Fura-2 AM   中文名称: 荧光钙探针 Fura 2-AM

Fluorescent calcium ion (Ca2+ ) indicator
Fura-2 AM does not target a specific biological receptor but serves as a fluorescent probe for the detection of intracellular calcium ions (Ca²⁺). Once inside the cell, the AM esters are cleaved by esterases, and the resulting Fura-2 binds to Ca²⁺ with high affinity (Kd ≈ 224 nM at 37°C, pH 7.2) and selectivity. The binding of Ca²⁺ to Fura-2 causes a shift in the excitation spectrum, with the calcium-bound form exhibiting increased fluorescence at 340 nm and decreased fluorescence at 380 nm. The ratio of fluorescence at 340 nm to 380 nm is proportional to the free calcium concentration and can be calibrated using standard calcium buffers. Fura-2 AM does not interfere with cellular calcium signaling pathways, making it a non-invasive tool for studying calcium dynamics. The compound's membrane permeability, ratiometric properties, and high sensitivity make it one of the most widely used calcium indicators for live-cell imaging.

使用说明（这是我们推荐的方案，您可以根据具体需求进行调整）。
Fura-2 AM 可扩散穿过细胞膜，然后被细胞酯酶脱酯化生成 Fura-2 游离酸。[1]
1. 配制 1 mM Fura-2 AM 储备液时，向 50 μg 小瓶中加入 50 μL DMSO。务必使用氮气保护的无水 DMSO，建议用针刺穿隔膜抽取 DMSO，以防止 DMSO 受潮。配制好 Fura-2 AM 溶液后，请将其置于阴凉干燥处（避光）。Fura-2 AM 在 DMSO 中于干燥容器中储存时，在室温下可稳定保存 24 小时，在 -20°C 下可稳定保存数月。
2. 取 2 mL 培养基分装至 15 mL 锥形管中，预热至 37°C。加入 2 μL Fura-2 AM 储备液，配制成 1 μM Fura-2 AM 工作液。剧烈涡旋振荡 1 分钟。
3. 将含有细胞的盖玻片连同上样液一起放入 35 mm 培养皿中。
4. 将神经元置于 37°C 的黑暗培养箱中孵育 30 分钟。精确计时。
5. 使用一个含有 2 mL 不含 Fura-2 AM 的组织培养基的 35 mm 培养皿。将盖玻片从上样液中取出，放入新的培养皿中。
6. 将盖玻片放入成像室中。
体外研究表明，Fura-2 AM 是细胞内钙离子浓度的可靠且灵敏的指示剂。在细胞悬液或贴壁细胞中，Fura-2 AM 上样（通常在 37°C 下用 1-5 µM 的浓度孵育 30-60 分钟）可使染料在胞质内均匀分布。该染料不会在线粒体或其他细胞器中积聚，也不会被细胞内区室显著隔离。荧光信号在加载后可稳定维持数小时，从而可以进行长时间的成像实验。Fura-2 AM 已被用于测量多种刺激引起的钙离子反应，包括神经递质、激素、生长因子和机械刺激。该化合物的比率特性使其能够定量绝对钙离子浓度，因此适用于不同细胞类型和实验条件下的比较研究。Fura-2 AM 也已被用于高通量筛选实验，以鉴定钙信号传导的调节因子。该化合物的加载、钙结合和荧光特性已被广泛表征，被认为是钙成像的金标准。

由于Fura-2 AM主要用于体外和离体实验，因此其在体内研究中的应用有限。然而，在一些研究中，Fura-2 AM已被用于体内细胞的标记，例如脑切片中神经元的标记以及用于钙成像的完整器官中细胞的标记。该化合物的膜渗透性使其能够标记完整组织中的细胞，但紫外光组织穿透性有限以及染料区室化的可能性可能构成挑战。Fura-2 AM也已被用于斑马鱼、果蝇和其他模式生物的体内钙信号测量。然而，由于紫外光穿透性有限，该化合物不适用于深层组织成像，因此在体内应用中，通常更倾向于使用其他钙指示剂（例如，基因编码的钙指示剂、红移染料）。

