GSK-3008348

αvβ6 Integrin (pIC50 = 8.4)

28h/GSK-3008348在细胞粘附（pIC50=8.4）和αvβ6放射配体测定（pKi=10.4）中对αvβ5具有高亲和力。在较低蛋白质浓度（75 pM）的放射性配体测定的更灵敏版本中，因此灵敏度更高，GSK-3008348/28h与pKi=11.0的亲和力更高。虽然GSK-3008348/28h在体外hERG测定中的活性较弱，但pIC50值均<5，考虑到化合物的其他特性，安全风险被认为是可控的。此外，随着该化合物的开发，将进行进一步的体外和体内评估，并预计对预测的人类暴露具有良好的安全倍数（数据未显示）。28h/GSK-3008348在αvβ6的细胞粘附试验中比其他αv整合素具有适度至优异的选择性（见下文）。制备了两个C-连接的吡唑28j和28k；NH类似物28j对αvβ6具有高亲和力（pIC50=8.6），但选择性降低，而去甲基化类似物28k的效力稍低（pIC50=8.1）

从这项工作中，我们选择了非常有效和αvβ6选择性的二甲基吡唑类似物GSK-3008348/28h进行进一步分析（见下文），并最终成为临床候选药物。这一决定得到了进一步药理学研究的支持，包括一些针对IPF人体组织的研究；在各种动物模型中，检查药代动力学特征的详细研究与吸入剂量和活性相称（见下文）。然而，为了更全面地了解28小时左右的SAR，我们继续探索该系列和相关系列的类似物（46,47），现在描述了这些类似物的概况。其中一些类似物的特征与GSK-3008348/28h相当，但实际上是在相当晚的时候才被识别和分析的。当时，根据项目团队的判断，这些并没有为葛兰素史克3008348/28h提供任何显著优势，而此时葛兰素史克正在通过昂贵和资源密集型的开发过程取得进展。 制备了五种N-连接的三唑类似物28l-p，它们在区域化学、连接位置和取代模式方面有所不同。在吡唑类似物上向杂芳族化合物中添加额外的氮通常会将亲脂性降低至少一个对数单位；将具有2.82的chromLogD7.4的匹配对二甲基吡唑GSK-3008348/28h与具有1.66的chromLogD7.4的二甲基三唑28n进行比较。所有三唑对细胞和放射配体结合试验中的αvβ6整合素都有很高的亲和力，尽管与28小时相比，一些三唑对其他一些αv整合素的选择性较低。它们都没有显示hERG活性，这可能是由于亲脂性降低。 继续探索各种唑类似物，基于构建块的现成可用性，制备了三种咪唑（C-和N-连接）28q-s。尽管它们的异构体相似，但相应吡唑的配对咪唑类似物的亲脂性降低，反映了碱性的明显差异；将chromLogD7.4为2.82的二甲基吡唑28h与chromLogD7.4.为2.09的二甲基咪唑28r进行比较。唑配对和异构唑配对之间亲脂性的这些变化与我们之前更广泛地探索这些作用的一些工作是一致的。与三唑类药物一样，咪唑类药物在体外试验中没有hERG活性，在细胞粘附和结合试验中对αvβ6具有很高的效力，28r的效力和选择性与28h相似。在αvβ6细胞粘附试验中，28q的pIC50为8.2，效力稍低，但可能具有CYP p450抑制风险

