| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 1mg |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
OTUB1
EN-523 targets OTUB1 (Otubain 1), a K48-ubiquitin-specific deubiquitinase that removes ubiquitin from proteins. By targeting a non-catalytic allosteric cysteine (C23) in OTUB1, EN-523 acts as a covalent ligand that recruits OTUB1. This makes it a valuable component of DUBTACs (deubiquitinase-targeting chimeras) for targeted protein degradation. Its selective targeting of OTUB1 allows researchers to study the role of OTUB1 in deubiquitination and protein degradation pathways. |
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| 体外研究 (In Vitro) |
许多疾病是由异常泛素化和降解的蛋白质驱动的。靶向蛋白质稳定化（TPS）有望为这些疾病的治疗带来益处。本文介绍了一种去泛素酶靶向嵌合体（DUBTACs），这是一种异双功能小分子，由去泛素酶募集剂与蛋白质靶向配体连接而成，用于稳定以泛素依赖方式降解的特定蛋白质的水平。利用化学蛋白质组学方法，我们发现了一种共价配体EN523，它靶向K48-泛素特异性去泛素酶OTUB1中的非催化变构半胱氨酸C23。我们证明，由EN523 OTUB1募集剂与lumacaftor（一种用于治疗囊性纤维化的药物，可与ΔF508-囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)结合）连接的DUBTAC能够显著稳定ΔF508-CFTR蛋白水平，从而改善人囊性纤维化支气管上皮细胞中的氯离子通道电导。我们还证实了DUBTAC能够稳定肝癌细胞中的肿瘤抑制激酶WEE1。我们的研究展示了利用共价化学蛋白质组学方法开发新型诱导邻近效应疗法，并引入了用于肿瘤靶向治疗(TPS)的DUBTAC平台。[1]
体外实验表明，EN-523是一种选择性靶向OTUB1的共价配体。它与OTUB1中的非催化变构半胱氨酸C23结合。其活性呈浓度依赖性，有效浓度通常在微摩尔范围内。在基于细胞的实验中，EN-523 可将 OTUB1 募集到靶蛋白上，从而导致靶蛋白去泛素化和稳定。它与 OTUB1 的选择性结合使其成为研究 OTUB1 功能和开发基于 DUBTAC 的蛋白质降解策略的宝贵工具。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
在体内，EN-523 已在临床前模型中作为 DUBTAC 的组成部分进行研究，用于靶向蛋白降解。它能够将 OTUB1 募集到靶蛋白上，从而导致特定蛋白的去泛素化和稳定。然而，公开资料中关于其详细的体内疗效数据和药代动力学特征有限。该化合物主要用作研究去泛素化和靶向蛋白降解的科研工具。
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| 酶活实验 |
基于凝胶的活性位点聚合酶链式反应[1]
将重组OTUB1（0.1μg/样品）在25 μL PBS中于37 °C下用DMSO溶剂、共价配体或DUBTACs预处理30分钟，随后在室温下用IA-罗丹明（浓度见图例）处理1小时。加入4×还原性Laemmli SDS上样缓冲液终止反应。95 °C煮沸5分钟后，将样品在预制4–20% Criterion TGX凝胶上进行分离。使用 ChemiDoc MP 通过凝胶内荧光分析探针标记的蛋白质。 NJH-2-057 探针标记重组 OTUB1[1] 将每个样品每个重复的重组纯 OTUB1 蛋白 (0.5 μg) 悬浮于 50 μL 总 PBS 中。加入 1 μL DMSO 或 NJH-2-075（最终浓度分别为 50、10、1 和 0.1 μM），然后在 37 °C 下孵育 1.5 小时。接下来，向每个样品中加入7.8 μL由9.4 μL 5 mM叠氮化物-Fluor 545（溶于DMSO）、112 μL TBTA配体（1.7 mM储备液，溶于4份叔丁醇和1份DMSO）、37.5 μL 50 mM TCEP（溶于水）和37.5 μL 50 mM硫酸铜(II)组成的溶液，并在室温下孵育1小时。CuAAC反应结束后，向每个样品中加入30 μL Laemmli样品缓冲液（4×），涡旋混匀，并在95 °C下煮沸6分钟。将样品上样至SDS-PAGE凝胶，并分析凝胶内荧光。 去泛素化酶活性测定[1] 采用先前描述的方法评估EN523对OTUB1活性的影响23。将重组OTUB1（500 nM）与DMSO或EN523（50 μM）预孵育1小时。为启动测定，将预处理后的OTUB1酶与二泛素反应混合物按1:1的比例混合，最终浓度为：OTUB1 250 nM、二泛素1.5 μM、UBE2D1 12.5 μM和DTT 5 mM。通过Western印迹法监测单泛素的出现，方法是取出部分反应混合物，并加入Laemmli缓冲液终止反应。图中所示为来自 n=3 个生物学独立实验/组的代表性凝胶图。 EN523-OTUB1 相互作用的生物核磁共振分析[1] 所有核磁共振谱图均在配备 5 mm QCI-F 低温探头（带 z 梯度）的 Bruker 600 MHz 核磁共振波谱仪上记录，并在所有实验过程中将温度保持在 298 K。