成像方案[1]
1. 校准显微镜载物台。
2. 将 Tyrodes 溶液注入进样管路，注意防止产生气泡。
3. 将培养室连接到灌注管路，再次灌注 Tyrodes 溶液，注意防止培养室内产生气泡。
4. 在物镜上滴一滴油，将培养室放在显微镜载物台上，使用透射光聚焦细胞。
5. 使用目镜分别在 340 nm 和 380 nm 波长下观察细胞的荧光。静息细胞在 340 nm 波长下应较暗，在 380 nm 波长下应较亮。通常，细胞不应被紫外光照射超过 10 或 15 秒，并且应使用中性密度滤光片降低激发光的强度，以防止光毒性。
6.使用相机观察细胞，并设置相机的增益和曝光，使图像在 380 nm 波长下接近饱和（但未饱和），在 340 nm 波长下远低于饱和。尽可能将曝光时间保持在 200 毫秒以下。设置完成后，除非您计划同时调整背景、RMin 和 RMax（见下文），否则请勿更改相机的增益或曝光。
7. 在每个波长下采集图像，并使用感兴趣区域 (ROI) 工具测量每个波长下图像中不同位置的背景强度。
8. 对背景值取平均值，并将背景值输入到成像程序中的相应位置。背景值将从视野中的每个像素中减去。
9. 采集一张练习比例图像，并调整每个波长的阈值，以生成仅包含细胞而不包含背景，且在细胞边缘附近区域无噪声的比例图像。
10.将最小比率值 (RMin) 设置为比视野中任何细胞的最低比率低约 10%。
11. 将 RMax 设置为 RMin 的约 12 倍。不要在计划比较的实验之间更改 RMin 或 RMax，因为这会使比较变得困难。我们很少更改成像装置的 RMin 和 RMax 值。
12. 使用自动载物台找到您计划成像的视野，并使用软件记录每个视野的位置。我们通常在一次实验中采集五个视野。自动载物台移动到一个视野，采集比率图像，然后移动到下一个视野。
13. 根据您预期观察到的信号类型，设置延时间隔，以 0.1 到 10 秒的间隔采集图像。
14. 开始实验。
15.在测试钙成像系统时，通常可以使用高钾泰洛德溶液（65 mM KCl）或离子霉素（2 µM）等刺激物来引起细胞内钙离子浓度升高，并使用不含钙的细胞外溶液（其中含有钙缓冲剂，例如 EGTA 和 BAPTA）来降低钙离子浓度。

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分析[1]
实验完成后，您需要将一组比率图像转换为单个细胞或细胞内感兴趣区域的延时钙离子测量数据。具体操作如下：[1]
1. 使用感兴趣区域 (ROI) 工具定义图像中要测量钙离子的区域。通常至少需要一个覆盖细胞体的 ROI。定义 ROI 时，播放图像视频以验证细胞在实验过程中是否移动会很有帮助。
2. 使用软件收集每张图像中每个 ROI 的延时比率测量数据。
3.将比值测量结果导入分析程序。您需要查看特定细胞或感兴趣区域 (ROI) 的钙离子浓度曲线，对多个细胞或 ROI 取平均值，并将比值测量结果转换为细胞内钙离子浓度值。我们使用 Igor Pro 编写的一组宏来执行所有这些常见的分析任务，但也可以使用其他程序，例如 Excel，尽管后者不太方便。
4. 可以使用公式 [Ca] = (R-Rmin)/(Rmax-R)Sf*Kd 将 Fura-2 比值转换为细胞内钙离子浓度。[Ca] 是钙离子浓度，R 是 Fura-2 340/380 比值，RMin 和 RMax 分别是无钙和饱和钙浓度下的 340/380 比值；Sf*Kd 是 Fura-2 的 Kd 值（室温下约为 120 nM）与一个缩放值的乘积。为了测量 RMin、RMax 和 Sf*Kd，需要进行体内或体外校准。体内校准需要结合膜片钳技术和钙成像技术，虽然操作较为复杂，但精度很高。体外校准可以使用自制的校准室，该校准室由两片盖玻片组成，中间用薄的盖玻片垫片隔开，形成一层薄溶液用于校准。测量 Fura-2 比值与钙浓度关系的最便捷方法是使用包含多种缓冲钙溶液和 Fura-2 游离酸的校准试剂盒。
对于体外加载方案，Fura-2 AM 通常配制成 1-5 mM 的 DMSO 储备液。然后将染料稀释到含有 0.02% Pluronic F-127（一种非离子去污剂，可提高染料溶解度）的生理缓冲液（例如 HBSS、Krebs-Ringer 缓冲液）中，最终浓度为 1-5 µM。将细胞与加载液在37°C避光孵育30-60分钟。加载后，用无染料缓冲液洗涤细胞以去除细胞外染料，并在37°C下继续孵育15-30分钟以进行脱酯化。然后将细胞置于显微镜载物台上，使用配备紫外光源和相应滤光片组（激发波长340 nm和380 nm，发射波长510 nm）的荧光显微镜进行荧光成像。使用CCD相机或共聚焦显微镜采集图像，并计算每个细胞或感兴趣区域在340 nm和380 nm处的荧光强度比值。使用钙校准试剂盒或通过测量零钙浓度（使用EGTA）和饱和钙浓度（使用离子霉素）下的荧光比值，将该比值校准为绝对钙浓度。

