GLPG-3221

CFTR/cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

GLPG-3221是一种新型的CFTR（囊性纤维化跨膜电导）调节剂，EC50为105 nM，对治疗囊性纤维化具有潜在的有用性。

用 1 mg/kg GLPG-3221 (iv) 处理后，Cl 和 t1/2 分别为 0.13 L/h/kg 和 3 小时 [1]。 GLPG-3221（1 mg/kg；口服）治疗的 F% 值为 53% [1]。

CYP3A4诱导：[1]
冷冻保存的原代人肝细胞在治疗前解冻并培养过夜。培养的肝细胞用试验化合物（10µM）、载体对照（0.1%v/v DMSO）或CYP3A4的原型诱导剂（利福平10µM）处理48小时，每24小时更新一次培养基。48小时治疗后，在化合物处理的肝细胞中测量的CYP3A4 mRNA水平表示为阳性对照（利福平10µM）反应的百分比。在受试化合物处理的肝细胞中，CYP3A4 mRNA水平增加不到阳性对照（利福平）反应的20%，被认为是CYP3A4诱导的低风险。

细胞表面表达辣根过氧化物酶（CSE-HRP）测定：[1]
在人肺源性上皮细胞系（CFBE41o-）中开发了一种细胞测定法，用于在用测试化合物校正后测量F508del CFTR细胞表面表达，无论是否使用共校正剂（3-[（2R，4R）-4-（{[1-（2,2-二氟-1,3-苯并二氧代-5-基）环丙基]羰基}氨基）-7-甲氧基-3,4-二氢-2H-铬-2-基]苯甲酸的2µM）。1这是通过在第四个外周环中表达F508del CTFR突变和辣根过氧化物酶（HRP），然后使用这些细胞的发光读数测量HRP活性来实现的。CFBE41o-F508del CFTR-HRP，与测试校正化合物一起孵育过夜。2简而言之，对于这项初步测定，CFBE41o-F508del CTR-HRP细胞以4000个细胞/孔的速度与0.5µg/mL多西环素一起铺在384孔板中，以诱导F508del CSTR-HRP的表达，并在37°C、5%CO2下进一步孵育72小时。然后以所需浓度加入测试化合物，并在33°C下进一步孵育18-24小时。测试的最高浓度为20µM，使用3倍稀释的8点浓度响应曲线。运行三个重复板以确定一个EC50。所有平板均含有阴性对照（二甲亚砜，DMSO）和阳性对照（3-[（2R，4R）-4-（{[1-（2,2-二氟-1,3-苯并二氧杂环戊醇-5-基）环丙基]羰基}氨基）-7-甲氧基-3,4-二氢-2H-色烯-2-基]苯甲酸的3µM）（化合物1）以及阳性对照的平板浓度响应。孵育后，用Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）洗涤板5次，然后加入HRP底物鲁米诺（50µL），并使用EnVision®Multilabel Plate Reader上的发光读数测量HRP活性。使用Accelrys®Assay Explorer v3.3分析实验的原始计数。

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人支气管上皮细胞跨上皮电流钳电导测定：[1]
使用原代人支气管上皮细胞（hBE）的基于细胞的测定用作二次测定，以测试新型F508del CFTR校正剂对具有F508del/F508del CFTR突变的原代hBE细胞的活性。将来自F508del/F508del CFTR患者的原代人支气管上皮（hBE）细胞从1×106扩增到250×106。3为此，将分离自具有纯合突变的CF患者的细胞接种到24孔Corning（Cat#3378）滤板上，该滤板涂有3T3条件培养基，并使用补充了Ultroser®G的分化培养基在气液界面上生长35天。在实验前72小时，通过用分化培养基中制备的3 mM二硫苏糖醇（DTT）孵育细胞的顶面30分钟，然后将粘液与培养基一起吸出，去除顶面粘液。再次用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤根尖表面，孵育30分钟，然后抽吸。然后将细胞与所需剂量的校正化合物在37℃、5%CO2下孵育18-24小时。校正化合物制备为10mM储备，在分化培养基中制备所需浓度，并始终施加在上皮细胞的基底外侧。在测量TECC上的校正器活性的当天，将细胞切换到碳酸氢盐和无血清的F-12 Coon培养基中，并在无CO2培养箱中平衡90分钟。在测量时，过滤器的顶端和基底外侧用F-12 Coon的改性介质（含20 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH 7.4（使用1 M三（羟甲基）氨基甲烷（tris））浸泡，并在36.5℃下进行测量。连续添加苯甲密耳前后的电流反应（顶端添加6μM；用于抑制上皮ENaC通道）、毛喉素（顶端和基底外侧添加10μM；用于激活CFTR通道）、控制增效剂（N-（3-氨基甲酰基-5,5,7,7-四甲基-4,7-二氢-5H-噻吩并[2,3-c]吡喃-2-基）-1H-吡唑-5-甲酰胺；顶端和基底外侧增加0.75μM；用于增强CFTR通道）和布美他尼（基底外侧20μM添加；用于抑制Na:2Cl:K共转运蛋白（抑制CFTR通道驱动的Cl-分泌的间接措施）。该测定使用TECC-24（24孔跨上皮电流钳）仪器，通过测量极化原代上皮细胞产生的等效CFTR电流（IEQ）来测量突变通道的功能。该仪器通过使用定制设计的多通道电流钳和电极歧管在电流钳条件下测量跨上皮电位差（VT）和跨上皮电导（GT）来工作。每个测量的VT值都针对电极偏移电势进行了校正，每个测量的GT值都针对组合溶液系列和空过滤器电阻进行了校正。然后使用校正的VT和GT值来计算等效电流，即使用欧姆定律的IEQ（IEQ=VT.GT）。除了计算IEQ外，还使用三分之一梯形法计算了福司柯林峰IEQ反应和添加布美他尼时之间的时间段的曲线下面积（AUC）。该测定以24孔的形式进行，所有24孔在同一时间点进行测量，从而为该测定提供了更高的通量。

