| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 1mg |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
OTUB1
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| 体外研究 (In Vitro) |
许多疾病是由异常泛素化和降解的蛋白质引起的。靶向蛋白稳定化（TPS）对这些疾病的治疗有益。在这里，我们提出了去泛素酶靶向嵌合体（DUBTACs），这是一种由与蛋白质靶向配体连接的去泛素蛋白募集子组成的异双功能小分子，用于稳定以泛素依赖方式降解的特定蛋白质的水平。使用化学蛋白质组学方法，我们发现了共价配体EN523，其靶向K48泛素特异性去泛素酶OTUB1中的非催化变构半胱氨酸C23。我们发现，由我们的EN523 OTUB1招募者组成的DUBTAC与lumacaftor（一种用于治疗囊性纤维化的药物，结合ΔF508囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR））连接，能够稳定ΔF508-CFTR蛋白水平，从而改善人囊性纤维化支气管上皮细胞的氯通道电导。我们还证明了肝癌细胞中肿瘤抑制激酶WEE1的稳定性。我们的研究展示了共价化学蛋白质组学方法，以开发新的基于诱导邻近的治疗方式，并介绍了用于TPS的DUBTAC平台。[1]
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| 体内研究 (In Vivo) |
许多疾病是由异常泛素化和降解的蛋白质引起的。靶向蛋白稳定化（TPS）对这些疾病的治疗有益。在这里，我们提出了去泛素酶靶向嵌合体（DUBTACs），这是一种由与蛋白质靶向配体连接的去泛素蛋白募集子组成的异双功能小分子，用于稳定以泛素依赖方式降解的特定蛋白质的水平。使用化学蛋白质组学方法，我们发现了共价配体EN523，其靶向K48泛素特异性去泛素酶OTUB1中的非催化变构半胱氨酸C23。我们发现，由我们的EN523 OTUB1招募者组成的DUBTAC与lumacaftor（一种用于治疗囊性纤维化的药物，结合ΔF508囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR））连接，能够稳定ΔF508-CFTR蛋白水平，从而改善人囊性纤维化支气管上皮细胞的氯通道电导。我们还证明了肝癌细胞中肿瘤抑制激酶WEE1的稳定性。我们的研究展示了共价化学蛋白质组学方法，以开发新的基于诱导邻近的治疗方式，并介绍了用于TPS的DUBTAC平台。[1]
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| 酶活实验 |
凝胶基ABPP[1]
重组OTUB1（0.1μg/样品）在37°C下用DMSO载体或共价配体或DUBTACs在25μL PBS中预处理30分钟，随后在室温下用IA罗丹明（浓度如图例所示）处理1小时。通过加入4×还原Laemmli-SDS样品加载缓冲液停止反应。在95°C下煮沸5分钟后，将样品在预制的4-20%Criterion TGX凝胶上分离。使用ChemiDoc MP通过凝胶内荧光分析探针标记的蛋白质。 NJH-2-057重组OTUB1的探针标记[1] 每个重复的每个样品的重组和纯OTUB1蛋白（0.5μg）悬浮在50μL总PBS中。加入1μL DMSO或NJH-2-075（最终浓度为50、10、1和0.1μM），然后在37°C下孵育1.5小时。接下来，向每个样品中加入7.8μL由9.4μL 5mM叠氮氟545（在DMSO中）、112μL TBTA配体（在4份叔丁醇+1份DMSO中储备1.7 mM）、37.5μL 50 mM TCEP（在水中）和37.5μL 50 mM硫酸铜（II）组成的溶液，并在室温下孵育样品1小时。在CuAAC之后，向每个样品中加入30μL Laemmli样品缓冲液（4 x），涡旋并在95°C下煮沸6分钟。将样品装载在SDS/PAGE凝胶上，并分析凝胶内荧光。 双泛素酶活性测定[1] 先前描述的方法用于评估EN523对OTUB1活性的影响23。将重组OTUB1（500 nM）与DMSO或EN523（50μM）预孵育1小时。为了启动检测，将预处理的OTUB1酶与di-Ub反应混合物1:1混合，使最终浓度为250 nM OTUB1、1.5μM di-Ub、12.5μM UBE2D1和5 mM DTT。通过移除一部分反应混合物并加入Laemmli缓冲液以终止反应，随着时间的推移通过蛋白质印迹监测单-Ub的出现。所示印迹是来自n=3个生物独立实验/组的代表性凝胶。 EN523-OTUB1相互作用的生物核磁共振分析[1] 我们在Bruker 600 MHz光谱仪上记录了所有NMR光谱，该光谱仪配备了一个带z梯度的5 mm QCI-F冷冻探针，并在所有实验中保持温度恒定在298K。为了探究化合物和E2连接酶与OTUB1的结合，我们记录了1H-1D和13C-SOFAST-HMQC实验。我们使用填充有160μL 50μM的3mm NMR管{U}-2H1H/13C-甲基Ile/Leu/Val/Ala（ILVA），{U}-15N标记的OTUB1、25 mM d-Tris、pH 7.5、150 mM NaCl、5%D2O（锁定）、100μM DSS（内标）、75μM EN-523（溶解在100%d6 DMSO中；用于化合物结合研究）和/或100μM E2 D2/Ub-E2 D2（用于连接酶结合研究）。为了使化合物与OTUB1完全结合，我们选择了约40小时的潜伏期。我们还用足够体积的纯d6-DMSO和/或E2缓冲液记录了参考光谱，以补偿溶剂诱导的效应，并在40小时后重复实验，以确保任何光谱变化都与蛋白质氧化无关。 |
| 细胞实验 |
用NJH-2-075探针标记HEK293T细胞中的内源性OTUB1[1]
用DMSO载体或NJH-02-075（50μM）处理每种条件下每个重复的70%融合HEK293T细胞板2小时。通过刮擦收集细胞，将其悬浮在600μL PBS中，通过探针超声裂解，并在5000 rpm下离心10分钟以去除碎片。将裂解物标准化为3.1 mg/mL，去除85μL用于输入的蛋白质印迹分析。然后将500μL裂解物在室温下与10μL 5 mM生物素-吡啶基叠氮化物（水溶液）、10μL 50mM TCEP（水中）、30μL TBTA配体（4份叔丁醇+1份DMSO中的1.7 mM储备）和10μL 50 mM硫酸铜（II）一起孵育1小时。在CuAAC之后，用冷甲醇洗涤沉淀的蛋白质3次，并将其重新溶解在200μL 1.2%SDS/PBS中。为了确保溶解性，在重新悬浮后将蛋白质加热至90°C 5分钟。然后向每个样品中加入1 mL PBS，然后加入50μL高容量链霉抗生物素蛋白珠。然后将样品在4°C的摇杆上孵育过夜。第二天早上，将样品加热至室温，用3次PBS洗涤和3次水洗洗掉非特异性结合蛋白。然后将珠子重新悬浮在100μL PBS和30μL Laemmli样品缓冲液（4 x）中，并在95°C下煮沸13分钟。将样品涡旋并与保存的输入样品一起装载到SDS-PAGE凝胶上，用于蛋白质印迹分析。 蛋白质印迹[1] 蛋白质通过SDS-PAGE分离，并使用Trans-Blot Turbo转移系统转移到硝化纤维膜上。在室温下，用含吐温20（TBS-T）的Tris缓冲盐水中的5%BSA封闭膜30分钟，在TBS-T中洗涤，并在4°C下用制造商推荐的稀释剂稀释的一抗探测过夜。用TBS-T洗涤3次后，在室温下用IR680或IR800偶联的二抗在TBS-T中5%BSA中以1:10000的稀释度在黑暗中孵育1小时。用TBST再洗涤3次，用Odyssey Li-Cor荧光扫描仪观察印迹。当进行额外的一抗孵育时，使用ReBlot Plus强抗体剥离溶液剥离膜。 |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