Fura-2钙染料的加载[1]
研究人员可以使用乙酰氧基甲基酯Fura-2 (Fura-2 AM) 对细胞进行加载，Fura-2 AM可扩散穿过细胞膜，并被细胞酯酶脱酯化生成游离Fura-2酸。Fura-2加载的具体参数因细胞类型而异。我们建议通过制备多种不同浓度（1-4 µM）的Fura-2加载溶液来测试各种条件，将细胞在加载溶液中孵育15分钟至2小时的不同时间，并在室温和37℃下测试加载情况。以下是皮层神经元的简化方案：
1. 首先，制备1 mM Fura-2 AM储备液，方法是将50 µl DMSO加入到含有50 µg样品的样品瓶中。使用氮气保护的干燥DMSO非常重要，并且需要用针刺破隔膜取出DMSO，以防止DMSO水化。配制Fura-2 AM溶液后，将其置于阴凉干燥处保存。DMSO中的Fura-2 AM在室温下可稳定保存24小时，在干燥容器中于-20℃下可稳定保存数月。
2. 取2 ml培养基分装至15 ml锥形管中，加热至37℃，加入2 µl Fura-2 AM原液，配制成1 µM的Fura-2 AM溶液。剧烈涡旋振荡1分钟。
3. 将上样溶液转移至35 mm组织培养皿中，并将带有细胞的盖玻片转移至培养皿中。
4. 将神经元置于37℃的黑暗培养箱中孵育30分钟。精确控制孵育时间。
5. 准备一个含有 2 ml 不含 Fura-2 AM 的组织培养基的 35 mm 培养皿。从上样液中取出盖玻片，放入新的培养皿中。
6. 将盖玻片安装到成像室上。从 35 mm 培养皿中取出盖玻片，迅速将其安装到成像室上，注意防止细胞干燥。我们使用 Warner Instruments 生产的成像室，该成像室底部可安装一个含有细胞的 10 mm 盖玻片，顶部可安装另一个盖玻片，形成“三明治”结构。两个盖玻片用真空脂固定在成像室上，成像室两端的两根管子用于灌注溶液。进样管连接到注射器，出样管连接到一个孔，该孔通过连接到真空阱的吸管排出溶液。
对于体外细胞实验，Fura-2 AM 用于测量多种细胞类型对各种刺激的细胞内钙离子反应。将细胞接种于盖玻片或96孔板中，并按上述方法用Fura-2 AM进行加载。然后将细胞置于显微镜载物台或酶标仪中，记录1-5分钟的基线荧光强度。加入刺激物（例如激动剂、药物、机械刺激），并继续记录5-30分钟的荧光强度。计算340/380比值的变化作为钙离子反应的指标。对于高通量筛选，使用配备双激发波长的自动酶标仪。所有实验均包含适当的阳性对照（例如离子霉素、ATP、组胺）和阴性对照（例如溶剂、缓冲液），结果以至少三次独立实验的平均值±标准差表示。

在体内动物实验中，Fura-2 AM 通常用于离体组织成像（例如，脑切片、分离器官），而非体内成像。将组织与 Fura-2 AM (5-10 µM) 在含氧缓冲液中于 37°C 孵育 30-60 分钟，洗涤后置于显微镜载物台上进行成像。记录对电刺激、神经递质或其他刺激的钙离子反应。该化合物通常不用于活体动物的体内成像。

由于Fura-2 AM用作钙指示剂而非治疗剂，因此其药代动力学数据不适用。该化合物的分子量为1001.86 g/mol，分子式为C₄₄H₄₇N₃O₂₄。它可溶于DMSO和其他有机溶剂，通常配制成DMSO储备液。该化合物应以粉末形式储存于-20°C，避光防潮，溶液应在1-2天内使用，以防止AM酯水解。

Fura-2 AM 在用于钙成像的浓度（1-5 µM）下通常被认为毒性较低。然而，AM 酯基团在高浓度下可能对某些细胞类型具有毒性，用作溶剂的 DMSO 在高浓度下也可能具有细胞毒性。操作该化合物时应采取适当的安全预防措施，包括使用个人防护装备并在通风良好的区域工作。该化合物仅供研究使用，不得用于人体治疗。

[1]. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 2009 Jan 19;(23):1067.

