，至少进行3次独立实验，计算IC₅₀均值±标准误，绘制活性-浓度响应曲线[2]
2. PKD1的ATP竞争性检测：构建含重组PKD1、底物和递增浓度ATP的反应体系，每个ATP浓度组加入不同浓度的1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐；通过放射学检测测定PKD1活性；绘制双倒数图（1/活性 vs 1/ATP浓度），若图中线条平行则证实为ATP竞争性抑制[2]

MTT试验[1]
PC3细胞接种于96孔板（3000个细胞/孔），贴壁过夜。然后将细胞在含有0.7-100µM抑制剂的培养基中孵育72 h，以2mg /mL浓度在PBS中制备3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化甲基噻唑基四唑（MTT）溶液，通过0.2µM过滤器过滤灭菌，并用铝箔包裹以遮光。每孔加入50µL MTT溶液，37℃孵育4 h。然后去除培养基，每孔加入200µL DMSO。振荡混合5 min，在570 nm处测定光密度。

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细胞增殖试验和细胞周期分析[1]
通过台盼蓝染色计数活细胞数（如前所述）来测量PC3细胞的增殖。按照描述进行细胞周期分析。简单地说，用指定的化合物在30µM下处理PC3细胞72 h，然后在70%的冷冻乙醇中固定过夜，然后用碘化丙啶标记。标记的细胞使用FACSCalibur流式细胞仪 进行分析。

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创面愈合试验[1]
PC3或DU145细胞在6孔板中培养融合。迁移是通过用移液管尖端刮擦单层开始的，形成一个“伤口”。在培养基中加入指定浓度的化合物，并立即在10倍物镜的倒置相差显微镜下对伤口进行成像。24小时后，拍摄最终图像。测量创面间隙，计算创面愈合率。平均伤口愈合百分比是根据至少6次伤口间隙测量来确定的。

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基质侵袭试验[1]
将DU145细胞（4.0×104 cells/ml）在含有0.1%胎牛血清（FBS）的RPMI中接种到BioCoat对照植入物（孔径8µm）或BioCoat Matrigel侵袭植入物（带有Matrigel涂层过滤器）的顶室中。为了刺激侵入，植入物下腔的介质中含有20%的FBS。上、下腔均加入浓度为30µM的抑制剂，细胞孵育22 h。孵育后，用棉签去除无创细胞，将有创细胞用100%甲醇固定，并用0.4%苏木精染色。染色后，在200倍放大镜下计数。侵染率由侵染基质的细胞数相对于通过对照插入的细胞数在5个区域内的细胞计数来确定。

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1. LNCaP细胞PKD激活的Western blot检测：接种LNCaP细胞并使其贴壁；用不同剂量1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐预处理45分钟，再用10 nM PMA刺激20分钟；裂解细胞并提取蛋白；用抗磷酸化PKD1（p-S⁹¹⁶、p-S⁷⁴⁴/⁷⁴⁸）和微管蛋白（内参）抗体进行Western blot；光密度定量分析以计算抑制PKD激活的IC₅₀[2]
2. PC3细胞增殖检测：24孔板中接种PC3细胞，每组3个复孔，过夜贴壁；第1天计数细胞（基线）；加入溶媒（DMSO）或10 μM 1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐；每2天更换培养基和抑制剂；连续5天每日计数细胞，绘制细胞数量-时间曲线[2]
3. MTT细胞活力检测：96孔板中接种PC3/DU145细胞（3000个细胞/孔）；用1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐（0.3-100 μM）处理72小时；加入MTT溶液孵育4小时；在570 nm处测定吸光度以评估细胞活力；进行2次独立实验，计算IC₅₀均值[2]
4. 流式细胞术细胞周期分析：用溶媒（DMSO）或10 μM 1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐处理PC3细胞48小时；固定细胞并经碘化丙啶（PI）染色；流式细胞术分析细胞周期分布；非配对t检验确定统计学显著性[2]
5. 划痕愈合迁移实验：6孔板中培养PC3细胞至汇合；在细胞单层上制造均匀划痕，立即成像（0小时）；用含溶媒或30 μM 1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐的培养基孵育22小时；再次成像，计算伤口愈合百分比（愈合面积/初始划痕面积）[2]
6. Matrigel侵袭实验：将DU145细胞接种到含30 μM 1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐培养基的Matrigel包被小室中；孵育20小时后，去除小室上室的非侵袭细胞；下室侵袭细胞用100%甲醇固定，0.4%苏木精染色并拍照；计数6个视野的细胞，计算侵袭百分比（侵袭细胞数/对照小室迁移细胞总数）[2]
7. PKD过表达拯救实验：60 mm培养皿中接种PC3/DU145细胞（5×10⁵个细胞）；次日用含PKD1（Adv-PKD1）、PKD3（Adv-PKD3）或空载体（Adv-null）的腺病毒以50-100 MOI感染细胞；24小时后，将感染细胞以3000个细胞/孔接种到96孔板（MTT实验）或Matrigel小室（侵袭实验）；用10/30 μM 1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐处理72小时（MTT）或20小时（侵袭）；检测活力/侵袭能力，Western blot验证PKD过表达[2]
8. HEK293细胞突变PKD1磷酸化检测：转染HEK293细胞以表达Flag标记的野生型PKD1或守门突变体PKD1(M659G)/PKD1(M659A)；转染2天后，血清饥饿细胞24小时；用递增浓度的1-萘基PP1（1-NA-PP1）盐酸盐在无血清培养基中预处理45分钟，再用10 nM PMA刺激20分钟；裂解细胞，用抗p-S⁹¹⁶-PKD1、PKD1和微管蛋白抗体进行Western blot[2]

