4'-Bromo-resveratrol   中文名称: 5-[(E)-2-(4-溴苯基)乙烯基]间苯二酚

Sirtuin-1/3

Sirtuin-1和-3 （SIRT1和SIRT3）是重要的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性去乙酰化酶，已知可调节多种细胞功能。研究表明，SIRT1和SIRT3在人类黑色素瘤细胞和组织中过表达，其抑制作用导致人类黑色素瘤细胞和小鼠黑色素瘤异种移植模型中出现显著的抗增殖反应。在这项研究中，我们确定了一种新发现的SIRT1和SIRT3双小分子抑制剂，4'-溴-白藜芦醇（4'-BR）在人类黑色素瘤细胞系（G361， SK-MEL-28和SK-MEL-2）中的抗增殖作用。我们的数据表明，4'-BR治疗黑色素瘤细胞导致(a)增殖和克隆性存活减少；(b)诱导凋亡，同时procaspase-3、procaspase-8减少，caspase-3和聚（adp -核糖）聚合酶（PARP）裂解增加；(c)增殖细胞核抗原（PCNA）明显下调；(d)抑制黑色素瘤细胞迁移。此外，4'-BR引起黑色素瘤细胞的G0/G1期阻滞，伴随着WAF-1/P21的增加和Cyclin D1/Cyclin依赖性激酶6蛋白水平的降低。此外，我们发现4'-BR会导致乳酸生成、葡萄糖摄取和NAD+ /NADH比值的降低。这些反应伴随着黑色素瘤细胞乳酸脱氢酶A和葡萄糖转运蛋白1的下调。总的来说，我们的数据表明，使用4'-BR双重抑制SIRT1和SIRT3通过代谢重编程和影响细胞周期和凋亡信号传导，赋予黑色素瘤细胞的抗增殖作用。因此，SIRT1和SIRT3的联合药理抑制在黑色素瘤的治疗中需要进一步研究[1]。

乳酸生成、葡萄糖摄取和NAD+/NADH比值测定[1]
将黑色素瘤细胞接种于96孔板中，用载药和4′-溴-白藜芦醇（4′-BR） （0.025 mM和0.05 mM）分别处理48 h。根据制造商的说明，使用多模式微孔板仪测量培养基中的细胞外乳酸，细胞的葡萄糖摄取和NAD+/NADH的量。在显微镜下拍摄葡萄糖摄取的荧光图像。根据NAD+和NADH浓度的结果分析NAD+/NADH比值。

细胞培养和4'-溴-白藜芦醇(4'-BR)处理[1]
人黑色素瘤细胞系（G361, SK-MEL-28, SK-MEL-2）购自美国类型培养库。SK-MEL-28和SK-MEL-2在标准细胞培养条件下（37°C, 5% CO2，加湿培养箱），在McCoy 's 5a培养基中添加1 mM丙酮酸钠和G361细胞的EMEM中维持。获得的黑色素瘤细胞经ATCC鉴定。用MycoAlert®支原体检测试剂盒检测细胞系，发现不含支原体。将4'-溴-白藜芦醇(4'-BR)溶于浓度为0.25 M的二甲亚砜（DMSO）中作为原液，保存于- 20℃。在使用前，将原液用培养基进一步稀释至工作浓度。

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MTT细胞增殖试验[1]
将细胞分别以每孔25 × 103的密度接种于24孔板中，并在~50%的合流下用4'-溴-白藜芦醇(4'- br)浓度为0.0125-0.2 mM孵育24、48或72小时。作为对照的细胞仅用DMSO孵育。每次处理后，用PBS洗涤细胞，用5 mg/mL MTT溶液在37℃下孵育4 h，然后去除上清，每孔中加入200 μL DMSO溶解甲酰胺晶体15 min。在570 nm处用多模式微孔板读取仪测量吸光度值，计算细胞生长速率。

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台盼蓝排斥试验对细胞生长和活力的影响[1]
将黑色素瘤细胞以5 × 104的密度镀于12孔板中，分别用4′-溴-白藜芦醇（4′-BR） (0.0125-0.2 mM)处理48 h。处理后，细胞胰蛋白酶化，离心成球，重悬于PBS中。将10µl的细胞悬浮液与10µl等量的台锥蓝染料混合，使用自动细胞计数器计数，以测定细胞生长和活力。

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克隆细胞存活试验[1]
将细胞以3 × 103的密度接种于6孔板中，并用不同浓度的4'-溴-白藜芦醇(4'-BR) (0.0125-0.2 mM)处理48小时。14天后，按照前面描述的方法评估菌落形成5。

