A-9758

RORγt (IC50 = 5 nM); IL-17A; IL-23

A-9758 抑制人、小鼠、狗和大鼠中 RORγ 的反式激活（IC50 分别为 38 nM、20 nM、25 nM 和 64 nM）[1]。在募集辅阻遏物（NCoR1：EC50=60 nM，NCoR2：EC50=43 nM）和解除共激活子（NCoA1：IC50=110 nM，PGC1α：IC50=49 nM）时，A-9758 显示出辅因子谱 [1]。 A-9758 对人 CD4+ T 细胞和体外开发的小鼠 Th17 细胞的 IC50 分别为 100 和 38 nM，可抑制 TCR 介导的 IL-17A 产生。 A-9758 会减弱表达 RORγt 的 Th17 细胞的分化和/或效应活性 [1]。

il -23治疗动物对rorγ - t的抑制足以阻断先前存在的疾病[1]
在我们之前的研究中，我们已经证明使用rorγ γt逆激动剂进行预防性治疗可以减轻il -23介导的银屑病样皮炎。我们知道表达rorγ t的细胞的扩增（对IL-23的反应）主要发生在第2天左右，因此我们将A-9758的动物的治疗延迟到第2天（这里称为治疗剂量）。我们的研究表明，A-9758的治疗剂量足以减弱（85%±9%）il -23驱动的耳部炎症的进一步增加（图6，A和B）。治疗剂量还降低了已知的牛皮癣关键驱动基因的表达，包括IL17A和IL17F以及抗菌剂s100a7a和β -防御素（图6C）。治疗剂量的A-9758也显著降低了IL-17A蛋白水平（图6D）。总之，这些数据表明，抑制rorγ - t可能是治疗/控制持续炎症的有效治疗选择。

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抑制rr γt足以阻断gpi介导的关节炎[1]
临床研究表明，针对IL-23的生物制剂对类风湿性关节炎相对无效（Smolen et al., 2017），而针对IL-17的生物制剂可能显示出希望（Blanco et al., 2017）。为了评估rorγ - t抑制对类风湿关节炎的影响，在临床前水平，我们使用了GPI关节炎模型。我们发现，无论是预防性用药还是晚期预防性用药，A-9758都能够减轻gpi诱导的足跖肿胀（图7A）。定量地说，当预防性治疗时，A-9758减少了84%±10%的脚掌肿胀（曲线脚掌厚度下的面积，Δmm），而当预防性治疗晚期时，脚掌肿胀减少了41%±10%（图7B）。这些值与同一模型中的抗tnf α治疗相比有利，后者在预防性或晚期预防性给药时分别将足部肿胀（曲线下面积）减少了~ 100%和~ 40%（数据未显示）。在两种给药方案中，A-9758的最终暴露量约为13.75 μg/ml(血清；总药物)。这些结果与Xue et al.（2016）先前的工作一致，他们在小鼠胶原诱导的关节炎模型中显示了rorr γt小分子的有效性。总之，他们强调抑制rorγ - t可能是治疗早期或发展中的类风湿性关节炎的有效疗法。

RORγ转激活试验：[1]
将Cos-7细胞瞬时转染到384孔板中，载体pSG5-GAL4-DBD/LBD-RORγ（人、狗、大鼠或小鼠RORγ）和pGAL4RE-pGL3， pGAL4RE-pGL3是一种报告质粒，包含胸苷激酶启动子（- 105/+56）上游的GAL4应答元件（5 ' -TCG GAG GAC AGT ACT CC-3 '）的5个拷贝，插入pGL3-Basic载体。转染24小时后，再添加化合物18小时，然后使用Envision平板阅读器测量荧光素酶活性。每个浓度下化合物的相对光单位归一化在100%（高对照）和0%（低对照，使用T0901317在10µM下）之间，并绘制用于IC50测定。

