Bcr-Abl

一些癌症细胞发生染色体易位，导致慢性粒细胞白血病（CML）中包括BCR-ABL在内的异常致癌融合蛋白的表达。ABL酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼和达沙替尼，显示出显著的治疗效果，尽管在长期治疗期间出现耐药性阻碍了治疗。治疗慢性粒细胞白血病的另一种方法是下调BCR-ABL蛋白。我们设计了一种名为凋亡蛋白特异性和非遗传抑制剂[IAP]依赖性蛋白清除器（SNIPR）的杂交分子的蛋白质敲除系统，旨在诱导IAP介导的靶蛋白泛素化和蛋白酶体降解，最近开发了一对针对BCR-ABL蛋白的SNIPR（ABL）。在这项研究中，我们测试了ABL抑制剂和IAP配体的各种组合，并针对SNIPER（ABL）的蛋白质敲除活性对接头进行了优化。由此产生的SNIPR（ABL）-39，其中达沙替尼通过聚乙二醇（PEG）×3接头与IAP配体LCL161衍生物偶联，显示出降解BCR-ABL蛋白的强大活性。机制分析表明，细胞凋亡抑制蛋白1（cIAP1）和X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）都在BCR-ABL蛋白的降解中发挥作用。与BCR-ABL蛋白的降解一致，SNIPER（ABL）-39抑制了信号转导子和转录激活子5（STAT5）和Crk样原癌基因（CrkL）的磷酸化，并抑制了BCR-ABL阳性CML细胞的生长。这些结果表明，SNIPER（ABL）-39可能是一种针对BCR-ABL阳性CML的基于降解的新型抗癌药物的候选者[1]。

与ATP结合位点结合的ABL1抑制剂的抑制剂活性测定[1]
在加入检测板之前，将三倍浓度的His-ABL1蛋白、Tb-SA和生物素化抗His抗体混合在检测缓冲液中，并在室温下孵育1小时以上。将溶解在测定缓冲液中的几种浓度的试验抑制剂分配到测定板中。随后，将ABL/抗体/Tb-SA预混物分配到每个孔中，并在室温下孵育120分钟。通过加入含有13.5 nM BODIPY-达沙替尼的测定缓冲液引发反应。将平板在室温下孵育30分钟，使用EnVision Multilabel平板阅读器测量TR‐FRET信号。Tb-SA、生物素化抗His、ABL1蛋白和BODIPY-dasatinib的最终浓度分别为0.2、0.4、0.38和4.5 nM。0和100%对照的值分别是在3μM达沙替尼存在和不存在的情况下获得的信号。

---

IAP/肽相互作用抑制活性的测定[1]
His-IAP蛋白（XIAP、cIAP1或cIAP2）、FITC-Smac、Tb-SA和生物素化抗His抗体在检测缓冲液中混合，在室温下孵育1小时以上，然后加入检测板。在分析板中分配了几种浓度的测试抑制剂，并将蛋白质探针预混物分配到每个孔中。所有测定均使用0.6 nM的IAP蛋白进行。FITC-Smac的浓度描述如下：XIAP为27 nM，cIAP1为12 nM，而cIAP2为19 nM。Tb-SA和生物素化抗His抗体的最终浓度分别为0.2和0.4 nM。在室温下孵育1小时后，使用EnVision多标签平板阅读器测量TR‐FRET信号。0和100%对照的值分别是在IAP蛋白存在和不存在的情况下获得的信号。

细胞活力测定[1]
根据制造商的说明，使用水溶性四唑WST-8（4-[3-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-2-（4-硝基苯基）-2H-5-四唑基]-1,3-苯二磺酸盐）进行分光光度测定，以确定细胞存活率。细胞以每孔5×103个细胞的浓度接种在96孔培养板上。24小时后，用指定化合物处理细胞48小时。加入WST-8试剂，在37°C、5%CO2的加湿气氛中孵育细胞0.5小时[1]。

[1]. Development of protein degradation inducers of oncogenic BCR-ABL protein by conjugation of ABL kinase inhibitors and IAP ligands. Cancer Sci. 2017 Aug;108(8):1657-1666.

