clathrin

在孵育前用 Clathrin-IN-1 (Pitstops 2) 处理的 HeLa 细胞表现出 Tf 摄取的剂量依赖性减少，IC50 值为 12–5 μM。当应用 30 μM Clathrin-IN-1 时，Tf 内吞作用被完全抑制。经过一到三个小时的药物冲洗后，HeLa 细胞网格蛋白-IN-1 诱导的 Tf 内吞作用的抑制作用完全恢复。 U2OS 细胞中 Tf 摄取 IC50 为 9.7 μM。此外，Pitstop 2 强烈抑制 EGF 的吸收[1]。在 HeLa 细胞中，网格蛋白-IN-1 (Pitstops 2) 有效且选择性地将 HIV-1 感染性降低了 90% 以上[1]。进站诱导的网格蛋白 TD 功能抑制会突然破坏 HIV 进入、受体介导的内吞作用和突触小泡回收。网格蛋白涂层成分（例如 FCHo、网格蛋白和动力蛋白）的持续时间在内吞作用抑制期间显着增加，表明网格蛋白 TD 控制涂层凹坑动力学[1]。

基于elisa的网格蛋白抑制剂结合试验[2]
网格蛋白抑制剂试验是基于我们之前的报告。在筛选缓冲液（20 mM HEPES, pH 7.4, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF）中细菌表达重组纯化his6标记的amphiphysin 1（氨基酸250-578），加入384孔ELISA板（高结合PS Microplate），在室温下与塑料结合1小时。用50 μL阻断缓冲液（20 mM HEPES, pH 7.4, 50 mM NaCl, 1 mM PMSF, 2% BSA， 2.5%脱脂牛奶）在4°C下孵育过夜，非特异性结合减少。广泛洗涤（20 mM HEPES, pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.05% Tween 20）后，加入DMSO （10 μL）稀释的化合物，与细菌表达的重组gst标记的网格蛋白重链TD（氨基酸1 - 364）在室温下在筛选缓冲液中孵育1小时。洗涤三次后，在筛选缓冲液中加入辣根过氧化物酶偶联抗gst抗体，室温孵育15min。补洗后，加入50 μL辣根过氧化物酶TMB（3,3 ',5,5 ' -四甲基联苯胺）显色底物，孵育20 min后，加入50 μL 1 N硫酸终止反应，呈黄色。结合蛋白的量用分光光度法测定。相对结合以DMSO控制的百分比计算。

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动力蛋白GTPase测定[2]
采用全脑外周膜萃取和GST-Amph2-SH3-sepharose亲和纯化的方法从羊脑中纯化天然动力蛋白I。GTP酶测定是基于使用孔雀石绿法比色检测GTP的磷酸盐释放，如前所述。GTPase实验缓冲液中含有5 mM Tris-HCl、10 mM NaCl、2 mM Mg2+、pH 7.4、1 μg/mL lepeptin、0.1 mM PMSF和0.3 mM GTP。在37℃条件下，用4 μg/mL超声磷脂酰丝氨酸刺激Dynamin （20 nM）活性30 min。

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筛选程序[1]
使用自动化平台筛选来自由FMP （http://fmp-berlin.info/screening_unit.html）托管的ChemBioNet中央开放获取技术平台的17,000个小分子（100 μM），使用基于elisa的384孔格式检测，以检测其干扰网格蛋白kd -amphiphysin关联的能力（详见下文）。选择48个初始点（抑制率为80%）。其中10个命中可以通过剂量响应分析（3 ~ 300 μM）和结构命中聚类进行验证。命中验证。根据无脱靶效应和对转铁蛋白内吞的抑制作用，选择了两种先导化合物。如上所述，根据这些引线合成的重点库被重新筛选，从而确定了进站1和2。

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elisa结合试验[1]
纯化的his6标记蛋白被稀释到筛选缓冲液（20 mM HEPES [pH 7.4], 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF）中，加入到284孔ELISA板（高结合PS微孔板）中，在rt下结合1小时。非特异性结合在50 μl阻断缓冲液（20 mM HEPES [pH 7.4], 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 2% BSA， 2.5%牛奶）中孵育过夜，4°C。用20 mM HEPES (pH 7.4), 50 mM NaCl, 0.05% Tween 20，加入DMSO （10 μl）稀释的化合物，与gst标记的蛋白在筛选缓冲液中RT孵育1小时。三次洗涤后，将酶标偶联的抗gst抗体加入筛选缓冲液中，并在室温下孵育15分钟。再次洗涤后，以TMB为底物，在450nm处用板读仪光度测定结合蛋白。

流式细胞术细胞周期分析[1]
细胞（5 × 105）在10 cm培养皿中培养。抑制剂处理后，收集细胞（漂浮和贴壁），将单细胞悬液固定在80%的低温乙醇中，在- 20°C下至少16小时。用碘化丙啶染色细胞，并按先前描述的方法分析细胞周期（Joshi等人，2010）。使用FACS Diva软件（v5.0.1）在488nm处使用FACS Canto流式细胞仪获得细胞周期谱。使用FlowJo软件（v7.1）分析细胞周期谱。

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台盼蓝排斥试验[1]
细胞接种于10 cm培养皿中（1 × 105个/皿）。在第0天（播种后24小时），在1 μM、3 μM、10 μM和30 μM的浓度下，对存在或不存在停站的三次复制细胞进行处理。20小时后，使用先前描述的Vi-CELL XR细胞活力分析仪测量细胞数量和活力（Joshi等，2010）。