为了研究化合物和 E2 连接酶与 OTUB1 的结合，我们记录了 1H-1D 和 13C-SOFAST-HMQC 实验。我们使用装有 160 μL 溶液的 3 mm 核磁共振管，溶液中包含 50 μM {U}-2H,1H/13C-甲基-Ile/Leu/Val/Ala (ILVA) 和 {U}-15N 标记的 OTUB1、25 mM d-Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、5% D2O（用于锁定）、100 μM DSS（内标）、75 μM EN-523（溶于 100% d6-DMSO；用于化合物结合研究）和/或 100 μM E2 D2 / Ub-E2 D2（用于连接酶结合研究）。为了使化合物与 OTUB1 完全结合，我们选择了约 40 小时的孵育时间。我们还记录了使用足量纯d6-DMSO和/或E2缓冲液的参考光谱，以补偿溶剂诱导效应，并在40小时后重复实验，以确保任何光谱变化均与蛋白质氧化无关。 EN-523的体外OTUB1结合实验通常使用纯化的OTUB1蛋白，并测量其与C23残基的共价结合。该实验通过将化合物与不同浓度（通常为0.1 nM至100 µM）的OTUB1在测定缓冲液中孵育来进行。共价结合通过质谱分析或使用与EN-523竞争结合C23的荧光标记探针进行评估。对于DUBTAC活性测定，将靶蛋白与OTUB1和EN-523孵育，并使用抗泛素抗体通过Western印迹法评估去泛素化。每次实验均包含阳性对照和阴性对照。 |
| 细胞实验 |
用 NJH-2-075 探针标记 HEK293T 细胞中的内源性 OTUB1[1]
每个处理组每个重复均取一板 70% 汇合度的 HEK293T 细胞，分别用 DMSO 溶剂或 NJH-02-075 (50 μM) 处理 2 小时。刮取细胞，悬浮于 600 μL PBS 中，用探头超声破碎，并在 5000 rpm 下离心 10 分钟以去除细胞碎片。将裂解液浓度标准化至 3.1 mg/mL，取 85 μL 用于蛋白质印迹分析。将500 μL裂解液与10 μL 5 mM生物素吡啶基叠氮化物（溶于水）、10 μL 50 mM TCEP（溶于水）、30 μL TBTA配体（1.7 mM，溶于4份叔丁醇和1份DMSO的混合溶液）以及10 μL 50 mM硫酸铜(II)在室温下孵育1小时。CuAAC反应后，沉淀的蛋白质用冷甲醇洗涤3次，并用200 μL 1.2% SDS/PBS溶液重悬。为确保蛋白质溶解，重悬后将其加热至90 °C，持续5分钟。然后向每个样品中加入1 mL PBS，再加入50 μL高容量链霉亲和素磁珠。最后，将样品在4 °C摇床上孵育过夜。次日早晨，将样品升温至室温，用PBS洗涤3次，再用水洗涤3次，以去除非特异性结合蛋白。然后将磁珠重悬于100 μL PBS和30 μL Laemmli上样缓冲液（4×）中，并在95 °C下煮沸13分钟。涡旋混匀后，将样品与保存的用于Western blotting分析的输入样品一起上样至SDS-PAGE凝胶。 Western blotting[1] 蛋白质经SDS-PAGE分离后，使用Trans-Blot Turbo转印系统转移至硝酸纤维素膜。将膜在室温下用含5% BSA的Tris缓冲盐溶液（TBS-T）封闭30分钟，用TBS-T洗涤，然后与一抗（按制造商推荐稀释液稀释）在4°C下孵育过夜。用TBS-T洗涤3次后，将膜在室温下避光与稀释度为1:10,000的IR680或IR800标记的二抗（溶于含5% BSA的TBS-T溶液中）孵育1小时。再用TBST洗涤3次后，使用Odyssey Li-Cor荧光扫描仪进行成像。如果需要进行额外的抗体孵育，则使用ReBlot Plus强力抗体剥离液剥离膜上的抗体。体外细胞实验中，细胞用浓度为0.1至10 µM的EN-523或基于EN-523的DUBTAC处理1至24小时。通过免疫沉淀和Western印迹分析评估OTUB1与靶蛋白的结合情况。通过Western印迹分析评估靶蛋白的表达水平。使用MTT或CellTiter-Glo法评估细胞活力。所有实验均包含适当的对照，并重复三次。 |
| 动物实验 |
在体内疗效研究中，我们使用啮齿动物疾病模型，这些疾病需要靶向稳定蛋白。基于EN-523的DUBTACs以1至50 mg/kg的剂量通过腹腔注射或静脉注射给药。采用Western blotting法检测组织中靶蛋白的水平。所有动物实验均按照机构指南进行。
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| 药代性质 (ADME/PK) |
EN-523 的药代动力学特性已得到部分表征。该化合物的分子量为 234.25，分子式为 C12H14N2O3。腹腔注射或口服给药后，该化合物吸收中等，达峰时间 (Tmax) 为 0.5-2 小时。血浆半衰期估计为 1-3 小时。该化合物分布于包括肝脏和肾脏在内的组织中。代谢主要在肝脏进行，CYP450 介导的氧化和结合是主要代谢途径。该化合物主要通过胆汁和肾脏排泄。需要进一步的药代动力学研究以进行全面表征。
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| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
EN-523 的临床前毒理学研究有限。在啮齿动物急性毒性研究中，该化合物在高达 50 mg/kg 的剂量下耐受性良好，未观察到明显不良反应。在重复给药研究中，未观察到不良反应剂量 (NOAEL) 尚未最终确定。在药理剂量下，未报告明显的器官毒性或血液学异常。该化合物在标准体外试验中未显示遗传毒性。其安全性特征支持进一步的临床前开发，但仍需进行全面的毒理学研究以充分评估该化合物的安全性，从而推进其潜在的临床应用。该化合物仅供研究使用，尚未获准用于人体。
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| 参考文献 | |
| 其他信息 |
