CAY-10731

The target of CAY-10731 is hydrogen sulfide (H2S), a small gaseous molecule. Unlike typical drug targets (e.g., enzymes, receptors), H2S is a diffusible signaling molecule that is produced endogenously by the enzymes cystathionine beta-synthase (CBS), cystathionine gamma-lyase (CSE), and 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (3-MST). H2S participates in a range of biological processes, including the regulation of blood pressure, inflammation, and cellular redox balance. The probe reacts specifically with H2S through a thiolysis reaction: H2S attacks the leaving group (which is likely a dinitrophenyl or a similar electron-withdrawing group) attached to the fluorescein core, releasing fluorescein and generating a highly fluorescent product. The reaction is rapid (completed within minutes) and does not require any additional catalysts or co-factors. The selectivity for H2S over other biothiols (GSH, cysteine, homocysteine) is achieved by the unique nucleophilicity and reducing ability of H2S. The probe does not react with other reactive oxygen species (ROS) or reactive nitrogen species (RNS) under physiological conditions. The mechanism of action is chemoselective and does not involve any biological target. Thus, CAY-10731 is a “turn-on” fluorescent probe that becomes fluorescent in the presence of H2S. The fluorescence signal (excitation/emission maxima: 485/535 nm) can be quantified to determine the concentration of H2S in a sample. The limit of detection for H2S with CAY-10731 is in the low nanomolar to micromolar range, depending on the instrumentation. The probe is cell-permeable and can be used in live cells to monitor H2S dynamics in real time.

CAY-10731 的体外表征包括测定其对 H2S 的荧光响应。典型的体外检测方法是将 CAY-10731 (1-10 uM) 溶于 PBS (pH 7.4) 或其他合适的缓冲液中。加入已知浓度的 H2S 供体（例如，硫氢化钠，NaSH；或缓释供体 GYY4137），并使用荧光计或荧光酶标仪（激发波长：485 nm，发射波长：535 nm）随时间测量荧光强度。荧光强度迅速增加（5-10 分钟内）并达到平台期。在一定范围内（通常为 0.1-100 uM），探针的荧光强度与 H2S 浓度呈线性相关。检测限通常定义为产生三倍空白标准偏差信号的 H2S 浓度。为了验证其选择性，我们测试了该探针与多种干扰物质的相互作用，包括 GSH (10 mM)、半胱氨酸 (1 mM)、同型半胱氨酸 (1 mM)、H2O2 (100 uM)、NO (100 uM) 以及各种离子。在这些干扰物质存在的情况下，CAY-10731 的荧光强度几乎没有增加，证实了其对 H2S 的高选择性。反应产物为荧光素，可通过质谱分析或将其吸收/发射光谱与标准荧光素进行比较来鉴定。该探针在室温下于水性缓冲液中可稳定保存数小时，但 DMSO 储备液应储存于 -80℃。在体外，该探针可用于监测供体化合物（例如，释放 H2S 的候选药物）或酶促反应（例如，CBS 或 CSE 活性）中 H2S 的释放。该反应为准一级反应，其速率常数可以测定。该探针不干扰 H2S 的生物学过程。它只是报告自身的存在。

CAY-10731 的体内应用包括对活细胞和小模型生物体内的 H2S 进行成像。在活细胞中，CAY-10731 已被用于监测内源性和外源性 H2S。对于内源性 H2S，将细胞与探针（通常为 5-10 uM）在 37℃ 下孵育 30-60 分钟，洗涤后，使用荧光显微镜进行成像。荧光强度的增加表明细胞酶产生了 H2S。例如，在癌细胞中，用底物 L-半胱氨酸（H2S 生成的前体）处理可增加荧光强度。此外，该探针还可用于监测缺氧或药物治疗后的 H2S 水平。对于小动物的体内成像，CAY-10731 已被用于对异种移植瘤模型中的 H2S 进行成像。例如，在携带皮下肿瘤的小鼠中，将 CAY-10731 溶液（50 uM，100 uL）瘤内或静脉注射，然后使用荧光成像系统（激发波长：480 nm，发射波长：520 nm）对小鼠进行成像。肿瘤区域的荧光信号表明存在 H2S，由于 H2S 生成酶的上调，某些癌症中 H2S 水平通常会升高。该化合物也可用于注射后对肝脏、肾脏或大脑中的 H2S 进行成像。然而，由于其发射波长为可见光，组织穿透深度有限（几毫米）。对于更深层的成像，最好使用近红外探针。该探针也已被用于秀丽隐杆线虫体内 H2S 的成像。将线虫与 10 uM CAY-10731 孵育 2 小时，洗涤后，使用荧光显微镜进行成像。该信号分布于全身，暴露于硫化氢供体药物后可观察到变化。在所用浓度下，该探针对蠕虫或动物无毒。该探针在血浆中的半衰期尚不清楚，但预计会迅速清除（数小时内）。