钙成像是一种常用的细胞培养钙信号测量技术。钙成像利用钙指示剂染料，这些染料是基于BAPTA的有机分子，其光谱特性会随着Ca²⁺离子的结合而改变。钙指示剂染料分为两类：比率型染料（例如Fura-2和Indo-1）和单波长染料（例如Fluo-4）。比率型染料的激发或发射光谱会随着钙离子的结合而改变，因此可以通过不同波长下荧光发射或激发的比值来确定细胞内钙离子浓度。与单波长探针相比，使用比率型染料的主要优势在于其比值信号与染料浓度、光强度和光程无关，从而避免了这些因素的影响，并能够独立地测定细胞内钙离子浓度。Fura-2是最常用的钙指示剂之一，其发射峰位于505 nm，与钙离子结合后会从340 nm变为380 nm。本文介绍了一种利用Fura-2测量神经元和其他可兴奋细胞内钙离子浓度升高的方法。[1] 我们首次展示了一种用于活细胞Fura-2比率式Ca2+成像的快速波长可切换的340/380 nm发光二极管（LED）照明器。该LED的激发波长与结合态和游离态Fura-2的激发峰高度匹配，从而能够精确检测细胞质Ca2+浓度，其精度仅受限于Fura-2的Ca2+响应。利用该照明器，我们证明了浓度低至250 nM的Fura-2乙酰氧基甲酯（AM）即可用于检测tsA-201细胞中诱导的Ca2+事件。此外，凭借 150 μs 的切换速度，我们能够以 24.39 Hz 的频率对海马神经元中的自发性 Ca2+ 瞬变进行成像，而这种瞬变在典型的 0.5 Hz 采集速率下会被抑制或消失。总之，与现有系统相比，使用该 LED 照明器获得的灵敏度和采集速度在时间分辨率方面得到了显著提高，并且能够利用 Fura-2 对快速 Ca2+ 事件进行光学成像。[2]
Fura-2 AM 是一种仅供研究使用的化合物，尚未获得任何监管机构批准用于临床应用。它也称为 Fura-2 乙酰氧基甲酯。该化合物的分子式为 C₄₄H₄₇N₃O₂₄，分子量为 1001.86 g/mol。Fura-2 AM 是一种膜渗透性、紫外光激发型荧光钙指示剂，广泛用于测量活细胞内的钙浓度。该化合物是钙成像的金标准，广泛应用于生物医学研究领域。该化合物可从多家科研化学品供应商处获得，纯度通常≥95%（HPLC）。储存建议包括将该化合物置于密封容器中，避光防潮，并保存在-20°C。

C44H47N3O24

1001.85

1001.254

108964-32-5

3364574

Light yellow to green yellow liquid

1.4±0.1 g/cm3

975.9±75.0 °C at 760 mmHg

544.0±37.1 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.567

2.9

327.11

0

27

37

71

1780

0

O=C(C1=CN=C(C2=CC3=CC(OCCOC4=CC(C)=CC=C4N(CC(OCOC(C)=O)=O)CC(OCOC(C)=O)=O)=C(N(CC(OCOC(C)=O)=O)CC(OCOC(C)=O)=O)C=C3O2)O1)OCOC(C)=O

VPSRLGDRGCKUTK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C44H47N3O24/c1-25-7-8-32(46(16-39(53)65-20-60-26(2)48)17-40(54)66-21-61-27(3)49)35(11-25)58-9-10-59-36-12-31-13-37(43-45-15-38(71-43)44(57)69-24-64-30(6)52)70-34(31)14-33(36)47(18-41(55)67-22-62-28(4)50)19-42(56)68-23-63-29(5)51/h7-8,11-15H,9-10,16-24H2,1-6H3

acetyloxymethyl 2-[6-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-5-[2-[2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]-1-benzofuran-2-yl]-1,3-oxazole-5-carboxylate

108964-32-5; FURA 2-AM; Fura-2 AM; Bis(acetoxymethyl) 2,2'-((2-(5-((acetoxymethoxy)carbonyl)oxazol-2-yl)-5-(2-(2-(bis(2-(acetoxymethoxy)-2-oxoethyl)amino)-5-methylphenoxy)ethoxy)benzofuran-6-yl)azanediyl)diacetate; Fura-2, AM; MFCD00036976; acetyloxymethyl 2-[6-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-5-[2-[2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]-1-benzofuran-2-yl]-1,3-oxazole-5-carboxylate; (acetyloxy)methyl 2-({2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl}[2-(5-{[(acetyloxy)methoxy]carbonyl}-1,3-oxazol-2-yl)-5-(2-{2-[bis({2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl})amino]-5-methylphenoxy}ethoxy)-1-benzofuran-6-yl]amino)acetate;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 本产品在运输和储存过程中需避光。  (2). 该产品在溶液状态不稳定，请现配现用。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。