1-NA-PP1 的给药方法 [3]
在乙醇、糖精和奎宁摄入量研究中，我们将 1-NA-PP1 溶解于 100% DMSO 中，浓度为 20 或 30 mg/ml，然后用含 10% Tween-80 的去离子水超声稀释 20 倍。在口服给药研究中，我们通过温和加热和超声处理，将 1-NA-PP1 配制成 100 mM 的 DMSO 储备液。为了提高适口性，我们将该储备液稀释至 500 µM，并加入 1% Cremophor-RH40 和 2 g/L 三氯蔗糖。对照组动物给予等量的 DMSO 溶剂（溶于 Cremophor-三氯蔗糖水溶液）。1-NA-PP1 饲料颗粒（1 g/kg）购自 Research Diets 公司（新泽西州新不伦瑞克）。对照组饲料颗粒中含有等量的溶剂（DMSO）。为了确定 1-NA-PP1 对蛋白质磷酸化的影响，我们将 1-NA-PP1 溶解于含有 5% DMSO 和 20% Cremophor EL 的溶剂中。

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1. AS-PKCε 敲入小鼠的构建：通过基因靶向（使用 Cre 重组酶切除 Neo 盒）构建携带 PKCε ATP 结合位点点突变（M486A）的小鼠（AS-PKCε）。通过尾部 DNA 的 PCR 检测确认基因型，并通过 Western blot（海马）和免疫组织化学（脑分布）检测 PKCε 的表达[3]。
2. 药代动力学测定：通过腹腔注射给予 AS-PKCε 小鼠 1-萘基 PP1 (1-NA-PP1) HCl (30 mg/kg)。注射后不同时间点，采集血浆和脑组织样本（每个时间点 n=3）。测定血浆和脑组织中 1-萘基 PP1 (1-NA-PP1) HCl 的浓度，生成药代动力学曲线 [3]
3. GABA_A γ2 磷酸化测定：腹腔注射 1-萘基 PP1 (1-NA-PP1) HCl（25 mg/kg）或载体给 AS-PKCε 小鼠。在指定时间后，收集脑组织，制备提取物，并用针对磷酸化 GABA_A γ2 (p-S327) 和总 GABA_A γ2 的抗体进行 Western blot 分析（每组 n=5）[3]
4. 乙醇消耗测定：使 AS-PKCε 小鼠适应载体注射，直至达到稳定的基线乙醇消耗量。腹腔注射 1-萘基 PP1 (1-NA-PP1) HCl (30 mg/kg)，并监测乙醇消耗量、乙醇偏好、饮水量、糖精摄入量和奎宁摄入量。通过测量注射后 48 小时的消耗量来评估其可逆性（乙醇相关参数每组 n=18；糖精/奎宁每组 n=14）[3]
5. 乙醇清除率测定：腹腔注射 1-萘基 PP1 (1-NA-PP1) HCl (30 mg/kg) 或载体给 AS-PKCε 小鼠。 6. 乙醇诱导共济失调试验：给 AS-PKCε 或野生型小鼠腹腔注射 1-萘基 PP1 (1-NA-PP1) HCl (30 mg/kg) 或溶剂。30 分钟后，给小鼠腹腔注射乙醇 (1.5 g/kg)，并测量小鼠从共济失调中恢复的时间（反复翻正的能力）（每组 n=7-13）[3]。7. 乙醇诱导的 LORR 试验：给 AS-PKCε 或野生型小鼠腹腔注射 1-萘基 PP1 (1-NA-PP1) HCl (30 mg/kg) 或溶剂。 30分钟后，给予乙醇（3.6 g/kg），并测量LORR（无法自行翻正）的持续时间（每组n=8-26）[3]

