EN106

FEMIB E3 ligase; covalent binding mode targeting cysteine

为了鉴定共价FEM1B招募者，我们使用TAMRA偶联的FNIP1562-591 degron和重组小鼠FEM1B在竞争性荧光偏振分析中筛选了566个半胱氨酸反应性共价配体库（图1a-1b，表S1）。通过这一筛选，我们鉴定出氯乙酰胺EN106，其抑制FEM1B-FNIP1 degron荧光偏振的50%抑制浓度（IC50）为2.2μM（图1c-1d）。从最初的筛选来看，EN106对FEM1B与FNIP1去旋器的相互作用显示出最显著的抑制作用（图1b）。EN106显示了与基于凝胶的ABPP用半胱氨酸反应性罗丹明共轭碘乙酰胺（IA罗丹明）探针标记FEM1B的竞争，证实了EN106与FEM1B上的半胱氨酸的直接相互作用（图1e）。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析FEM1B胰蛋白酶消化物，对EN106与重组FEM1B的反应性进行分析，结果显示EN106加合物仅存在于C186上，该位点先前被证明对FEM1B底物识别至关重要（图1f）。我们还证明了EN106的非反应性版本NJH-2-082不会抑制FEM1B与FNIP1 degron的相互作用，证实了半胱氨酸反应弹头与C186共价相互作用的重要性（图S1）。[1]

为了确认EN106在细胞中与FEM1B结合，我们合成了NJH-2-030，这是EN106的炔官能化衍生物（图2a）。为了保持C186的接合，通过将苯并二恶烷交换为二氢[1,4]苯并恶嗪支架，将炔烃定位在氯乙酰胺的远端。将起始苯并恶嗪进行Boc保护，得到1，然后还原硝基，得到苯胺2。2与丙烯腈烷基化得到丙腈取代的化合物，将其酰化得到氯乙酰胺3。Boc脱保护和用己-5-炔酰氯酰化提供了炔探针NJH-2-030（图2a）。[1]

为了评估EN106的蛋白质组范围半胱氨酸反应性，我们还进行了竞争性同位素串联正交蛋白水解ABPP（isoTOP ABPP）研究，以定量评估细胞中EN106在蛋白质组范围内的半胱氨酸反应性（图S2；表S2）。虽然我们在化学蛋白质组学实验中没有捕捉到FEM1B，但我们在1465个定量半胱氨酸中只观察到细胞中的两个EN106靶点——HNRNPA3的C63和PRDX3的C127（图S2）。EN106的这些非靶点都不是E3连接酶。鉴于我们在isoTOP ABPP实验中没有检测到FEM1B的C186，我们还在HEK293T细胞中原位使用NJH-2-030探针进行下拉定量蛋白质组学实验，以进一步确认这种紧密的EN106衍生物的靶点参与和蛋白质组范围内的选择性（图2d；表S3）。与DMSO对照组相比，FEM1B是NJH-2-030探针富集最显著的靶标之一，检测到另外四个非靶标——GSTO1、SNX6、SELO和NT5DC1——其中这些蛋白质都不是E3连接酶（图2d；表S3）。这些数据共同表明，EN106或其衍生物在细胞中与FEM1B功能性结合，对其他内源性降解途径成分没有可检测到的脱靶效应。[1]

为了进一步证明EN106破坏了FEM1B在细胞中的底物识别，我们通过流式细胞术监测了与FNIP1 degron连接的GFP的降解，并与HEK293T细胞中同一质粒的IRES驱动的mCherry表达进行了比较EN106处理在FEM1B过表达细胞中以剂量反应方式显著稳定了FNIP1 degron GFP水平，与赋形剂处理的对照组相比（图2e，f）。EN106在缺乏外源表达FEM1B的细胞中增加了FNIP1报告蛋白水平，其程度与之前在缺失FEM1B时观察到的相似，表明该化合物可以靶向内源性E3连接酶（图2e-2f）。EN106不影响E3连接酶cereblon对泊马度胺诱导的无关E4F1 degron的降解（图S3）。因此，这些发现表明EN106不仅参与，而且抑制CUL2FEM1B依赖性泛素化。FNIP1线粒体池的稳定会损害线粒体活性，如耗氧率所示。为了与内源性FEM1B结合并稳定FNIP1，我们发现EN106显著降低了HEK293T细胞中的细胞线粒体耗氧量（图2g）。[1]