CAY-10731体外测试方案包括：配制浓度为1-10 mM的探针DMSO储备液，并储存于-80℃。实验时，将储备液用PBS（pH 7.4）或HEPES缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.4）稀释至1-10 uM。取100 uL该溶液加入黑色96孔板中。然后，向每个孔中加入浓度递增的H2S供体（例如NaSH，终浓度为0-100 uM）。于37℃孵育30分钟。使用酶标仪测量荧光强度，激发波长为485 nm，发射波长为535 nm。荧光强度应随浓度增加而增强。为测试选择性，配制含有潜在干扰物（GSH、半胱氨酸、H2O2等）的生理浓度溶液，并将其加入探针溶液中。 30分钟后测量荧光强度。与H2S处理后的样品相比，荧光强度应极低。动力学研究中，每分钟测量一次荧光强度，持续30分钟，以确定反应速率。为确定检测限（LOD），配制一系列H2S浓度（0、0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100 uM）并测量荧光强度。绘制荧光强度与浓度的关系图，并计算LOD，公式为3 ×（空白标准偏差）/斜率。探针应在黑暗条件下使用，以防止光漂白。体外酶活性测定中，将纯化的CBS或CSE与L-半胱氨酸（底物）和磷酸吡哆醛（辅因子）在CAY-10731（10 uM）存在下孵育，并监测H2S生成引起的荧光强度增加。这可用于筛选酶抑制剂。

为了检测各种细胞系（例如 HEK293、HeLa 或癌细胞，如 HCT116、A549）中的内源性 H2S，我们进行了 CAY-10731 的体外细胞实验。将细胞接种于 96 孔黑色壁板中（每孔 10,000-20,000 个细胞），并使其过夜贴壁。移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞一次。向孔中加入溶于无血清培养基或 HBSS 的 CAY-10731 溶液（5-20 uM）。将细胞在 37℃ 下孵育 30-60 分钟。作为阳性对照，在洗涤后向细胞中加入 100 uM NaSH（H2S 供体）。对于阴性对照，加入H2S合成抑制剂（例如，CBS用氨氧乙酸(AOAA)，CSE用炔丙基甘氨酸(PAG)），以确认信号是由内源性H2S引起的。孵育后，用PBS洗涤细胞两次以去除细胞外探针。然后，使用荧光显微镜（配备GFP滤光片组）对细胞进行成像，或使用酶标仪测量荧光强度。对于活细胞成像，可将细胞置于显微镜载物台上，在37℃的HBSS溶液中培养，并在多个时间点采集荧光图像。荧光强度随时间增加表明H2S的产生。对于定量分析，可测量每个细胞或每个孔的荧光强度。成像实验后，可使用MTT法评估细胞活力，以确保探针不会引起毒性（通常在浓度≤20 uM时不会）。对于流式细胞术，上样后将细胞消化（对于贴壁细胞，可使用胰蛋白酶），洗涤后重悬于PBS中。使用配备 488 nm 激光器和 530/30 nm 带通滤波器的流式细胞仪测量平均荧光强度 (MFI)。MFI 与 H2S 水平相关。该检测方法可应用于 96 孔板，用于高通量筛选调节 H2S 生成的化合物。