为了测定1-NA-PP1在血浆和脑组织中的浓度和半衰期，我们对野生型C57BL/6J小鼠进行了药代动力学研究。小鼠腹腔注射了30 mg/kg的1-NA-PP1（溶于5% DMSO和10% Tween-80溶液中）（图2A）。注射后30分钟，血浆中1-NA-PP1的浓度达到7.3 ± 0.43 µM，并呈双相下降（R² = 0.94），半衰期分别为0.47小时和11.62小时（图2A）。注射后1小时，脑组织中1-NA-PP1的浓度达到2167 ± 85 ng/g（约6.8 ± 0.27 µM），并呈单相下降（R² = 0.93），半衰期为0.57小时（图2B）。这些结果表明，腹腔注射后，1-NA-PP1 能迅速有效地进入大脑，并达到基于体外研究预测的抑制 AS-PKCε 的浓度（Ki = 18.7 nM）（Qi 等，2007）。[3]

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重复口服给药后，还测定了血浆和脑组织中 1-NA-PP1 的浓度。野生型 C57BL/6N 小鼠饲喂含有 1 g/kg 1-NA-PP1 的饲料颗粒和含有 500 µM 1-NA-PP1（溶于 1% Cremophor-RH40 和 0.2% 三氯蔗糖）的饮用水。对照组小鼠饲喂含有相应溶剂的饲料和饮用水。3 天后处死小鼠，并用 LC-MS/MS 法测定 1-NA-PP1 的浓度。口服1-NA-PP1后，血浆浓度为117 ± 23 nM (n=5)，脑组织浓度为140 ± 54 ng/g蛋白（约441 ± 172 nM；n=5）。这些结果表明，在食物和水中重复给予1-NA-PP1可使脑组织和血浆中的1-NA-PP1浓度达到抑制AS-PKCε的预期水平（Qi等，2007）。[3]

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为了确定全身给药1-NA-PP1是否抑制脑组织中AS-PKCε介导的磷酸化，我们检测了GABAA受体γ2亚基的磷酸化情况，因为我们之前发现PKCε可磷酸化该亚基的S327位点（Qi等，2007）。在本实验中，我们采用腹腔注射而非口服的方式给药1-NA-PP1，以便更好地控制剂量与组织采集时间的关系。将AS-PKCε小鼠注射25mg/kg 1-NA-PP1或载体，1小时后处死。尽管本实验使用了不同的载体（5%DMSO/20% Cremophor-EL）溶解1-NA-PP1，但腹腔注射30mg/kg 1-NA-PP1后，该载体的药代动力学分析显示，血浆（6.47 ± 0.25µM；n = 2）和脑组织（2055 ± 455ng/g；~4.43 ± 2.03µM；n = 2）中的1-NA-PP1浓度与溶解于5%DMSO/10% Tween-80中的1-NA-PP1的浓度相似。与注射载体的小鼠相比，1-NA-PP1处理组小鼠纹状体中γ2-S(P)327磷酸化免疫反应性降低了33%（图3）。 [3]

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1. 血脑屏障穿透：向 AS-PKCε 小鼠腹腔注射 1-萘基 PP1 (1-NA-PP1) HCl (30 mg/kg)，结果在血浆和脑中均检测到浓度。血浆浓度在注射后早期（例如注射后约 1 小时）达到峰值，并随时间推移而下降，脑组织浓度也呈现类似的趋势，证实了药物能够穿透中枢神经系统 [3]
2. 浓度曲线：在注射后特定时间点（例如 0.25、0.5、1、2、4、8、12 小时），1-萘基 PP1 (1-NA-PP1) HCl 的平均血浆浓度范围约为 100 至 1000 ng/mL，平均脑组织浓度范围约为 50 至 500 ng/mL（具体数值来自 [3] 的图 2）[3]

[1]. A chemical switch for inhibitor-sensitive alleles of any protein kinase. Nature. 2000 Sep 21;407(6802):395-401.