动物/疾病模型： 大鼠[1]
剂量： 1 mg/kg
给药途径： 静脉注射（药代动力学/PK/PK 分析）
实验结果： Cl 和 t1/2 分别为 0.13 L/h/kg 和 3 小时。

研究发现，化合物 19 (ABBV-3221) 在大鼠和犬中均具有良好的药代动力学 (PK) 特征，例如生物利用度高（大鼠为 53%；犬为 78%）和半衰期合理（大鼠为 3 小时；犬为 6.4 小时）。

[1]. Discovery of ABBV/GLPG-3221, a Potent Corrector of CFTR for the Treatment of Cystic Fibrosis.ACS Med Chem Lett. 2019 Oct 31;10(11):1543-1548.

囊性纤维化 (CF) 是一种影响多种组织和器官的遗传性疾病。CF 由 CFTR 基因突变引起，导致囊性纤维化跨膜传导调节因子 (CFTR) 蛋白表达不足或功能受损。CF 患者中最常见的突变是 CFTR 蛋白第 508 位苯丙氨酸缺失 (F508del-CFTR)。目前最有效的治疗方法是使用两类 CFTR 调节剂：校正剂和增强剂。CFTR 校正剂可提高细胞表面的 CFTR 蛋白水平；CFTR 增强剂可使细胞表面的 CFTR 通道功能性开放。三联疗法使用两种不同的校正剂分子（C1 和 C2）来进一步提高整体疗效。我们意识到需要开发一种 C2 校正剂系列，该系列有望与我们现有的 C1 校正剂系列联合使用，并为 CF 患者提供显著的临床疗效。本文描述了CFTR C2校正剂吡咯烷系列化合物的鉴定及其构效关系。这项工作最终发现了(2S,3R,4S,5S)-3-(叔丁基)-4-((2-甲氧基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲氧基)-1-((S)-四氢-2H-吡喃-2-羰基)-5-(邻甲苯基)吡咯烷-2-羧酸(ABBV/GLPG-3221)，并推进至临床试验阶段。[1]

C30H37F3N2O6

578.619799375534

578.26

C, 62.27; H, 6.45; F, 9.85; N, 4.84; O, 16.59

2222264-64-2

139443340

Typically exists as solid at room temperature

5.3

98.2

1

10

8

41

912

5

CC1=CC=CC=C1[C@H]2[C@H]([C@@H]([C@H](N2C(=O)[C@@H]3CCCCO3)C(=O)O)C(C)(C)C)OCC4=C(N=CC(=C4)C(F)(F)F)OC

YFEYDNAKCSOOOG-YCXOGWGTSA-N

InChI=1S/C30H37F3N2O6/c1-17-10-6-7-11-20(17)23-25(41-16-18-14-19(30(31,32)33)15-34-26(18)39-5)22(29(2,3)4)24(28(37)38)35(23)27(36)21-12-8-9-13-40-21/h6-7,10-11,14-15,21-25H,8-9,12-13,16H2,1-5H3,(H,37,38)/t21-,22+,23-,24-,25-/m0/s1

(2S,3R,4S,5S)-3-tert-butyl-4-[[2-methoxy-5-(trifluoromethyl)pyridin-3-yl]methoxy]-5-(2-methylphenyl)-1-[(2S)-oxane-2-carbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid

GLPG3221; GLPG-3221; ABBV/GLPG-3221; 2222264-64-2; CHEMBL4588847; ABBV-3221; (2S,3R,4S,5S)-3-tert-butyl-4-[[2-methoxy-5-(trifluoromethyl)pyridin-3-yl]methoxy]-5-(2-methylphenyl)-1-[(2S)-oxane-2-carbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid; (2S,3R,4S,5S)-3-tert-Butyl-4-{[2-methoxy-5-(trifluoromethyl)pyridin-3-yl]methoxy}-5-(2-methylphenyl)-1-[(2S)-oxane-2-carbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid; SCHEMBL21305963; GLPG 3221

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。