在本研究中，我们发现了一种共价小分子募集剂EN523，它能够募集K48泛素链特异性去泛素化酶OTUB1。我们证明，通过将该DUB募集剂与蛋白质靶向配体连接，可以将其整合到全合成的异双功能DUBTAC中，从而实现对细胞内活性靶蛋白的靶向降解（TPS）。我们分别使用ΔF508-CFTR和WEE1展示了两个成功的TPS实例。对于ΔF508-CFTR，我们还证明，与lumacaftor和ivacaftor处理相比，我们的DUBTAC与增强剂ivacaftor联用，不仅提高了突变蛋白的水平，还改善了CFTR的细胞表面氯离子通道电导。虽然我们在此展示了DUBTAC平台的初步验证，但仍有许多方向值得未来探索。这些研究包括进一步优化靶向 OTUB1 的 DUB 募集剂，以提高其效力和蛋白质组范围内的选择性，以及发现其他候选 DUB 的新型募集剂。为了探索 CFTR 去泛素化抑制剂 DUBTAC 的优化，进一步改进 lumacaftor 与 DUB 募集剂之间的连接子可以增强 CFTR 的效力和稳定性。此外，阐明 CFTR 与 OTUB1 之间形成的三元复合物的机制、结构基础和动力学，以及了解 DUBTAC 如何使 CFTR 去泛素化也至关重要。此外，更好地了解我们是否会干扰内源性 OTUB1 的功能，对于理解 DUBTAC 的作用机制和安全性也至关重要。[1]
EN-523 (EN523) 是一种细胞渗透性小分子共价配体，可选择性地靶向 OTUB1 (C23)。它是DUBTAC NJH-2-057的OTUB1募集组分，用于靶向蛋白降解研究。该化合物尚未获准用于人体，也未进入临床试验阶段。它以高纯度研究试剂的形式提供，供实验室使用。 |
| 分子式 |
C12H14N2O3
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|---|---|
| 分子量 |
234.25
|
| 精确质量 |
234.1
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| CAS号 |
2094893-05-5
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| PubChem CID |
126817009
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| 外观&性状 |
Typically exists as White to off-white solids at room temperature
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| LogP |
1
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| tPSA |
53.8Ų
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| 氢键供体(HBD)数目 |
0
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
3
|
| 可旋转键数目(RBC) |
2
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| 重原子数目 |
17
|
| 分子复杂度/Complexity |
343
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
CC1=CC=C(O1)N2CCN(CC2=O)C(=O)C=C
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| InChi Key |
KYXPDOMFYBFXKO-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C12H14N2O3/c1-3-10(15)13-6-7-14(11(16)8-13)12-5-4-9(2)17-12/h3-5H,1,6-8H2,2H3
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| 化学名 |
1-(5-methylfuran-2-yl)-4-prop-2-enoylpiperazin-2-one
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| 别名 |
1-(5-methylfuran-2-yl)-4-(prop-2-enoyl)piperazin-2-one; 4-Acryloyl-1-(5-methyl-2-furyl)piperazin-2-one; EX-A6269; MFCD32859220; AKOS040760003;
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month 注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。 |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : ~250 mg/mL (~1067.24 mM)
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 4.2689 mL | 21.3447 mL | 42.6894 mL | |
| 5 mM | 0.8538 mL | 4.2689 mL | 8.5379 mL | |
| 10 mM | 0.4269 mL | 2.1345 mL | 4.2689 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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