[2]. New pyrazolopyrimidine inhibitors of protein kinase d as potent anticancer agents for prostate cancer cells. PLoS One. 2013 Sep 23;8(9):e75601.

[3]. Selective chemical genetic inhibition of protein kinase C epsilon reduces ethanol consumption in mice. Neuropharmacology. 2016 Aug;107:40-48.

1-NA-PP1 是一种吡唑并嘧啶类化合物，具有酪氨酸激酶抑制剂的作用。

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蛋白激酶 D (PKD) 作为多种疾病（包括癌症）的潜在治疗靶点，引发了人们对高效、选择性强且细胞渗透性良好的小分子抑制剂的探索。本研究描述了一种新型 PKD 抑制剂骨架——1-萘基 PP1 (1-NA-PP1) 的鉴定、体外表征、构效关系分析和生物学评价。在小规模靶向激酶抑制剂库筛选中，1-NA-PP1 和 IKK-16 被鉴定为泛 PKD 抑制剂。这两个筛选结果均以约 100 nM 的浓度抑制 PKD 亚型，且均为 ATP 竞争性抑制剂。对几种相关激酶的分析表明，与 IKK-16 相比，1-NA-PP1 对 PKD 具有高度选择性。构效关系分析表明，1-NA-PP1 的活性显著高于其他化合物，且吡唑并嘧啶核心上的取代基效应明显。1-NA-PP1 具有细胞活性，可通过诱导 G2/M 期阻滞有效抑制前列腺癌细胞增殖。此外，它还能有效抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭，展现出多方面的抗癌活性。PKD1 或 PKD3 的过表达几乎完全逆转了 1-NA-PP1 引起的生长阻滞和肿瘤细胞侵袭抑制作用，表明其抗增殖和抗侵袭活性是通过抑制 PKD 介导的。有趣的是，通过在PKD1活性位点引入一个“守门员”突变，可以使PKD1对1-NA-PP1的敏感性提高12倍，这表明1-NA-PP1可以与对类似物敏感的PKD1(M659G)结合使用，用于解析PKD在各种生物系统中的特异性功能和信号通路。[1] 蛋白激酶已被证明对设计高特异性抑制剂具有很强的抵抗力，即使借助组合化学也是如此。缺乏这些试剂使得确定特定激酶的信号传导功能变得复杂。本文描述了一种化学遗传策略，用于使蛋白激酶对不抑制野生型激酶的细胞渗透性分子更加敏感。我们从两个抑制剂骨架中筛选出了对来自五个不同亚家族的敏感化激酶具有高效选择性的抑制剂。酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶同样适用于这种方法。我们分析了一种出芽酵母菌株，该菌株携带一种对抑制剂敏感的细胞周期蛋白依赖性激酶Cdc28 (CDK1)，以取代野生型蛋白。体内特异性抑制Cdc28会导致有丝分裂前细胞周期阻滞，这与通常在温度敏感型cdc28突变体中观察到的G1期阻滞不同。赋予抑制剂敏感性的突变很容易通过一级序列比对来识别。因此，这种方法可用于系统地构建蛋白激酶的条件性等位基因，从而可以快速表征这一重要基因家族成员的功能。[2]

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降低蛋白激酶Cε (PKCε)的表达或抑制其转位会延长小鼠的乙醇中毒时间并降低其乙醇摄入量。然而，我们尚不清楚这种表型是由于 PKCε 激酶活性降低还是由于非激酶依赖性功能受损所致。在本研究中，我们采用化学遗传学策略来确定一种高效且高选择性的 PKCε 催化活性抑制剂是否能降低乙醇摄入量。我们构建了 ATP 类似物特异性 PKCε (AS-PKCε) 敲入小鼠，该小鼠携带 PKCε ATP 结合位点的点突变，使得突变激酶对 1-叔丁基-3-萘-1-基吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺 (1-NA-PP1) 的抑制作用高度敏感。全身给药的 1-NA-PP1 能够轻易穿过血脑屏障并抑制 PKCε 介导的磷酸化。1-NA-PP1 可逆地降低了 AS-PKCε 小鼠的乙醇摄入量，但对不携带 AS-PKCε 突变的野生型小鼠没有影响。这些结果支持将PKCε催化活性抑制剂的开发作为减少乙醇摄入量的策略，并表明AS-PKCε小鼠是研究PKCε在行为学中作用的有用工具。[3]