在本研究中，我们发现了一种共价小分子募集剂EN523，它能够募集K48泛素链特异性去泛素化酶OTUB1。我们证明，通过将DUB募集剂与蛋白质靶向配体连接，可以将该募集剂整合到全合成的异双功能DUBTAC中，从而实现对细胞内活性降解靶蛋白的靶向降解（TPS）。我们展示了两个成功的TPS实例，分别使用ΔF508-CFTR和WEE1。对于ΔF508-CFTR，我们还证明，与lumacaftor和ivacaftor处理相比，我们的DUBTAC与增强剂ivacaftor联合使用，不仅提高了突变蛋白的水平，还改善了CFTR的细胞表面氯离子通道电导。虽然我们在此展示了DUBTAC平台的初步验证，但仍有许多方向值得未来探索。这些研究包括进一步优化针对OTUB1的DUB募集剂，以提高其效力和蛋白质组范围内的选择性，以及发现针对其他候选DUB的新型募集剂。为了探索CFTR DUBTAC的优化，进一步改进lumacaftor与DUB募集剂之间的连接子可以提高效力和CFTR的稳定性。此外，阐明CFTR与OTUB1之间形成的三元复合物的机制、结构基础和动力学，以及了解DUBTAC如何使CFTR去泛素化，也至关重要。此外，更好地了解我们是否会干扰内源性OTUB1的功能，对于理解DUBTAC的作用机制和安全性也至关重要。[1]
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| 分子式 |
C12H14N2O3
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|---|---|
| 分子量 |
234.25
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| 精确质量 |
234.1
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| CAS号 |
2094893-05-5
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| PubChem CID |
126817009
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| 外观&性状 |
Typically exists as White to off-white solids at room temperature
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| LogP |
1
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| tPSA |
53.8Ų
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| 氢键供体(HBD)数目 |
0
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
3
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| 可旋转键数目(RBC) |
2
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| 重原子数目 |
17
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| 分子复杂度/Complexity |
343
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
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| InChi Key |
KYXPDOMFYBFXKO-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C12H14N2O3/c1-3-10(15)13-6-7-14(11(16)8-13)12-5-4-9(2)17-12/h3-5H,1,6-8H2,2H3
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| 化学名 |
1-(5-methylfuran-2-yl)-4-prop-2-enoylpiperazin-2-one
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| 别名 |
1-(5-methylfuran-2-yl)-4-(prop-2-enoyl)piperazin-2-one; 4-Acryloyl-1-(5-methyl-2-furyl)piperazin-2-one; EX-A6269; MFCD32859220; AKOS040760003;
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month 注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。 |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : ~250 mg/mL (~1067.24 mM)
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 4.2689 mL | 21.3447 mL | 42.6894 mL | |
| 5 mM | 0.8538 mL | 4.2689 mL | 8.5379 mL | |
| 10 mM | 0.4269 mL | 2.1345 mL | 4.2689 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
AOH-1996
hMAO-B-IN-3
Flupyrimin
阿曲库铵
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