最后一组要检查的是一系列28t-z的环醚类似物，它们通过氧或碳原子与苯环相连。与28h相比，这些化合物的亲脂性通常略低，范围从28w的chromLogD7.4=2.75到28v的chromLogD3.4=2.07。梭子鱼试验中很少或没有hERG活性，尽管有些在Qpatch试验中活性增加（例如，梭子鱼中的四氢吡喃28w，pIC50<4.3，但Qpatch中的pIC50=5.1）。C4连接的四氢吡喃28y（αvβ6 pIC50=7.9）在细胞粘附试验中具有较低的亲和力，而28t-w具有优异的αvβ5活性，但通常选择性较低，特别是对αvβ3整合素的选择性，与GSK-3008348/28h相比，αvβ4整合素对该整合素的活性高10倍；例如，参见O-连接的氧杂环丁烷28v，αvβ6 pIC50=9.0（细胞粘附），但αvβ5 pIC50=0.3。C3连接的四氢呋喃28x异构体（表1中描述为28xI1和28xI2）对αvβ6也非常有效（在放射性配体结合分析中，28x异构物2（表1列出为28xI2，pKi为10.7），但选择性略好（几乎与28h相当）。在O-和C-连接的四氢呋喃-3-基类似物28t、28u和28x（异构体1和2）中引入第三个不对称中心对αvβ6整合素亲和力或αv选择性分布几乎没有影响

最后，制备了几种3,5-二取代苯基类似物。向3-吗啉代类似物28c中加入5-环丙基或5-（3,5-二甲基）吡唑基取代基，分别得到化合物28bc和28ch。在放射性配体结合测定中，两者的αvβ6效力与GSK-3008348/28h相当，但显示出更高的选择性，特别是28ch；比较28h和28chαvβ3 pIC50分别为6.0和5.5，αvβ5 pIC50为6.9和5.7。很明显，与αvβ6相比，这些取代基结合的特异性定义环（SDL）中的空间在αvβ3和αvβ5中受到更多限制（见下文）。28bc和28ch在体外hERG检测中都没有任何活性。

总体而言，αv选择性特征的考虑在选择GSK-3008348/28h作为临床候选药物方面发挥了作用，是最具选择性的化合物之一（图5）。放射性配体结合数据（见下文）证实，28小时对αvβ6的选择性高于其他αv整合素[1]。

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亲和力和选择性[1]
第一步是确认GSK-3008348/28h的效力、亲和力和选择性，特别是对其他RGD结合整合素的效力、亲和性和选择性。如上所述（表1），2,5-二甲基吡唑类似物对αvβ6具有高亲和力。在饱和结合实验中，氚化28h的pKD为10.8，对其他RGD结合整合素的选择性为17倍（α8β1）至6667倍（α5β1）（表4），这比细胞粘附试验提供了更准确的选择性指示。基于这些数据，28h的选择性至少是其他αv整合素的170倍。重要的是，对αIIbβ3整合素（唯一的其他RGD结合整合素）的活性很小，高达10μM（数据未显示）的抑制剂在临床上用作血小板聚集抑制剂。虽然没有达到抗体选择性水平（如临床试验中的αvβ6抗体STX-100），但28小时显然具有高度选择性，因此被认为适合测试αvβ5抑制可能有益于治疗IPF的假设。

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折扣价格[1]
了解GSK-3008348/28h与αvβ6的解离非常重要，因为这有助于估计临床给药的可能规模和频率。因此，针对αvβ6蛋白测定了28小时的解离结合动力学，并将其与文献SC-68448中的28c和泛αv抑制剂进行了比较（图9）。（38）分别获得t1/2至7小时、2小时和5分钟的解离半衰期。半衰期与化合物的亲和力相关（图9）；化合物的亲和力越高，解离半衰期越慢。28h显然更优越，因此更有可能增加体内作用持续时间并最大限度地减少临床剂量。

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受体内化[1]
正如其他地方对细胞表面αvβ6整合素的描述，igand结合诱导受体快速内化（几分钟内），从而阻止TGFβ的激活。在确定了28h/GSK-3008348的亲和力和关闭率后，接下来重要的是描述其对受体内化的影响，因为这也有助于估计临床剂量的大小和频率。因此，在原代肺上皮细胞中，GSK-3008348/28h导致内化，pEC50为9.8，在250 nM的浓度下，约80%的受体在1小时后内化，t1/2为2.6分钟。受体的再循环或再表达很慢，t1/2是11.0小时。这已被证明是由αvβ6的高亲和力结合和随后28小时的缓慢解离驱动的，诱导降解，然后是整合素的新合成。如其他地方所述，这种内化转化为体内作用的持续时间。虽然这可能并不令人惊讶，但令人鼓舞的是，通过大幅消除αvβ6驱动的TGFβ激活，在动物模型中可以看到胶原蛋白形成的一些减少。