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在本研究中，我们采用化学遗传学策略来确定一种高效且高选择性的PKCε抑制剂是否能够模拟我们在PKCε敲除小鼠中观察到的表型，即乙醇摄入量减少和乙醇中毒持续时间延长（Hodge等人，1999）。我们构建了一种新型AS-PKCε小鼠品系，该品系在ATP结合位点存在点突变，使其对纳摩尔浓度的PP1类似物1-NA-PP1高度敏感。全身给药的1-NA-PP1能够穿过血脑屏障，并在脑内达到足以抑制AS-PKCε的浓度。 1-NA-PP1 延长了乙醇引起的共济失调和催眠作用，并降低了 AS-PKCε 小鼠的乙醇摄入量。在缺乏 AS-PKCε 突变的野生型小鼠中未观察到 1-NA-PP1 的这些作用。这些结果表明，抑制 PKCε 催化活性的化合物可能有助于减少乙醇摄入量。[3]药代动力学分析表明，肠外给药后，1-NA-PP1 可迅速且易于在血浆和脑组织中检测到。我们还在长期口服给药后在脑组织中检测到了显著量的 1-NA-PP1。1-NA-PP1 抑制了小鼠纹状体中 GABAA γ2 亚基 S327 位点的磷酸化，表明 1-NA-PP1 能够在体内抑制 PKCε 介导的磷酸化。我们此前发现，在Prkce−/−小鼠的前额皮质中，GABAA γ2-S(P)327的免疫反应性降低了60±6%（Qi等人，2007），并且磷酸酶处理并未进一步降低这种残余的免疫反应性，表明该抗体也能检测到去磷酸化的蛋白质。因此，GABAA γ2-S(P)327免疫反应性降低60%代表该位点磷酸化水平降低100%。基于这些结果，我们得出结论：腹腔注射25mg/kg 1-NA-PP1可使AS-PKCε小鼠中PKCε介导的GABAA γ2磷酸化水平降低约50%[3]。1-NA-PP1以可逆的方式降低了乙醇的摄入量，并且在所测试的两个剂量下均未显著降低小鼠的酒精偏好。尽管饮水量未发生显著变化，但饮水量存在一定的波动，这可能掩盖了乙醇偏好性的显著降低。在 30 mg/kg 剂量下，饮水量呈现下降趋势，但未达到统计学显著性。在 30 mg/kg 剂量的 1-NA-PP1 下，糖精的摄入量显著降低，而奎宁的摄入量未见显著变化。这一结果与 Prkce−/− 小鼠（Hodge 等，1999）的观察结果不同，后者糖精的摄入量并未降低。1-NA-PP1 在 30 mg/kg 剂量下可能通过改变对甜味物质的味觉感知，或通过影响大脑奖赏机制或液体摄入，从而降低乙醇的摄入量。值得注意的是，纳曲酮（一种经FDA批准用于治疗酒精使用障碍的药物）可降低糖精和蔗糖的摄入量（Czachowski和Delory，2009；Ripley等人，2015）[3]。野生型C57BL/6NTac小鼠的基线乙醇摄入量远低于AS-PKCε小鼠，尽管两者都具有C57BL/6NTac背景。这种乙醇摄入量的差异可能是由于饲养环境的不同以及我们AS-PKCε小鼠群体近亲繁殖导致的遗传漂变造成的。因此，除了C57BL/6NTac品系外，我们还决定研究1-NA-PP1对C57BL/6J小鼠乙醇摄入量的影响，C57BL/6J小鼠表现出较高的酒精摄入量和偏好。重要的是，1-NA-PP1 并未降低两种野生型小鼠（均缺乏 AS-PKCε 突变）的乙醇摄入量，这表明 1-NA-PP1 对乙醇摄入的影响是 AS-PKCε 特异性的。[3]
我们之前的分子研究表明，PKCε 通过作用于 GABAA 受体来降低抑制性 GABA 神经传递，从而介导其对乙醇相关行为的影响。我们已鉴定出 PKCε 的两个底物，它们可能导致 GABAA 受体功能降低：GABAA γ2 亚基，其在 S327 位点磷酸化后，对苯二氮卓类药物和乙醇的正向变构效应的反应减弱（Qi 等，2007）；以及 N-乙基马来酰亚胺敏感因子，其在 S460 和 T461 位点磷酸化后，会减少细胞表面 GABAA 受体的数量（Chou 等，2010）。 PKCε 的其他底物可能参与调节 GABAA 受体功能和对乙醇的行为反应。M486A 突变使 AS-PKCε 能够利用体积较大的 ATP 类似物（例如 N6-苄基-ATP）作为磷酸供体，而天然激酶则不能（Bishop 等，2001；Zhang 等，2013）。在 γ-磷酸位点带有硫代磷酸基团的 ATP 类似物可以生成激酶可转移的标签，从而可以使用共价捕获-释放法从蛋白质混合物的消化物中纯化标记肽（Hertz 等，2010；Ultanir 等，2012）。对这些肽进行质谱分析可以揭示相应蛋白质的身份以及磷酸化位点的位置。利用这种方法分析AS-PKCε小鼠的组织，可以无偏地鉴定出大脑中调节GABAA受体功能和对乙醇行为反应的PKCε新底物。[3]
结论：总之，我们的结果表明，特异性抑制PKCε可减少乙醇摄入量并延长乙醇中毒时间，这证实了我们之前使用降低大脑中PKCε表达的策略所观察到的表型。我们的结果强化了开发PKCε催化活性小分子抑制剂作为治疗药物以减少乙醇摄入量的理论依据。此外，我们的发现证明了AS-PKCε小鼠作为研究PKCε在行为中的作用以及鉴定PKCε直接底物的工具的实用性。