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乳酸脱氢酶毒性试验[1]
通过乳酸脱氢酶（LDH）活性测定其毒性。将HeLa细胞接种于96孔板中。不同步生长的细胞在指定的浓度下，在有或没有停站的情况下处理8h。将上清（50 μl）加入100 μl的LDH测定试剂（Sigma-Aldrich）中，反应20 min。在490 nm和690 nm（平板背景吸光度）处测定吸光度。数值归一化为药物/培养基背景值，毒性计算为100%裂解细胞对照的百分比。

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MTT试验[1]
生长抑制试验如前所述进行。4、5将对数生长的细胞转移到96孔板（100 μl培养基/孔）上，HeLa、HT29、H460、A431和DU145细胞密度为2500个/孔，SW480细胞密度为3000个/孔，MCF7、BE2-C和SJ-G2细胞密度为3500个/孔，A2780细胞密度为2000个/孔。在第0天（镀后24小时），重复的细胞用或不加停站处理。药物暴露72小时后，使用MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]2,5-二苯基溴化四氮唑）测定法评估细胞毒性和生长抑制作用。根据三个独立实验的MTT剂量反应曲线计算GI50值，每个实验重复进行。GI50是根据第0天的光密度值与药物暴露结束时的光密度值之差得出的抑制细胞生长50%的药物浓度。

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CME Assay (Texas red-Tf Uptake) [2]
根据先前描述的方法分析U2OS细胞的Tf摄取。将细胞暴露于试验抑制剂（1 ~ 300 μM）或载体中30 min，然后在37℃下添加4 μg/mL Tf-A594 8 min。通过自动采集和分析系统对大量细胞进行了对U2OS细胞中TxR-Tf内吞作用抑制的定量分析。每个数据点的平均细胞数为~ 1200。使用Graphpad Prism v5计算IC50值，数据以三个孔和~ 1200个细胞的平均值±95%置信区间（CI）表示。

[1]. Role of the clathrin terminal domain in regulating coated pit dynamics revealed by small molecule inhibition. Cell. 2011 Aug 5;146(3):471-84.

[2]. Development of 1,8-naphthalimides as clathrin inhibitors. J Med Chem. 2014 Jan 9;57(1):131-43.

Clathrin-mediated endocytosis (CME) regulates many cell physiological processes such as the internalization of growth factors and receptors, entry of pathogens, and synaptic transmission. Within the endocytic network, clathrin functions as a central organizing platform for coated pit assembly and dissociation via its terminal domain (TD). We report the design and synthesis of two compounds named pitstops that selectively block endocytic ligand association with the clathrin TD as confirmed by X-ray crystallography. Pitstop-induced inhibition of clathrin TD function acutely interferes with receptor-mediated endocytosis, entry of HIV, and synaptic vesicle recycling. Endocytosis inhibition is caused by a dramatic increase in the lifetimes of clathrin coat components, including FCHo, clathrin, and dynamin, suggesting that the clathrin TD regulates coated pit dynamics. Pitstops provide new tools to address clathrin function in cell physiology with potential applications as inhibitors of virus and pathogen entry and as modulators of cell signaling.[1]

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Clathrin-mediated endocytosis (CME) regulates many cell physiological processes such as the internalization of growth factors and receptors, entry of pathogens, and synaptic transmission. Within the endocytic network, clathrin functions as a central organizing platform for coated pit assembly and dissociation via its terminal domain (TD). We report the design and synthesis of two compounds named pitstops that selectively block endocytic ligand association with the clathrin TD as confirmed by X-ray crystallography. Pitstop-induced inhibition of clathrin TD function acutely interferes with receptor-mediated endocytosis, entry of HIV, and synaptic vesicle recycling. Endocytosis inhibition is caused by a dramatic increase in the lifetimes of clathrin coat components, including FCHo, clathrin, and dynamin, suggesting that the clathrin TD regulates coated pit dynamics. Pitstops provide new tools to address clathrin function in cell physiology with potential applications as inhibitors of virus and pathogen entry and as modulators of cell signaling.[2]

C19H13N2NAO5S

404.37

404.044

C, 56.44; H, 3.24; N, 6.93; Na, 5.69; O, 19.78; S, 7.93

1332879-51-2

Pitstop 2;1419320-73-2

71483522

Typically exists as solid at room temperature

129

1

6

3

28

716

0

S(C1C=C2C=CC=C3C(N(CC4C=CC(=CC=4)N)C(C(C=1)=C32)=O)=O)(=O)(=O)[O-].[Na+]

MKPPGLKJTZAXNE-UHFFFAOYSA-M

InChI=1S/C19H14N2O5S.Na/c20-13-6-4-11(5-7-13)10-21-18(22)15-3-1-2-12-8-14(27(24,25)26)9-16(17(12)15)19(21)23;/h1-9H,10,20H2,(H,24,25,26);/q;+1/p-1

sodium;2-[(4-aminophenyl)methyl]-1,3-dioxobenzo[de]isoquinoline-5-sulfonate

ClathrinIN1; pitstop 1; 1332879-51-2; sodium;2-[(4-aminophenyl)methyl]-1,3-dioxobenzo[de]isoquinoline-5-sulfonate; Clathrin inhibitor 1; GLXC-04355; sodium 2-(4-aminobenzyl)-1,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-benzo[de]isoquinoline-5-sulfonate; Clathrin IN 1; Clathrin-IN-1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。