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总结 [1]
这些数据（以及其他地方发表的其他药理学数据）提供了信心GSK-3008348/28h在临床上对患病人体组织具有潜力，特别是提供了体外检测和体内模型可以预测αvβ6在人体中的抑制作用并减少TGFβ激活的影响的保证。考虑到临床候选药物的通常磨损率，特别是IPF的磨损率，将靶点验证、体外试验数据和体内模型（54）与离体人体组织的疗效联系起来，可以提高开展临床研究的信心。

总体而言，28h/GSK-3008348在临床前物种中显示出良好的药代动力学特征，这（结合其优异的理化性质）表明其完全适合作为吸入药物进行开发。特别是，可能的临床剂量（将在其他地方描述），以及可能限制全身可用性的其他因素，以及预期的多种消除途径（代谢、胆道和肾脏）的参与，表明药物相互作用的可能性很低。更具体地说，对于吸入给药途径，高溶解度和快速肺部吸收的结合完全降低了反复给药时过度肺部滞留或积聚的风险。[1]

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大鼠肺部给药[1]
对28h/GSK-3008348进行了额外的体内研究，以表征其肺部给药的药代动力学，了解其在肺组织中的任何分配，并与药效学和体内疗效数据相结合。因此，通过肺部给药途径（气管内滴注和雾化）对Wistar Han大鼠进行的研究表明，其吸收到体循环中非常快。气管内研究显示，肺部途径的生物利用度约为21%，雾化给药为54%。缺乏完全的生物利用度是由于两项研究中输送到肺部的实际剂量的不确定性，而不是由于雾化研究中肺组织浓度的时间过程所证明的28h/GSK-3008348的任何假设的肺部滞留特性。 通过0.227mg/kg的雾化途径给药后，大鼠肺部28h/GSK-3008348的浓度在雾化结束时立即达到峰值（716ng/g），以双指数方式迅速下降，并在7小时降至定量限值（10ng/肺）以下，表明重复给药后肺部积聚的风险非常低（图10）。

体外血液结合/血浆结合[1]
通过快速平衡透析在大鼠、小鼠、狗和人血液中以1μg/mL的标称浓度在体外测量28h/GSK-3008348的血液结合。将受试化合物掺入用透析缓冲液（PBS-100mM磷酸钠+150mM氯化钠，pH 6.9-7.2）1:1稀释的血液中，在37°C下孵育或4小时，分5次重复，在孵育期开始和结束时取出等分试样，以评估血液稳定性和结合情况。有一次（与人类血液结合），研究中使用了未稀释的血液；由于从1:1稀释的血液中获得的结合值没有明显差异，因此将所有结果取平均值。所有缓冲液（PBS）和血液样本（50μL）在用于分析之前，通过用血液或缓冲液稀释2倍进行基质匹配。通过蛋白质沉淀提取所得样品，并通过LC-MS/MS分析的峰面积比测定28小时的血液结合。在大鼠、狗和人血浆中，通过快速平衡透析以1μg/mL的标称浓度在体外测量28小时与血浆蛋白的结合。将受试化合物掺入纯血浆中，在37°C下孵育4小时，分5次重复，在孵育期开始和结束时取下等分试样，以评估血浆稳定性和结合情况。所有缓冲液（PBS，100mM磷酸钠+150mM氯化钠，pH 6.9-7.2）和血浆样品（50μL）在用于分析之前，通过用血浆或缓冲液稀释2倍进行基质匹配。通过蛋白质沉淀提取所得样品，并通过LC-MS/MS分析的峰面积比测定28小时的血浆蛋白结合。

