Fura-2 AM   中文名称: 荧光钙探针 Fura 2-AM

Fluorescent calcium ion (Ca2+ ) indicator

推荐使用方案(以下是我们推荐的方案。本方案只是一个建议使用指南，应根据您的具体需求进行修改)。[1]
Fura-2 AM扩散穿过细胞膜，被细胞酯酶去酯化，生成游离Fura-2酸。
1. 首先，在含有50 μg样品的小瓶中加入50 μL的DMSO制备1 mM Fura-2 AM储备液。建议使用干燥/无水的DMSO/二甲基亚砜（在氮气下保护）。准备好fura - 2am溶液后，将其保存在避光/干燥的地方。DMSO中的fura - 2am在室温下稳定24小时，在-20度的干燥容器中稳定数月。
2. 取2ml培养基放入15ml锥形管中，加热至37℃，加入2 μL fura - 2am储备液，生成1μM fura - 2am工作液。将溶液涡旋1分钟。
3. 将上样液转移到35mm的组织培养皿中，将带细胞的盖子转移到培养皿中。
4. 将神经元在37度的黑暗培养箱中培养30分钟。孵化时间要精确。
5. 准备一个35毫米的培养皿，含有2ml不含fura - 2am的组织培养基。从加载液上取下盖子，并将其放入新的培养皿中。
6. 将盖子安装在成像室上。

Imaging Protocol [1]
1. 校正显微镜。
2. 将Tyrodes溶液装入输入线路，注意防止气泡的形成。
3. 将腔室与灌注管线连接，再次通过腔室灌注Tyrodes溶液，注意防止腔室内形成气泡。
4. 在物镜上滴一滴油，将腔室放在显微镜台上，用透射光聚焦细胞。
5. 使用目镜在340 nm和380 nm的光照下检查细胞的荧光。静息细胞的亮度应该在340度时变暗，在380度时变亮。一般来说，细胞不应用紫外线照射超过10或15秒，并且应使用中性密度滤光片降低激发光的强度，以防止光毒性。
6. 使用相机检查细胞，并设置相机的增益和曝光，以生成在380 nm照射时接近饱和(但不饱和)的图像，而在340 nm照射时远低于饱和。如果可能，将曝光量保持在200ms以下。一旦设置，不要改变相机的增益或曝光，除非你也打算改变背景，RMin和RMax(见下文)。
7. 收集每个波长的图像，并使用感兴趣区域(ROI)工具测量每个波长图像中各种位置的背景强度。
8. 取背景值平均值，并将背景值输入成像程序中的适当位置。背景值将从字段中的每个像素中减去。
9. 收集一个练习比率图像，并调整每个波长的阈值，以生成仅包括细胞而不包括背景的比率图像，并且在靠近细胞边缘的区域中没有噪声。
10. 将最小比率值(RMin)设置为比字段中任何单元格的最低比率低10%左右。
11. 将RMax设置为RMin的12倍左右。不要更改您计划比较的实验之间的RMin或RMax，因为这会使比较变得困难。我们很少改变成像设备上的RMin和Rmax值。
12. 使用自动阶段找到您计划成像的字段，并使用软件记录每个字段的位置。我们通常在一次实验中收集五个视场。自动舞台移动到一个领域，收集比例图像，并移动到下一个领域。
13. 设置延时间隔，根据您希望看到的信号类型，间隔0.1到10秒收集图像。
14. 开始实验。
15. 当测试钙成像系统时，通常使用刺激是有用的，如高钾钾(65 mM KCl)或离子霉素(2µM)，会导致细胞内钙升高和无钙的细胞外溶液(含有钙缓冲液，如EGTA和BAPTA)，会降低钙浓度。

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Analysis/分析[1]
一旦实验完成，您将需要将比率图像集转换为单个细胞或细胞内感兴趣区域的延时钙测量值。[1]
1. 使用感兴趣区域工具(ROI)来定义要测量钙的图像区域。通常有至少一个覆盖单元体的ROI是有用的。在定义roi时，播放图像的电影以验证细胞在实验过程中不移动是有用的。
2. 使用该软件收集每个图像中每个ROI的延时比测量值。
3. 将比率测量值导入分析程序。您需要查看特定细胞或roi的钙痕迹，平均多个细胞或roi并将比率测量值转换为细胞内钙值。我们使用Igor Pro编写的一组宏，它允许我们执行所有这些常见的分析任务，但也可以使用其他程序，如Excel，尽管不太方便。
4. 公式[Ca] = (R-Rmin)/(Rmax-R)Sf*Kd可用于将Fura-2比值值转换为细胞内钙浓度。[Ca]为钙浓度，R为Fura-2 340/380比值，RMin和RMax分别为无钙和有饱和钙浓度时的340/380比值;Sf*Kd为Fura-2的Kd (RT下约120 nM)与标度值的乘积。为了测量RMin, RMax和Sf*Kd，需要进行体内或体外校准。体内校准需要结合贴片夹紧和钙成像，这可能很复杂，但也非常精确。体外校准可以使用自制的校准室进行，该校准室由两个由薄盖盖间隔器分隔的盖盖组成，以产生执行校准的薄层溶液。测量Fura-2比率值作为钙浓度函数的最方便方法是使用含有多种缓冲钙溶液和Fura-2游离酸的校准试剂盒。