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AlphaScreen和辅因子招募试验 alphasgreen技术（即放大发光接近均相法）用于测定RORγt LBD [His-RORγ（氨基酸T259-K518）；促活因子PGC1α (LXD1)肽（n-生物素- qeaeepsllkklllapantql - cooh）。采用Hepes 25 mM， NaCl 100 mM，牛血清白蛋白（BSA） 0.1%, pH 7.4作为缓冲液，384孔格式进行检测。先分配缓冲液和浓度为300 nM的PGC1α肽，然后分别加入浓度为3、3和30 nM的RORα、RORβ和RORγ蛋白。化合物的最终浓度范围为10µM ~ 0.3 nM，最终DMSO浓度为0.5%。在室温下避光孵育1小时。加入镍螯合受体珠和链霉亲和素供体珠，均为20µg/ml，再孵育2小时。荧光信号随后在Envision平板阅读器上读取。每种化合物浓度下的荧光信号归一化在100%（高对照）和0%（无肽低对照）之间，并绘制用于IC50测定。 为了在一组共激活剂和共抑制剂上更好地分析化合物，除了rorγ γt和多肽的最终浓度为0.1µM外，使用了与前面描述的相似的条件。通过Bachem合成的肽有：NCoA1 (LXD4) （N-biotin-CPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSPS-COOH）、EBIP37 （N-biotin-TGGGVSLLLHLLNTEQGES-COOH）、NCoR1 （n- biotin- ghsadpasnlglediirkalmgsf - cooh）和NCoR2 （N-biotin-EHASTNMGLEAIIRKALMGKY-COOH）。

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放射性配体结合试验。[1]
使用Nunc 96孔聚丙烯板，用不同浓度的25-[3H]羟基胆固醇（50 mM Hepes (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.01% BSA和1 mM二硫代苏糖醇）孵育100纳克纯化His-RORγ LBD 2小时。非特异性结合测量使用过量的非放射性25-羟基胆固醇，这是在计算中用于背景去除。在0.05% 3-[（3-胆酰胺丙基）二甲酰胺]-1-丙烷磺酸水合物中预浸1小时，然后用冷实验缓冲液洗涤4次，通过GFB unfilter plate快速过滤终止实验。反应混合物过滤后，滤板用冰冷的实验缓冲液洗涤三次，然后在50°C下干燥1小时。然后，加入UltimaGold闪烁鸡尾酒，4小时后在MicroBeta计数器上读取盘子。

小鼠Th17分化试验：[1]
纯化C57BL/6小鼠(6 - 8周龄)使用CD4 T细胞分离试剂盒。CD4+ T细胞在抗cd3和抗cd28 （10 μg/ml）预包被的96孔板中孵育3天，含或不含Th17极化培养基[RPMI 1640，含10% FBS， 1X l -谷氨酰胺，1X青霉素-链霉素，1X非必需氨基酸，1mm na -丙酮酸，10 mM Hepes + 5 ng/ml重组小鼠转化生长因子-β1, 50 ng/ml重组小鼠IL-6, 10 ng/ml重组小鼠IL-1β， 10 μg/ml抗小鼠IL-4，和10 μg/ml抗小鼠IFNγ]， A-9758存在或不存在。收获前4小时，在培养基中加入BD GolgiPlug/Brefeldin A。流式细胞术染色并分析细胞内IL-17A和r - γ - t的测定。用于流式细胞分析的抗体的完整列表见补充表1。采用超灵敏小鼠IL-17A法测定上清液中IL-17A水平。 <人力资源> 人全血测定。[1]
与已发表的评估人全血IL-17产生的方法类似（Russell等人，2018），在知情同意后并根据批准的机构审查委员会协议（AbbVie Inc.）从健康志愿者中采集血液。全血在RPMI 1640中以1:6 .6混合（荷兰修改）。将200微升稀释后的血液加入已经含有载物（0.1% DMSO）或A-9758的Nunc平底96孔组织培养板中。加入CytoStim至终浓度为每孔2.5 μl。最终孔体积为250 μl。37℃/5% CO2孵育48小时。然后在1500 rpm下离心5分钟，收集血浆用于IL-17A分析。