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体外代谢稳定性[1]
在雄性CD小鼠、雄性Wistar Han大鼠、雄性比格犬和混合性别混合的人肝微粒体中测试了28h/GSK-3008348的代谢稳定性。在加入NADPH（终浓度=1mM）以引发反应之前，将微粒体（终蛋白浓度0.5mg/mL）、0.1M pH7.4的磷酸盐缓冲液和试验化合物（终底物浓度=0.5μM）在37°C下预孵育。将测试化合物温育0、5、15、30和45分钟。对照组（减去NADPH）仅孵育45分钟。在适当的时间点加入50μL含内标的甲醇停止反应。蛋白质沉淀后，在没有校准曲线的情况下，使用特定的LC-MS/MS方法测量上清液中残留的化合物与内标的比例。峰面积比（化合物与IS）与底物的未加权对数下降相吻合。使用一级速率常数，通过调整蛋白质浓度、孵育体积和肝脏缩放因子（所有物种的微粒体蛋白质为52.5mg/g肝脏）来计算清除率。在37°C下在雄性CD小鼠、雄性Wistar Han大鼠、雄性比格犬和混合性别混合的人肝细胞中孵育28小时。使用来自每种物种的冷冻肝细胞悬浮液。在37°C下，以0.5μM的试验或对照化合物浓度、0.5百万活细胞/mL的细胞密度进行孵育。在裂解细胞中也进行了对照孵育，以显示任何非酶降解。在0、5、10、20、40和60分钟时从培养混合物中取出样品（50μL）（仅在60分钟时取出对照样品），并加入含有内标的甲醇（100μL）中以停止反应。蛋白质沉淀后，在没有校准曲线的情况下，使用特定的LC-MS/MS方法测量上清液中残留的化合物与内标的比例。峰面积比（化合物与IS）与底物的未加权对数下降相吻合。使用一阶速率常数，通过调整蛋白质浓度、孵育体积和肝脏缩放因子（小鼠、大鼠和人类为1.2亿个细胞/g肝脏；狗为2.4亿个细胞g/g肝脏）来计算清除率。

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体外和离体组织结合[1]
通过快速平衡透析，以1μg/mL的标称浓度（在稀释的匀浆中）在小鼠和人肺组织中测量28h/GSK-3008348与肺匀浆的体外结合。对于每项体外结合研究，称取约1g（记录的准确重量用于随后的匀浆稀释）小鼠或人肺组织，并将其放入预先填充有CK28陶瓷珠的7mL Precelys匀浆管中。在均化之前加入4mL缓冲液（PBS-100mM磷酸钠+150mM氯化钠，pH 6.9-7.2）（6500rpm下2 x 20s）。所得匀浆用缓冲液进一步稀释，形成1:10稀释的匀浆，以1 ug/mL的浓度加标28小时，在37°C下孵育4小时，分5次重复，在孵育期开始和结束时取出等分试样，以评估化合物在组织中的稳定性以及结合情况。有一次（与小鼠肺匀浆结合），将之前用博莱霉素处理过的小鼠的肺组织用于结合试验；由于从幼稚小鼠肺部获得的结合值没有明显差异，因此将所有结果取平均值。同样，在不同条件下（新鲜、-20°C冷冻、-80°C冷冻）储存的组织等分试样中进行了与人肺匀浆的结合，以测试该测定的稳健性和可重复性，从而使不同储存条件下的人体组织有可能用于未来的测定。有一次，从受IPF影响的人类供体肺部获得的等分试样用于结合试验；由于在这些研究中没有观察到明显的差异，所有结果都取了平均值。所有缓冲液和肺匀浆样品（50μL）在用于分析之前，通过用肺匀浆或缓冲液稀释2倍进行基质匹配。通过蛋白质沉淀提取所得样品，并通过LC-MS/MS分析的峰面积比测定28小时的肺组织结合。还使用体内研究中的肺（通过渗透微型泵以15mg/kg/天的剂量对雄性C57Bl/6J小鼠进行皮下给药）离体测量了28h与小鼠肺匀浆的结合。制备匀浆、快速平衡透析、LC-MS/MS分析和结果处理的实验条件如上所述。在标称浓度为1μg/mL（稀释匀浆中）的大鼠组织中，通过快速平衡透析测量28小时与肾和肝匀浆的体外结合。匀浆制备、快速平衡透析、LC-MS/MS分析和结果处理的实验条件与上述体外肺结合研究相同，除了稀释因子（1:5而不是1:10）。