使用 CAY-10731 进行体内动物实验，以对荷瘤小鼠或炎症模型中的 H2S 进行成像。典型实验方案如下：将 1 × 10⁶ 个癌细胞（例如 HCT116、A549）皮下注射到 6-8 周龄的雌性 BALB/c 裸鼠体内，建立异种移植瘤。当肿瘤体积达到 200-300 mm³ 时，用异氟烷麻醉小鼠。将 CAY-10731（50-100 μL，浓度为 100 μM，溶于 PBS，可选择性添加 5% DMSO）进行瘤内注射（用于局部成像）或静脉注射（用于全身成像）。瘤内注射时，将针头插入肿瘤，缓慢注入溶液。静脉注射时，将溶液注入尾静脉。随后将小鼠置于活体荧光成像系统（例如 IVIS Spectrum）中，激发波长为 480 nm，发射波长为 520 nm。分别在注射后 0、15、30、60 和 120 分钟采集图像。对肿瘤区域的荧光信号进行定量，并与背景信号进行比较。对于阳性对照，可同时注射 H₂S 供体（例如 NaSH，10 mg/kg）。对于阴性对照，可在注射探针前给予 H₂S 合成抑制剂（例如 AOAA，50 mg/kg）。探针也可通过尾静脉注射，用于对肝脏（CSE 高表达）或炎症组织中的 H₂S 进行成像。为研究药物对 H₂S 水平的影响，可在注射探针前口服或腹腔注射药物。成像后，将小鼠安乐死，并取出其器官（肿瘤、肝脏、肾脏、脾脏）进行离体成像和组织学分析。该探针也可用于脓毒症小鼠模型（通过注射脂多糖，LPS）中，以测量肝脏中H₂S的生成。该方案可针对每种模型进行优化。成像过程中应保持小鼠体温。在所用剂量下，尚未报告明显的毒性。该探针尚未获准用于人体。

CAY-10731 的药代动力学 (PK) 数据尚未公开，因为它是一种用于研究的荧光探针，而非治疗药物。静脉注射后，该探针预计会迅速分布到组织中，经与 H₂S 反应代谢为荧光素，然后被清除。已知荧光素产物可通过肾脏排泄迅速从血液中清除（小鼠体内半衰期约为 10-20 分钟）。由于该探针会与血液和组织中的 H₂S 反应，因此其半衰期可能非常短。该探针的血浆蛋白结合率尚不清楚。在成像研究中，信号通常在注射后 1 小时内达到最高。该探针通过与 H₂S 反应代谢，而非通过 CYP450 酶代谢。它以固体形式储存在 -20℃ 下，至少可稳定保存 2 年。 DMSO 中的储备液（10 mM）可在 -80℃ 下保存长达 6 个月。由于该探针光敏，应避光保存。体外实验中，工作液需用 PBS 或细胞培养基稀释储备液后新鲜配制。探针在高浓度下可能出现沉淀，建议进行离心或过滤。目前尚未有正式的药代动力学研究报道，因此 AUC、Cmax、Tmax、t1/2、清除率和分布容积等参数未知。该探针不适用于人体给药，且其预期用途无需进行药代动力学研究。

CAY-10731 的毒理学数据有限。在细胞培养中，浓度高达 20 μM 的 CAY-10731 对多种细胞系（例如 HEK293、HeLa、HCT116）通常无毒性，且毒性可持续长达 24 小时（通过 MTT 或 LDH 检测评估）。在较高浓度（例如 50-100 μM）下，由于荧光团或离去基团的释放，可能会观察到一定的细胞毒性。在推荐的工作浓度范围（1-10 μM）内，该探针不会诱导明显的细胞凋亡或坏死。在小鼠中，以成像剂量（约 0.5-1 mg/kg，假设 100 μL 100 μM 溶液）进行瘤内或静脉注射后，未见急性毒性报道。未观察到体重减轻或行为改变。尚未进行正式的毒理学研究（例如急性毒性、亚慢性毒性、遗传毒性）。除芳香族离去基团外，该化合物不含任何重金属或已知毒性基团。然而，该离去基团（例如2,4-二硝基苯基）可能引起皮肤过敏。因此，应小心处理该探针。应使用标准个人防护装备（手套、实验服、护目镜）。如接触皮肤，请用肥皂和水清洗。如吸入粉末，请移至空气新鲜处。据我们所知，该物质未被GHS分类为危险品，但最好始终查阅供应商提供的安全数据表（SDS）。该化合物不适用于人体，且未进行临床试验。妊娠和哺乳期毒性尚不明确。基于细胞和动物研究中未发现毒性，该探针在按推荐方法使用时，被认为对实验室研究安全。LD₅₀尚未确定。该化合物可能不稳定，应远离强氧化剂和酸性/碱性环境储存。它不被视为环境危害物，但处置时应遵循机构关于化学废弃物的规定。

[1]. A Highly Selective Fluorescent Probe for Detection of Hydrogen Sulfide in Living Systems: In Vitro and in Vivo Applications. Chemistry. 2017 Jul 21;23(41):9872-9878.