In this study, we tested various combinations of ABL inhibitors and IAP ligands to develop SNIPER(ABL) that induces the degradation of oncogenic kinase BCR‐ABL, and the linker length was optimized for the activity. We found that SNIPER(ABL)‐39, in which dasatinib is conjugated to an LCL161 derivative with PEG × 3 linker, shows the most potent activity to degrade the BCR‐ABL protein. SNIPER(ABL)‐39 showed an effective protein knockdown activity at 10 nM and the maximum activity was observed at 100 nM. Notably, the protein knockdown activity was rather attenuated at higher concentrations of SNIPER(ABL)‐39 (Fig. 2c). This is known as a high‐dose hook effect, where a certain pharmaceutical activity is interfered with higher concentration of drugs. We speculate that formation of ternary complex consisting of BCR‐ABL/SNIPER(ABL)‐39/IAP required for the protein knockdown activity would be suppressed by higher concentrations of SNIPER(ABL)‐39, and, therefore, the protein knockdown activity is attenuated.[1]

With respect to the small compounds that induce the degradation of BCR‐ABL protein, PROTAC against BCR‐ABL were reported by conjugation of dasatinib to a von Hippel‐Lindau (VHL) E3 ligase ligand or a thalidomide derivative, pomalidomide, that is a ligand for Cereblon (CRBN) E3 ligase.32 Interestingly, CRBN‐based PROTAC can reduce BCR‐ABL protein at 25 nM, whereas VHL‐based PROTAC cannot. Because IAP‐based SNIPER(ABL) can induce the degradation of BCR‐ABL protein, it is suggested that IAP and CRBN are appropriate E3 ligases to degrade BCR‐ABL protein when dasatinib is incorporated as a ligand for BCR‐ABL protein. Probably, SNIPER(ABL)‐39 and CRBN‐based PROTAC can recruit E3 ligases to an appropriate position so that the lysine residues on the surface of BCR‐ABL can be ubiquitylated. Thus, the combination of an E3 ligase ligand and a target ligand is critically important to develop the degradation inducers such as SNIPER and PROTAC.[1]

Consistent with the degradation of BCR‐ABL protein, SNIPER(ABL)‐39 inhibited the BCR‐ABL‐related signaling pathway and proliferation of BCR‐ABL positive CML, such as K562, KCL‐22 and KU812 cell, expressing native BCR‐ABL protein. However, in SK‐9 cells expressing T315I mutant BCR‐ABL protein, SNIPER(ABL)‐39 did not reduce the BCR‐ABL protein nor inhibit cell proliferation. This may be attributed that SNIPER(ABL)‐39 could not bind to the T315I mutant BCR‐ABL protein, because the T315I is a gatekeeper mutation that prevents the binding of dasatinib.39, 42 However, BCR‐ABL protein has multiple domains, such as pleckstrin homology, Src homology (SH) 2 and SH3 domains, to which novel ligands could be developed. Incorporation of such ligands into SNIPER would allow us to develop a novel SNIPER(ABL) that can induce the degradation of BCR‐ABL proteins resistant to kinase inhibitors, which could be a novel strategy to overcome drug resistance against kinase inhibitors.[1]

C21H22CLN7O2S

471.96

471.12

C, 53.44; H, 4.70; Cl, 7.51; N, 20.77; O, 6.78; S, 6.79

2112837-79-1

863127-77-9 (hydrate);302962-49-8 (free);2112837-79-1 (cabaldehyde);910297-52-8 (N-oxide);

138377562

White to off-white solid powder

3.7

132Ų

2

8

5

32

654

0

C1C(C)=C(C(=CC=1)Cl)NC(C1SC(NC2=CC(=NC(C)=N2)N2CCN(CC2)C=O)=NC=1)=O

BKDGDNUWAYNWBA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H22ClN7O2S/c1-13-4-3-5-15(22)19(13)27-20(31)16-11-23-21(32-16)26-17-10-18(25-14(2)24-17)29-8-6-28(12-30)7-9-29/h3-5,10-12H,6-9H2,1-2H3,(H,27,31)(H,23,24,25,26)

N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-((6-(4-formylpiperazin-1-yl)-2-methylpyrimidin-4-yl)amino)thiazole-5-carboxamide

Dasatinib carbaldehyde; 2112837-79-1; 5-Thiazolecarboxamide, N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-(4-formyl-1-piperazinyl)-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]- (ACI); N-(2-Chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-(4-formyl-1-piperazinyl)-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazolecarboxamide (ACI); SCHEMBL21340693;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~33.33 mg/mL (~70.62 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。