EN-523

OTUB1

许多疾病是由异常泛素化和降解的蛋白质引起的。靶向蛋白稳定化（TPS）对这些疾病的治疗有益。在这里，我们提出了去泛素酶靶向嵌合体（DUBTACs），这是一种由与蛋白质靶向配体连接的去泛素蛋白募集子组成的异双功能小分子，用于稳定以泛素依赖方式降解的特定蛋白质的水平。使用化学蛋白质组学方法，我们发现了共价配体EN523，其靶向K48泛素特异性去泛素酶OTUB1中的非催化变构半胱氨酸C23。我们发现，由我们的EN523 OTUB1招募者组成的DUBTAC与lumacaftor（一种用于治疗囊性纤维化的药物，结合ΔF508囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR））连接，能够稳定ΔF508-CFTR蛋白水平，从而改善人囊性纤维化支气管上皮细胞的氯通道电导。我们还证明了肝癌细胞中肿瘤抑制激酶WEE1的稳定性。我们的研究展示了共价化学蛋白质组学方法，以开发新的基于诱导邻近的治疗方式，并介绍了用于TPS的DUBTAC平台。[1]

许多疾病是由异常泛素化和降解的蛋白质引起的。靶向蛋白稳定化（TPS）对这些疾病的治疗有益。在这里，我们提出了去泛素酶靶向嵌合体（DUBTACs），这是一种由与蛋白质靶向配体连接的去泛素蛋白募集子组成的异双功能小分子，用于稳定以泛素依赖方式降解的特定蛋白质的水平。使用化学蛋白质组学方法，我们发现了共价配体EN523，其靶向K48泛素特异性去泛素酶OTUB1中的非催化变构半胱氨酸C23。我们发现，由我们的EN523 OTUB1招募者组成的DUBTAC与lumacaftor（一种用于治疗囊性纤维化的药物，结合ΔF508囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR））连接，能够稳定ΔF508-CFTR蛋白水平，从而改善人囊性纤维化支气管上皮细胞的氯通道电导。我们还证明了肝癌细胞中肿瘤抑制激酶WEE1的稳定性。我们的研究展示了共价化学蛋白质组学方法，以开发新的基于诱导邻近的治疗方式，并介绍了用于TPS的DUBTAC平台。[1]

凝胶基ABPP[1]
重组OTUB1（0.1μg/样品）在37°C下用DMSO载体或共价配体或DUBTACs在25μL PBS中预处理30分钟，随后在室温下用IA罗丹明（浓度如图例所示）处理1小时。通过加入4×还原Laemmli-SDS样品加载缓冲液停止反应。在95°C下煮沸5分钟后，将样品在预制的4-20%Criterion TGX凝胶上分离。使用ChemiDoc MP通过凝胶内荧光分析探针标记的蛋白质。

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NJH-2-057重组OTUB1的探针标记[1]
每个重复的每个样品的重组和纯OTUB1蛋白（0.5μg）悬浮在50μL总PBS中。加入1μL DMSO或NJH-2-075（最终浓度为50、10、1和0.1μM），然后在37°C下孵育1.5小时。接下来，向每个样品中加入7.8μL由9.4μL 5mM叠氮氟545（在DMSO中）、112μL TBTA配体（在4份叔丁醇+1份DMSO中储备1.7 mM）、37.5μL 50 mM TCEP（在水中）和37.5μL 50 mM硫酸铜（II）组成的溶液，并在室温下孵育样品1小时。在CuAAC之后，向每个样品中加入30μL Laemmli样品缓冲液（4 x），涡旋并在95°C下煮沸6分钟。将样品装载在SDS/PAGE凝胶上，并分析凝胶内荧光。

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双泛素酶活性测定[1]
先前描述的方法用于评估EN523对OTUB1活性的影响23。将重组OTUB1（500 nM）与DMSO或EN523（50μM）预孵育1小时。为了启动检测，将预处理的OTUB1酶与di-Ub反应混合物1:1混合，使最终浓度为250 nM OTUB1、1.5μM di-Ub、12.5μM UBE2D1和5 mM DTT。通过移除一部分反应混合物并加入Laemmli缓冲液以终止反应，随着时间的推移通过蛋白质印迹监测单-Ub的出现。所示印迹是来自n=3个生物独立实验/组的代表性凝胶。

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EN523-OTUB1相互作用的生物核磁共振分析[1]
我们在Bruker 600 MHz光谱仪上记录了所有NMR光谱，该光谱仪配备了一个带z梯度的5 mm QCI-F冷冻探针，并在所有实验中保持温度恒定在298K。为了探究化合物和E2连接酶与OTUB1的结合，我们记录了1H-1D和13C-SOFAST-HMQC实验。我们使用填充有160μL 50μM的3mm NMR管{U}-2H1H/13C-甲基Ile/Leu/Val/Ala（ILVA），{U}-15N标记的OTUB1、25 mM d-Tris、pH 7.5、150 mM NaCl、5%D2O（锁定）、100μM DSS（内标）、75μM EN-523（溶解在100%d6 DMSO中；用于化合物结合研究）和/或100μM E2 D2/Ub-E2 D2（用于连接酶结合研究）。为了使化合物与OTUB1完全结合，我们选择了约40小时的潜伏期。我们还用足够体积的纯d6-DMSO和/或E2缓冲液记录了参考光谱，以补偿溶剂诱导的效应，并在40小时后重复实验，以确保任何光谱变化都与蛋白质氧化无关。