IL-23+/IL-1β Model.[1]
Female C57BL/6 mice, aged 6–8 weeks, were dosed intraperitoneally 24 hours prior to challenge with 25 mg/kg mouse anti-p40 or by mouth 1 hour prior to challenge with A-9758 in 0.5% hydroxypropyl methylcellulose/0.02% Tween vehicle. In a model analogous to Fauber et al. (2015), mice were then challenged with a single intravenous injection of 300 ng IL-23+ and 1000 ng IL-1β. Three hours post challenge, mice were sacrificed by inhaled isofluorane and blood was collected via cardiac puncture. EDTA plasma was analyzed for cytokine levels via Meso Scale Discovery assay.

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Glucose-6-Phosphate Isomerase/Arthritis Model.[1]
Similar to Schubert et al. (2004), male DBA/J mice (Jackson Laboratories) were immunized intradermally at the base of the tail with 100 µl of 1:1 (v/v) emulsion containing 300 µg of glucose-6-phosphate isomerase (GPI) and 200 µg of heat-inactivated M. tuberculosis H37Ra. Mice were dosed orally two times daily with 100 mg/kg A-9758 in 0.5% hydroxypropyl methylcellulose/0.02% Tween 80. For prophylactic treatment mice were dosed two times daily with 100 mg/kg A-9758 starting on day 0 prior to immunization. For late prophylactic treatment mice were dosed two times daily with 100 mg/kg A-9758 starting on day 7 after immunization. Paw swelling in rear paws was measured using Dyer spring calipers, with baseline paw thickness assessed on day 7 after immunization and additional measurements assessed between days 10 and 17.

[1]. Inhibition of IL-23 mediated inflammation with a novel small molecule inverse agonist of RORgt. J Pharmacol Exp Ther. 2019 Aug 2. pii: jpet.119.258046.

Blockade of interleukin (IL)-23 or IL-17 with biologics is clinically validated as a treatment of psoriasis. However, the clinical impact of targeting other nodes within the IL-23/IL-17 pathway, especially with small molecules, is less defined. We report on a novel small molecule inverse agonist of retinoid acid-related orphan receptor (ROR) γt and its efficacy in preclinical models of psoriasis and arthritis. 1-(2,4-Dichloro-3-((1,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-1H-indol-2-yl)methyl)benzoyl)piperidine-4-carboxylic acid (A-9758) was optimized from material identified from a high-throughput screening campaign. A-9758 is selective for RORγt and exhibits robust potency against IL-17A release both in vitro and in vivo. In vivo, we also show that IL-23 is sufficient to drive the accumulation of RORγt+ cells, and inhibition of RORγt significantly attenuates IL-23-driven psoriasiform dermatitis. Therapeutic treatment with A-9758 (i.e., delivered during active disease) was also effective in blocking skin and joint inflammation. Finally, A-9758 exhibited efficacy in an ex vivo human whole blood assay, suggesting small molecule inverse agonists of RORγt could be efficacious in human IL-17-related diseases. SIGNIFICANCE STATEMENT: Using a novel small molecule inverse agonist, and preclinical assays, we show that RORγt is a viable target for the inhibition of RORγt/Th17-driven diseases such as psoriasis. Preclinical models of psoriasis show that inhibition of RORγt blocks both the accumulation and effector function of IL-17-producing T cells.[1]

C25H23CL2F3N2O3

527.36

526.103

2055271-22-0

124123531

Typically exists as solid at room temperature

5.9

62.5

1

6

4

35

792

0

NVDKGFYFKVWJLJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H23Cl2F3N2O3/c1-13-9-15(25(28,29)30)10-21-18(13)11-16(31(21)2)12-19-20(26)4-3-17(22(19)27)23(33)32-7-5-14(6-8-32)24(34)35/h3-4,9-11,14H,5-8,12H2,1-2H3,(H,34,35)

1-[2,4-dichloro-3-[[1,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)indol-2-yl]methyl]benzoyl]piperidine-4-carboxylic acid

A-9758; A9758

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。