体外血液分布[1]
在1μg/mL的标称浓度下，在体外测量28h/GSK-3008348与人、狗和大鼠血细胞的结合程度。在37°C的全血中孵育30分钟后，从单个供体（狗）或混合（n=2）供体（大鼠和人）中确定28h与血液细胞分数的结合百分比，一式三份。来自同一大鼠、狗或人类血液样本的加标血浆标准品也以相同的浓度孵育，以产生与样本相同基质的总血液浓度值。在培养结束时，将血液样本离心以产生血浆。通过LCMS/MS分析的峰面积比确定28小时的浓度。人、狗和大鼠的红细胞压积值分别为44%、42%和46%。

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体外被动渗透性[1]
在GF120918（一种外排抑制剂）存在的情况下，在3μM的起始浓度下测量28h/GSK-3008348在MDCK-MDR1细胞单层上的渗透性（Pexact）。供体和受体室的pH值为7.4（Hanks平衡盐溶液）。在37°C、5%CO2、95%相对湿度的环境中孵育60分钟。将根尖和基底外侧样品稀释，通过LC-MS/MS进行分析。通过荧光分析监测路西法黄渗透，检查整个实验过程中单层的完整性。

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与P-糖蛋白的相互作用[1]
在有和没有外排抑制剂GF120918的情况下，在2μM的浓度下测量28h/GSK-3008348在MDCK-MDR1细胞单层上的渗透性。供体和受体室的pH值为6.9（模拟肺液）。所有腔室首先用模拟肺液预孵育60分钟。60分钟后，移除流体。立即在细胞单层的顶端侧（A-to-B）或基底外侧侧（B-to-A）给药试验化合物，并在37°C和5%CO2的加湿培养箱中孵育。接收器室充满了空白模拟肺液。每次测定均一式三份。90分钟后，从接收器和供体室中取出等分试样。在经受测试化合物后，测量每个单层的Lucifer黄色通量，以确保在通量期间不会对细胞单层造成损伤。

大鼠口服/静脉药代动力学[1]
本研究采用交叉设计，在双侧插管的雄性Wistar Han大鼠（n=3，体重270-295g；股静脉给药，颈静脉采血）中进行。GSK-3008348/28h以1 mg/kg的剂量静脉输注，输注速率为10 mL/kg/h，持续30分钟，溶于100%生理盐水中。经过两天的洗脱期后，以3 mg/kg的剂量通过灌胃给予GSK-300834828h，溶于100%生理盐水中，给药体积为10 mL/kg。通过颈静脉插管采集两组大鼠的血样，采集时间长达24小时。所有血样均采集于肝素化容器中。将各份血液样本直接转移至含有等体积无菌水的微量离心管中，并在分析前于-20℃冷冻保存。

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犬口服/静脉注射药代动力学[1]
本研究采用交叉设计，纳入三只雄性比格犬（体重12.1-15.4 kg），包括三个组：静脉注射赋形剂（用于记录基线心电图），随后分别静脉注射和口服给药受试化合物。在静脉注射给药期间也进行了心电图记录。犬只饲养于标准笼中。给药前一天下午约4点停止喂食，给药后4小时重新喂食。整个研究期间，犬只均可自由饮水。 GSK-3008348/28h以1 mg/kg的剂量经头静脉静脉输注，输注时间为60分钟，输注速率为5 mL/kg/h，溶于100%生理盐水中。经过6天的洗脱期后，GSK-3008348/28h以1 mg/kg的剂量溶于水中，通过灌胃法给予同一批犬只，给药体积为2 mL/kg。两次给药前，均在头静脉（与静脉给药所用头静脉相反的一侧）插入临时导管（血管造影剂），并保留2小时以采集血样，从而减少静脉穿刺次数。在每个研究组中，采集完2小时血样后，拔除临时导管。后续样本通过颈静脉直接穿刺采集。在给药后24小时内，对研究的两个组均采集血样。所有血样均采集于肝素化容器中。将各份血样直接转移至含有等体积0.02%磷酸的微量离心管中，并在分析前于-20℃冷冻保存。