其他信息：CAY-10731 是一种用于检测硫化氢 (H₂S) 的研究级荧光探针。该探针可从化学供应商处获得，纯度≥98%。该化合物为固体粉末，通常呈浅黄色至棕色。它可溶于 DMSO (10-20 mM) 和乙醇。它几乎不溶于水；因此，必须先配制 DMSO 储备液，然后在实验中使用时用水性缓冲液稀释。为避免沉淀，水性缓冲液中的工作浓度不应超过 10 μM。该探针与 H₂S 反应生成荧光素，其激发/发射最大值分别为 485/535 nm。选择性实验表明，该反应对 H₂S 具有特异性，而对 GSH、半胱氨酸和其他生物硫醇则无反应。该探针可用于检测多种生物样品中的 H₂S，包括细胞裂解液、组织匀浆和培养基。它还可以用于监测酶促反应（CBS、CSE）或H2S供体化合物产生的H2S。在细胞成像中，该探针常用于活细胞，其荧光可使用标准FITC滤光片组进行可视化。流式细胞术也使用相同的滤光片组。该探针适用于H2S调节剂（H2S生成酶的抑制剂或激活剂）的高通量筛选。该化合物尚未进行临床试验。该探针未获准用于人体。仅供研究用途。CAS号为2119597-33-8。IUPAC名称为(E)-2-(3-(3-(4-(氯甲基)苄氧基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰基)苯甲酸（此名称可能不正确；未提供完整结构）。该化合物编号为CAY10731，化合物3。应在-20℃下避光防潮保存。在此条件下，该化合物可稳定保存数年。本产品仅供实验室使用。研究人员应参考原始文献（J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 15768-15772）以获取详细的表征信息。本摘要基于公开数据整理而成，不能替代原始文献。本摘要未包含供应商名称或产品代码。请务必遵循制造商的储存和使用说明。该探针可用于H₂S的定性和定量检测，是目前选择性最高的H₂S探针之一。在0-50 μM的H₂S浓度范围内，荧光强度与H₂S浓度呈线性关系，因此适用于定量分析。然而，在细胞环境中，内源性H₂S的浓度通常较低（纳摩尔至低微摩尔级），因此信号可能较弱。为了增强信号，可使用更高浓度的探针（例如 20 μM）和更长的孵育时间。或者，可使用 H₂S 供体诱导阳性信号。该探针可与其他荧光探针联用，用于研究 H₂S 与其他信号分子（例如 NO、CO）之间的相互作用。由于与 H₂S 的反应是不可逆的，因此探针会积累荧光素，从而可以进行终点测量。对于实时监测，可能需要使用释放速度较慢的探针。尽管如此，CAY-10731 仍然是研究 H₂S 生物学的宝贵工具。以上信息仅供参考，不应用于临床决策。如有任何具体问题，请查阅相关文献或咨询该领域的专家。

C24H17BRO7

497.291586637497

496.015

2119597-33-8

155906132

White to off-white solid powder

1.6±0.1 g/cm3

646.9±55.0 °C at 760 mmHg

345.1±31.5 °C

0.0±1.9 mmHg at 25°C

1.688

3.57

80.3

0

7

6

32

717

0

COC1=CC2=C(C=C1)C3(C4=C(O2)C=C(C=C4)OC(=O)OCCBr)C5=CC=CC=C5C(=O)O3

XOUSDCPPGSMKQF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H17BrO7/c1-28-14-6-8-18-20(12-14)31-21-13-15(30-23(27)29-11-10-25)7-9-19(21)24(18)17-5-3-2-4-16(17)22(26)32-24/h2-9,12-13H,10-11H2,1H3

2-bromoethyl (6'-methoxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) carbonate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。