为了证明EN106可以在TPD应用中用作共价FEM1B募集剂，我们接下来通过6个不同的连接体将EN106连接到靶向BRD4以及其他BET家族蛋白的BET溴结构域抑制剂JQ1，合成了一系列基于FEM1B的BET溴化结构域降解剂（图3a、图S5）。为了保持炔探针NJH-2-030的核心苯并恶嗪，我们首先连接了一个乙酸酯间隔物以提供甲酯4。硝基被还原，所得苯胺5用丙烯腈单烷基化，并酰化，得到氯乙酰胺中间体6。甲酯在温和的碱性条件下水解，并与具有不同连接体连接的胺7a-7f、JQ1衍生物偶联，得到双功能降解剂NJH-2-088、NJH-1-106、NJH-2-090、NJH-2.091、NJH2-092和NJH-2-02-093（NJH-1-106的方案如图3a所示；图S4）。这些化合物都在HEK293T细胞中不同程度地降解了BRD4，NJH-1-106显示出最佳的降解效力，DC50为250 nM，BRD4的最大降解率为94%（图3b-3c，图S4）。NJH-1-106对FNIP1 degron的FEM1B识别保持抑制活性，IC50为1.5μM（图3d）。这种BRD4降解是时间依赖性的，用NJH-1-106处理4小时后观察到显著降解（图3e-3f）。NJH-106还降解癌症细胞系中的BRD4，包括231MFP乳腺癌症和HAP1白血病癌症细胞系（图S5a–S5b）。[1]

与共价弹头的必要性一致，NJH-1-106、NJH-2-105的非反应性版本没有抑制FEM1B与FNIP1去旋器的相互作用，也没有降解BRD4（图S6a-S6d）。蛋白酶体和NED酰化抑制剂可以减轻BRD4的损失，这与BRD4降解的蛋白酶体和Cullin E3连接酶依赖机制一致（图4a-4b）。NJH-1-106处理HEK293T细胞后，FEM1B水平保持不变（图4a-4b）。用EN106或JQ1预处理细胞也会减弱BRD4的降解，这表明三元复合物和分子两端降解BRD4是必要的（图4c）。此外，与野生型（WT）细胞相比，FEM1B敲除（KO）细胞中的BRD4降解减弱，进一步证明了BRD4的FEM1B依赖性降解（图4d）。我们在FEM1B KO细胞中观察到的不完全拯救可能是由于FEM1B KO群体中残留的野生型细胞或其他潜在的脱靶E3连接酶。用NJH-1-106处理的HEK293T细胞的全球蛋白质组学分析也显示，在4446种定量蛋白质中，BRD4发生了选择性降解，只有大部分未鉴定的PNMAL1是明显的脱靶（图4e；表S4）。然而，PNMAL1可能是我们蛋白质组学分析的假阳性（图S7）。虽然JQ1是一种泛BET溴结构域抑制剂，但我们只观察到BRD4的降解，而没有观察到BRD2或BRD3的降解（表S4）。然而，我们不能排除这些其他溴结构域在较长时间的处理下会被降解。与蛋白质印迹数据相比，观察到的BRD4较小的折叠变化可能反映了基于TMT的定量蛋白质组学中众所周知的折叠变化抑制[1]。

凝胶基ABPP[1]
重组MBP-FEM1B1-377（0.1μg/样品）在25μL PBS中用DMSO载体或EN106或在37°C下预处理30分钟，随后在室温下用IA罗丹明（浓度如图例所示）处理1小时。通过加入4×还原Laemmli-SDS样品加载缓冲液停止反应。在95°C下煮沸5分钟后，将样品在预制的4-20%Criterion TGX凝胶上分离。使用ChemiDoc MP通过凝胶内荧光分析探针标记的蛋白质。

GFP-FNIP1 degron/mHerry的流式细胞术分析[1]
将HEK293T细胞/孔接种到6孔板中。第二天，用0.1μg pCS2-GFP-FNIP1562-591-IRES-mCherry或0.1μg的pCS2-E4F123432-GFP-IRES-mCherry转染细胞，如图所示，用0.075μg的pCS2-3xFLAG-FM1B转染。每次转染时，将空的pCS2加入到含有12μg聚乙烯亚胺（PEI）的300μl Opti-MEM中的2μg总DNA中。用65μl转染混合物转染每个孔。转染后12小时，加入指示浓度的EN106或DMSO。经过12小时的EN106处理后，细胞被胰蛋白酶消化，离心，重新悬浮在DMEM+10%FBS中，并在Fortessa X20上进行分析。使用FlowJo处理数据，所有定量均为GFP/mHerry比值的中位数。对于泊马度胺处理的细胞，在分析前加入10μM泊马度酰胺4小时。

[1]. Discovery of a Covalent FEM1B Recruiter for Targeted Protein Degradation Applications. J Am Chem Soc. 2022;144(2):701-708.

蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是一种异双功能化合物，由蛋白靶向配体与E3连接酶募集剂连接而成，已成为靶向蛋白降解（TPD）的一种强效治疗手段。尽管TPD方法在药物研发中应用广泛，但针对人类细胞中存在的600多种E3连接酶，目前可用的E3连接酶募集剂却寥寥无几。本文中，我们发现了一种半胱氨酸反应性共价配体EN106，它靶向FEM1B，一种近期被发现是细胞应对还原应激的关键组分的E3连接酶。EN106通过靶向FEM1B中的C186位点，干扰FEM1B对其关键还原应激底物FNIP1的识别。我们进一步证实，EN106 可作为 FEM1B 的共价募集剂用于 TPD 应用。我们证明，将 EN106 与 BET 溴结构域抑制剂 JQ1 或激酶抑制剂达沙替尼连接的 PROTAC 分别可导致 BRD4 和 BCR-ABL 的降解。我们的研究展示了一种靶向天然 E3 连接酶-底物结合位点的共价配体，并强调了共价配体筛选在扩展适用于 TPD 应用的 E3 连接酶募集剂库方面的实用性。[1]

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在本研究中，我们发现了针对 FEM1B（一种控制还原应激反应的 E3 连接酶）的共价募集剂 EN106，该募集剂可用于 TPD 应用。虽然锌已被发现是一种将 FEM1B 与其内源性底物 FNIP1 连接在一起的分子胶，但 EN106 是第一个针对 FEM1B 的合成小分子配体。 EN106 是一种早期先导化合物，对 FEM1B 的抑制效力为低微摩尔级，其氯乙酰胺活性基团代谢不稳定，需要进一步的药物化学研究来提高其效力、选择性和类药性。我们证实 EN106 靶向 FEM1B 中一个对底物识别至关重要的半胱氨酸残基。我们发现 EN106 可作为双功能降解剂中的 FEM1B 募集剂，将潜在的新底物募集到 FEM1B 的生理靶点识别位点，从而使其以最佳方式通过 CUL2-RBX1 进行泛素化。令人惊讶的是，我们观察到所有基于 FEM1B 的 BRD4 PROTAC 均能降解 BRD4，且与连接子长度无关，尽管存在对最佳 Dmax 和 DC50 值的偏好。这些数据可能表明，只要避免蛋白质碰撞，共价 FEM1B 降解剂的正协同性并非至关重要。未来的研究需要确定EN106或其衍生物是否能作为分子胶降解剂，募集潜在的新底物进行FEM1B依赖的泛素化和降解。更广泛地说，未来研究还应关注能否开发细胞状态特异性降解剂。此外，确定EN106及其更有效的衍生物是否可用于治疗，在某些癌症情况下通过稳定FNIP1来抑制CUL2FEM1B并破坏还原应激信号通路，也是未来的研究方向。总而言之，我们的研究强调了共价配体筛选在拓展TPD应用中E3连接酶募集剂范围方面的实用性。[1]

C13H13CLN2O3

280.706922292709

280.06

C, 55.62; H, 4.67; Cl, 12.63; N, 9.98; O, 17.10

757192-67-9

5100616

White to off-white solid powder

1.351±0.06 g/cm3(Predicted)

489.1±45.0 °C(Predicted)

1.3

62.6

0

4

4

19

368

0

ClCC(N(CCC#N)C1C=CC2=C(C=1)OCCO2)=O

GLDJSVHDOXCYPT-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H13ClN2O3/c14-9-13(17)16(5-1-4-15)10-2-3-11-12(8-10)19-7-6-18-11/h2-3,8H,1,5-7,9H2

2-chloro-N-(2-cyanoethyl)-N-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)acetamide

EN106; EN-106; 757192-67-9; 2-chloro-N-(2-cyanoethyl)-N-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)acetamide; 2-chloro-N-(2-cyanoethyl)-N-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-ylacetamide; CHEMBL5289726; SCHEMBL23804991; DTXSID001152090; EN 106

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~890.60 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。