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Annexin V/PI和DAPI染色对细胞凋亡的影响[1]
按照制造商的方案，使用Vybrant™细胞凋亡检测试剂盒（Molecular Probes, Eugene， OR）检测细胞凋亡。简言之，将黑色素瘤细胞（G361、SK-MEL-28和SK-MEL-2细胞）用新鲜完全培养液以1×105细胞/ml的密度接种于12孔板中，用载药和4'-溴-白藜芦醇(4'-BR) (0.0125-0.05 mM)处理24、48和72 h。在每个时间段结束时，将细胞胰蛋白酶化并重悬于浓度为106细胞/ml的Annexin V结合缓冲液中。加入Annexin V - FITC (5 μl)，缓慢涡旋混合，4℃暗处孵育15 min。细胞用5 μl PI（50µg/ml）在4℃黑暗下染色5 min。在BD FACSCalibur流式细胞仪上获得染色细胞，用FlowJo软件分析数据。
DAPI染色观察细胞凋亡形态学变化（染色质凝聚）。为此，将黑色素瘤细胞培养在4个载玻片（5 × 104个细胞/室）中，并分别用4′-溴-白藜芦醇（4′-BR） (0.0125-0.05 mM)处理48 h。处理后，用4%多聚甲醛溶液固定，PBS洗涤，0.2% Triton X-100/PBS渗透10分钟，DAPI （1 mg/ml）染色1分钟。盖片装在90%甘油PBS溶液中，使用Nikon Digital Sight DS-Fi1倒置显微镜，使用NIS Elements AR 3.1软件拍摄图像。

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抓伤愈合试验[1]
使用划伤愈合试验检查黑色素瘤细胞迁移。简而言之，将细胞（1×106 cells/孔）置于6孔板中，在约80%的细胞合度下，用10µl移液管尖划伤，然后用无血清培养基洗涤以去除松散的细胞。然后在EVOS XL Core显微镜系统下拍照（时间=0），然后在含有DMSO和4'-溴-白藜芦醇(4'-BR) (0.05 mM)的培养基中在CO2培养箱中孵育，并在37˚C下迁移到伤口区域长达48小时。分别于24h和48h时间点在显微镜下拍摄创面。使用Image J软件对图像进行量化。

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细胞周期分析[1]
将黑色素瘤细胞以1 × 105个/孔的密度接种于6孔板中，分别用0.05 mM剂量的4′-溴-白藜芦醇（4′-BR）培养液处理。孵育48 h后，PBS洗涤细胞，0.25%胰蛋白酶分离，70%乙醇固定过夜。第二天，用清水冲洗细胞。

[1]. 4'-Bromo-resveratrol, a dual Sirtuin-1 and Sirtuin-3 inhibitor, inhibits melanoma cell growth through mitochondrial metabolic reprogramming. Mol Carcinog. 2019;58(10):1876-1885.

Metabolic transformation and increased glycolysis is the hallmark of cancer cells and inhibition of glycolysis in tumor cells is shown to starve the cancer cells to destroy the tumor ultimately. Increasing evidence suggests a key role of SIRT1 and mitochondrial SIRT3 in regulating energy metabolism and glycolysis. Since SIRT1 and SIRT3 have been identified as a key player in promoting cancer metabolism and tumor growth, we were interested in assessing if 4’-BR induces metabolic reprogramming in melanoma cells. Our study demonstrated that 4’-BR decreases mitochondrial function by inhibiting lactate production, reducing glucose uptake and dampening NAD+/NADH ratio. Importantly, we found a decrease in the expression of GLUT1 and LDHA proteins in 4’-BR treated melanoma cells. GLUT1 and LDHA, the two key genes associated with the Warburg effect, and associated with tumor progression. These results suggest that the dual SIRT1/SIRT3 inhibitor 4’-BR potentially ablates aerobic glycolysis via widening the efficacy spectrum and emphasizes the therapeutic value of concomitant inhibition of SIRT1 and SIRT3, since aerobic glycolysis is a lifeline for cancer cells.
Overall, our data suggest that dual inhibition of SIRT1 and SIRT3 by small molecule 4’-BR, imparts significant anti-proliferative effects in melanoma cells by causing metabolic reprogramming, which causes a decrease in cellular proliferation and cell cycle progression and induction of apoptosis. However, detailed mechanistic studies as well as in vivo validation studies in the appropriate animal model(s) are required to establish the clinical potential of concomitant inhibition of SIRT1 and SIRT3, using efficient small molecule inhibitors.[1]

C14H11O2BR

291.13994

289.994

1224713-90-9

18475115

White to off-white solid powder

4.03

40.46

2

2

2

17

249

0

C1=CC(=CC=C1/C=C/C2=CC(=CC(=C2)O)O)Br

NCJVLKFAQIWASE-OWOJBTEDSA-N

InChI=1S/C14H11BrO2/c15-12-5-3-10(4-6-12)1-2-11-7-13(16)9-14(17)8-11/h1-9,16-17H/b2-1+

5-[(E)-2-(4-bromophenyl)ethenyl]benzene-1,3-diol

1224713-90-9; 5-[(E)-2-(4-bromophenyl)vinyl]benzene-1,3-diol; 5-[(E)-2-(4-bromophenyl)ethenyl]benzene-1,3-diol; 1,3-Benzenediol, 5-[(1E)-2-(4-bromophenyl)ethenyl]-; (E)-5-(4-bromostyryl)benzene-1,3-diol; MFCD00238583; 4'-Bromo-resveratrol?; 1,3-Benzenediol, 5-[2-(4-bromophenyl)ethenyl]-;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~858.69 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。