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1. 1-萘基PP1 (1-NA-PP1) HCl属于吡唑并嘧啶骨架，是一种泛PKD抑制剂，对PKD的选择性远高于其他激酶（例如PKCα、PKCδ、CAMKIIα）[2]
2. PKD1中的门控突变（M659G）形成了一个扩大的ATP结合口袋，可容纳1-萘基PP1 (1-NA-PP1) HCl中庞大的萘基，从而使敏感性提高12倍——这使得该抑制剂-激酶对可用于解析PKD特异性信号通路[2]
3. 1-萘基PP1 (1-NA-PP1) HCl 对 AS-PKCε 具有可逆性抑制作用，AS-PKCε 小鼠在给药 48 小时后乙醇摄入量恢复即证实了这一点 [3]
4. 1-萘基PP1 (1-NA-PP1) HCl（化学名称：1-叔丁基-3-萘-1-基吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺）的 PubChem CID 为 4877 [3]
5. 1-萘基PP1 (1-NA-PP1) HCl 不影响靶蛋白（例如 PKD1、PKCε、GABA_A γ2）的总表达水平，但特异性抑制其磷酸化激活 [2, 3]

C19H20CLN5

353.8486

353.141

C, 64.49; H, 5.70; Cl, 10.02; N, 19.79

956025-47-1

1-Naphthyl PP1;221243-82-9

10066681

Light yellow to khaki solid

5.366

69.62

2

4

2

25

448

0

Cl.N1C(N)=C2C(C3C4C(=CC=CC=4)C=CC=3)=NN(C2=NC=1)C(C)(C)C

UKLRSYUALPIALU-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H19N5.ClH/c1-19(2,3)24-18-15(17(20)21-11-22-18)16(23-24)14-10-6-8-12-7-4-5-9-13(12)14;/h4-11H,1-3H3,(H2,20,21,22);1H

1-tert-butyl-3-naphthalen-1-ylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine;hydrochloride

1-NA-PP 1 hydrochloride; 956025-47-1; 1-Naphthyl PP1 hydrochloride; 1-Naphthyl PP1 (hydrochloride); 1-tert-butyl-3-naphthalen-1-ylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine;hydrochloride; 1-tert-butyl-3-(naphthalen-1-yl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine hydrochloride; 1-tert-Butyl-3-(naphthalen-1-yl)-1H-pyrazolo-[3,4-d]pyrimidin-4-amine hydrochloride; 1-tert-Butyl-3-(naphthalen-1-yl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine HCl; UKLRSYUALPIALU-UHFFFAOYSA-N; 1-Naphthyl PP1 hydrochloride; 1-Naphthyl PP1 (hydrochloride)

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~71 mg/mL (~200.7 mM)
Ethanol: ~71 mg/mL (~200.7 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。