Loading of Fura-2 calcium dye/Fura-2钙染料的负载[1]
研究人员可在细胞中加入乙酰氧基甲基酯Fura-2 (Fura-2 AM)，这种物质扩散到细胞膜上，并被细胞酯酶去酯化，产生游离Fura-2酸。Fura-2装载的确切参数因细胞类型而异。我们建议通过制备几种含有多种浓度Fura-2(浓度范围为1- 4µM)的加载溶液来测试各种条件，将细胞在加载溶液中孵育15分钟至2小时，并在室温和37度下测试加载。皮层神经元的简化方案如下:
1. 首先，将50µl DMSO加入到含有50µg样品的小瓶中，制备1 mM Fura-2 AM储备液。重要的是要使用干燥的二甲基亚砜在氮气下包装，必须用针通过穿刺隔膜去除二甲基亚砜，以防止二甲基亚砜的吸水。准备好fura - 2am储备液后，将其保存在黑暗干燥的地方。DMSO中的fura - 2am在室温下可稳定24小时，在- 20度的干燥容器中可稳定数月。
2. 将2 ml培养基放入15 ml锥形管中，加热至37度，加入2µl Fura-2 AM原液，生成1µM Fura-2 AM溶液。将溶液强力涡旋1分钟。
3. 将上样液转移到35mm的组织培养皿中，并将带有细胞的盖子转移到培养皿中。
4. 将神经元在37度的黑暗培养箱中培养30分钟。精确的孵育时间。
5. 准备一个35毫米的培养皿，含有2毫升不含Fura-2 AM的组织培养基。从上料液上取下盖子，放入新皿中。
6. 将盖子安装在成像室上。从35mm培养皿上取下盖子，迅速安装到培养室上，确保细胞不会干燥。我们使用华纳仪器制造的成像室，它允许将包含细胞的10mm盖盖安装在底部，并将第二个盖盖安装在顶部形成三明治。两个盖盖用真空油脂固定在腔室上，腔室两端的两个管允许溶液通过腔室灌注。所述输入线连接到注射器，所述输出线连接到井，所述井通过连接到真空疏水阀的抽吸线排空。

[1]. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 2009 Jan 19;(23):1067.

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths. The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding. Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.[1]

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We report the first demonstration of a fast wavelength‐switchable 340/380 nm light‐emitting diode (LED) illuminator for Fura‐2 ratiometric Ca2+ imaging of live cells. The LEDs closely match the excitation peaks of bound and free Fura‐2 and enables the precise detection of cytosolic Ca2+ concentrations, which is only limited by the Ca2+ response of Fura‐2. Using this illuminator, we have shown that Fura‐2 acetoxymethyl ester (AM) concentrations as low as 250 nM can be used to detect induced Ca2+ events in tsA‐201 cells and while utilising the 150 μs switching speeds available, it was possible to image spontaneous Ca2+ transients in hippocampal neurons at a rate of 24.39 Hz that were blunted or absent at typical 0.5 Hz acquisition rates. Overall, the sensitivity and acquisition speeds available using this LED illuminator significantly improves the temporal resolution that can be obtained in comparison to current systems and supports optical imaging of fast Ca2+ events using Fura‐2.[2]

C44H47N3O24

1001.85

1001.254

108964-32-5

3364574

Light yellow to green yellow liquid

1.4±0.1 g/cm3

975.9±75.0 °C at 760 mmHg

544.0±37.1 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.567

2.9

327.11

0

27

37

71

1780

0

O=C(C1=CN=C(C2=CC3=CC(OCCOC4=CC(C)=CC=C4N(CC(OCOC(C)=O)=O)CC(OCOC(C)=O)=O)=C(N(CC(OCOC(C)=O)=O)CC(OCOC(C)=O)=O)C=C3O2)O1)OCOC(C)=O

VPSRLGDRGCKUTK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C44H47N3O24/c1-25-7-8-32(46(16-39(53)65-20-60-26(2)48)17-40(54)66-21-61-27(3)49)35(11-25)58-9-10-59-36-12-31-13-37(43-45-15-38(71-43)44(57)69-24-64-30(6)52)70-34(31)14-33(36)47(18-41(55)67-22-62-28(4)50)19-42(56)68-23-63-29(5)51/h7-8,11-15H,9-10,16-24H2,1-6H3

acetyloxymethyl 2-[6-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-5-[2-[2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]-1-benzofuran-2-yl]-1,3-oxazole-5-carboxylate

108964-32-5; FURA 2-AM; Fura-2 AM; Bis(acetoxymethyl) 2,2'-((2-(5-((acetoxymethoxy)carbonyl)oxazol-2-yl)-5-(2-(2-(bis(2-(acetoxymethoxy)-2-oxoethyl)amino)-5-methylphenoxy)ethoxy)benzofuran-6-yl)azanediyl)diacetate; Fura-2, AM; MFCD00036976; acetyloxymethyl 2-[6-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-5-[2-[2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]-1-benzofuran-2-yl]-1,3-oxazole-5-carboxylate; (acetyloxy)methyl 2-({2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl}[2-(5-{[(acetyloxy)methoxy]carbonyl}-1,3-oxazol-2-yl)-5-(2-{2-[bis({2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl})amino]-5-methylphenoxy}ethoxy)-1-benzofuran-6-yl]amino)acetate;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 本产品在运输和储存过程中需避光。  (2). 该产品在溶液状态不稳定，请现配现用。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。