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体内消除途径初步研究（大鼠和犬）[1]
一项初步研究在一只雄性Wistar Han大鼠中进行，旨在研究GSK-3008348/28h在该物种中的肾脏和胆汁消除情况。该大鼠（260g）饲养于标准笼中，并置于可控环境中，可自由获取食物和水。根据当地操作规程和实践，对动物进行手术准备：在全身麻醉后，将大鼠经股静脉插管至下腔静脉（用于给药）、颈静脉（用于采血）和胆管（用于收集胆汁），操作过程中大鼠仍处于麻醉状态。给药前，大鼠恢复约1小时。GSK-3008348/28h以1 mg/kg游离碱当量静脉输注，输注时间为30分钟，输注速率为10 mL/kg/h，溶于100%生理盐水中。从颈静脉插管连续采集血样，持续7小时。利用血药浓度-时间数据确定药代动力学参数。在研究期间（7小时）收集尿液和胆汁。利用尿液和胆汁浓度数据分别确定肾脏和胆道清除率的贡献。在采集完最后一个样本（7小时）后，处死大鼠并收集肺、肝和肾脏，以确定血液与组织的比例。所有血液样本均采集于肝素化容器中。将血液样本分装后直接转移至含有等体积0.02%磷酸溶液的微量离心管中，并在分析前于-20℃冷冻保存。胆汁样本分两次采集（0-4小时和4-7小时），在干冰上收集于预先称重的含有40μL 1%磷酸溶液的试管中，最终浓度为0.01%（假设胆汁量为4mL）。尿液样本分两次采集（0-4小时和4-7小时），在干冰上收集于标记的含有10μL 1%磷酸溶液的试管中，最终浓度为0.01%（假设尿液量为1mL）。本研究对一只雄性比格犬进行了初步研究，旨在探讨28h在该犬种体内的肾脏清除情况。所有动物实验均按照常规动物饲养方法进行。该犬（体重16.9kg）在输注开始后的前两个小时内被固定在吊带中，随后在研究的2-8小时内被安置于代谢笼中。给药前一天下午4点左右停止喂食，并在给药后4小时重新喂食。整个研究期间，该犬可自由饮水。28h以1 mg/kg的剂量经头静脉静脉输注，输注时间为60分钟，输注速率为5 mL/kg/h，溶于100%生理盐水中。给药前，将临时导管（血管造影剂）插入头静脉（与静脉给药所用头静脉对侧腿），并保留2小时以减少静脉穿刺次数。采集完2小时血样后，拔除临时导管。后续血样通过颈静脉直接穿刺采集。输注开始后8小时内均采集血样。所有血样均采集于肝素化容器中。将单份血样直接转移至含有等体积0.02%磷酸的微量离心管中，并在分析前于-20℃冷冻保存。尿液在干冰上收集，每次收集100 μL尿液（2-8小时），置于含有100 μL 10%磷酸的试管中，最终浓度为0.01%（假设尿液量为100 mL）。