用NJH-2-075探针标记HEK293T细胞中的内源性OTUB1[1]
用DMSO载体或NJH-02-075（50μM）处理每种条件下每个重复的70%融合HEK293T细胞板2小时。通过刮擦收集细胞，将其悬浮在600μL PBS中，通过探针超声裂解，并在5000 rpm下离心10分钟以去除碎片。将裂解物标准化为3.1 mg/mL，去除85μL用于输入的蛋白质印迹分析。然后将500μL裂解物在室温下与10μL 5 mM生物素-吡啶基叠氮化物（水溶液）、10μL 50mM TCEP（水中）、30μL TBTA配体（4份叔丁醇+1份DMSO中的1.7 mM储备）和10μL 50 mM硫酸铜（II）一起孵育1小时。在CuAAC之后，用冷甲醇洗涤沉淀的蛋白质3次，并将其重新溶解在200μL 1.2%SDS/PBS中。为了确保溶解性，在重新悬浮后将蛋白质加热至90°C 5分钟。然后向每个样品中加入1 mL PBS，然后加入50μL高容量链霉抗生物素蛋白珠。然后将样品在4°C的摇杆上孵育过夜。第二天早上，将样品加热至室温，用3次PBS洗涤和3次水洗洗掉非特异性结合蛋白。然后将珠子重新悬浮在100μL PBS和30μL Laemmli样品缓冲液（4 x）中，并在95°C下煮沸13分钟。将样品涡旋并与保存的输入样品一起装载到SDS-PAGE凝胶上，用于蛋白质印迹分析。

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蛋白质印迹[1]
蛋白质通过SDS-PAGE分离，并使用Trans-Blot Turbo转移系统转移到硝化纤维膜上。在室温下，用含吐温20（TBS-T）的Tris缓冲盐水中的5%BSA封闭膜30分钟，在TBS-T中洗涤，并在4°C下用制造商推荐的稀释剂稀释的一抗探测过夜。用TBS-T洗涤3次后，在室温下用IR680或IR800偶联的二抗在TBS-T中5%BSA中以1:10000的稀释度在黑暗中孵育1小时。用TBST再洗涤3次，用Odyssey Li-Cor荧光扫描仪观察印迹。当进行额外的一抗孵育时，使用ReBlot Plus强抗体剥离溶液剥离膜。

[1]. Deubiquitinase-targeting chimeras for targeted protein stabilization. Nat Chem Biol. 2022;18(4):412-421.

In this study, we discovered a covalent small-molecule recruiter EN523 for the K48-ubiquitin chain-specific DUB OTUB1. We demonstrated that this recruiter can be used incorporated into fully synthetic heterobifunctional DUBTACs by linking a DUB recruiter to protein targeting ligands to enable TPS of actively degraded target proteins in cells. We showed two successful examples of TPS with ΔF508-CFTR and WEE1. For ΔF508-CFTR, we also demonstrated that we not only heightened the levels of the mutant protein, but also improved cell surface chloride channel conductance of CFTR with our DUBTAC in combination with the potentiator ivacaftor, compared to lumacaftor and ivacaftor treatments. While we showed early validation of the DUBTAC platform here, there are many avenues for future exploration. These include further optimization of DUB recruiters against OTUB1 to improve their potency and proteome-wide selectivity, as well as the discovery of new recruiters against other candidate DUBs. For exploring optimization of CFTR DUBTACs, further improvement of the linker between lumacaftor and the DUB recruiter could improve potency and degree of CFTR stabilization. In addition, elucidating the mechanism, structural underpinnings, and kinetics in the formation of the ternary complex formed between CFTR and OTUB1 and understanding how CFTR is deubiquitinated by the DUBTAC will be important. Furthermore, better understanding of whether we are disrupting endogenous OTUB1 function would be important to understanding the mechanism and safety of DUBTACs.[1]

C12H14N2O3

234.25

234.1

2094893-05-5

126817009

Typically exists as White to off-white solids at room temperature

1

53.8Ų

0

3

2

17

343

0

KYXPDOMFYBFXKO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C12H14N2O3/c1-3-10(15)13-6-7-14(11(16)8-13)12-5-4-9(2)17-12/h3-5H,1,6-8H2,2H3

1-(5-methylfuran-2-yl)-4-prop-2-enoylpiperazin-2-one

1-(5-methylfuran-2-yl)-4-(prop-2-enoyl)piperazin-2-one; 4-Acryloyl-1-(5-methyl-2-furyl)piperazin-2-one; EX-A6269; MFCD32859220; AKOS040760003;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~1067.24 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。