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大鼠气管内和雾化给药的药代动力学研究[1]
本研究在雄性Wistar Han大鼠（n=3，体重280-315g）中考察了气管内给药的药代动力学。大鼠饲养于标准笼中，置于可控环境中，自由摄取食物和水。每28小时，大鼠均接受一次气管内给药，给药剂量为1 mg/kg（标称剂量）。该化合物以1.25 mg/mL的100%生理盐水溶液配制，给药体积固定为200 μL（假设大鼠体重为250g）。给药后12小时内，通过尾静脉临时插管采集血样（12小时后直接进行尾静脉穿刺）。所有血样均采集于肝素化容器中。将各份血液样本直接转移至含有等体积无菌水的微量离心管中，并在分析前于-20℃冷冻保存。本研究采用雾化给药途径，在雌性Wistar Han大鼠中考察了药物的药代动力学。研究旨在获得雾化给药后28小时内的全身药代动力学数据以及在ADG吸入塔中的肺部滞留时间曲线。为确定研究的目标剂量水平，事先进行了初步工作，以表征ADG系统输送的气溶胶特性。在雾化药代动力学研究当天，将14只大鼠（280-330克）固定于约束器中，并在雾化开始前随机连接到吸入塔的接口上（使用LC Sprint喷射式雾化器）。所有大鼠均暴露于浓度为 10 mg/mL 的 28h 溶液（溶于 pH 值调节至 7.0 的 100% 生理盐水）产生的气溶胶中 10 分钟。本研究的目标剂量为 1 mg/kg，但后续的滤膜分析估计实际剂量为 0.227 mg/kg。第 11-14 号大鼠在雾化开始后 7 小时内，通过尾静脉临时插管采集连续血样至肝素化微量采血管中。所有大鼠均被戊巴比妥过量麻醉处死（每个时间点 2 只，最长 12 小时）。所有大鼠均通过切断颈静脉采集终末血样至肝素化微量采血管中，并取出肺脏置于 Eppendorf 管中，两者均置于冰水上保存。将各份血液样本直接转移至含有等体积无菌水的微量离心管中，并与肺组织一起冷冻保存于-20℃，以备分析。

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MALDI成像[1]
两只雄性Crl:WI(Han)大鼠（ID：099和100）通过吸入途径给予GSK-3008348/28h，作为一项为期14天的安全性评估研究的一部分。一只雄性Crl:WI(Han)大鼠（ID：098）给予赋形剂。动物099和100接受单次、60分钟的鼻部雾化吸入，吸入的28h溶于0.9%氯化钠水溶液（pH值调至7），剂量为6.23 mg/kg。动物098仅接受一次60分钟的鼻部生理盐水（pH值调至7）暴露。在异氟烷麻醉下，通过腹主动脉放血处死动物098和099后，立即收集完整肺组织（气管完整）；动物100则在给药结束后1小时收集。肺组织冷冻保存于-80°C。将大鼠肺组织冷冻切片，厚度为12 μm。使用Bruker UltrafleXtreme仪器进行MALDI-MS（基质辅助激光解吸/电离质谱）成像，空间分辨率为200 μm。小鼠肺组织分离[1]
8只雄性C57Bl/6J小鼠饲养于标准笼中，置于可控环境中，自由摄取食物和水。动物按照当地的手术流程和规范进行手术准备。每组剂量组小鼠（n=4）植入渗透泵（Alzet 1002 型，100 μL 储液罐，流速 0.25 μL/h），该渗透泵已预先装满配制好的药物溶液，并在 37℃ 的无菌 0.9% 生理盐水中预充过夜。渗透泵内装有浓度分别为 6 mg/mL 和 60 mg/mL 的 GSK-3008348/28h 溶液，该溶液以 DMSO:PEG200:水 (5:45:50, v/v/v) 配制而成，以达到 1.5 mg/kg/天和 15 mg/kg/天的预期给药剂量。植入渗透泵后，每天从尾静脉采集血样，持续 96 小时。所有血样均采集于肝素化容器中。将各份血液样本直接转移至含有等体积无菌水的微量离心管中，并在分析前于-20℃冷冻保存。研究结束时（96小时），所有小鼠均按照规定的1号程序处死，并收集肺组织进行定量分析（组织药物浓度）。此外，还使用15 mg/kg/天给药组小鼠的肺组织，基于与体外组织结合相同的检测方法，测定28小时药物在肺组织匀浆中的离体结合情况。

药代动力学特征[1]
为了预测其在人体内的药代动力学(PK)特征，评估其作为吸入药物候选物的可行性，并辅助解释药代动力学/药效学研究结果，我们在一系列临床前动物体内研究中对28h进行了药代动力学特征分析（表5）。特别是，我们进行了大鼠和犬的静脉(iv)研究，以支持异速缩放以及对人体清除率和分布容积的预测；同时，口服药代动力学特征的表征对于预测吸入剂量在人体内经胃肠道吞咽部分的代谢至关重要。从大鼠和犬获得的药代动力学参数有助于预测GSK-3008348/28h的临床药代动力学，相关内容已在其他文献中描述。

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大鼠和犬的静脉/口服药代动力学[1]选择大鼠和犬作为GSK-3008348/28h临床前安全性测试的主要动物模型，是基于以下两点考虑：(a) 已知该药理靶点在这两种动物中均有活跃表达；(b) 本单位对这两种动物的一般病理学及其对多种吸入给药药物的反应拥有丰富的内部知识。在 ADME 特性方面，我们获得了不同物种肝细胞和肝微粒体中的代谢稳定性数据，结果将在后文描述。
在一项针对雄性 Wistar Han 大鼠的交叉静脉输注/口服药代动力学研究中，吡唑类药物GSK-3008348/28h 显示出中等至较高的血药清除率（56 mL min–1 kg–1，约占肝血流量 (LBF) 的 70%）、中等的分布容积（2.1 L/kg）、较短的末端半衰期（0.8 h）以及可忽略不计的口服生物利用度（<2%）。在一项雄性比格犬的交叉静脉输注/口服药代动力学研究中，GSK-3008348/28h 显示出中等至较高的血药清除率（28 mL min⁻¹ kg⁻¹，约占血药浓度的 50%）、中等的分布容积（3.6 L/kg）、中等的末端半衰期（3.6 h）和中等的口服生物利用度（30%）。在初步研究（每种动物 n = 1）中，为了研究体内消除途径，在以 1 mg/kg 的剂量静脉注射 28h 后，其肾清除率显示出低至中等水平（分别占大鼠和犬总血药清除率的 15% 和 21%）。28h 还显示出大鼠胆汁清除率（以原药形式）为中等水平（占总血药清除率的 24%）。总清除率中未被解释的部分（大鼠中约为 55%）很可能是由于代谢造成的，因为 28h 的化学结构提供了多个潜在的 I 期（氧化）和 II 期（结合）代谢位点。然而，尚未进行正式的代谢物鉴定研究。

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小鼠肺组织分布 [1]
吸入药物研发的一个重要方面是了解候选药物在肺组织中的分布，而与具体的给药途径无关。因此，本研究采用皮下给药途径，在小鼠中考察了 GSK-3008348/28h 的肺部吸收情况。使用渗透泵以 1.5 和 15 mg kg–1 day–1 的剂量持续输注 28h/GSK-3008348，在 24 小时内达到稳态，并且在所研究的剂量范围内，药物暴露量呈线性增加。在小鼠体内达到稳态（96 小时）时，肺血比为 8:1（15 mg kg⁻¹ day⁻¹）至 11:1（1.5 mg kg⁻¹ day⁻¹），表明无论给药途径如何，药物均能有效分布至作用部位。由于未在小鼠体内进行静脉药代动力学研究，因此在该物种中测得的高肺血比与该物种观察到的分布容积无关。尽管如此，数据表明这些发现并非小鼠特有。在一项初步的（n = 1）大鼠分布和消除研究中，以 1 mg/kg 的剂量静脉输注 28 小时（30 分钟），7 小时后测得肺血比为 12。其他研究（例如，早期安全性研究中的毒代动力学）也证实了良好的肺部分布。
肺血分配系数较高可能是由于GSK-300834828h 与肺组织蛋白的亲和力高于血浆蛋白，或与细胞膜磷脂结合或被细胞内摄取所致。然而，当比较肺组织和血液中28h在稳态下的游离浓度时，发现二者数值相差不到2倍，这表明肺部不存在可以推翻“游离分数假说”的主动摄取机制。尽管总药物浓度下观察到的高组织分配率并未被游离药物比例所证实，但就PK/PD建模而言，这种分配仍然是一个有利条件，因为它表明易于测量的全身游离药物水平能够代表作用部位的游离药物水平。

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体外研究支持[1]
为了完善其作为吸入药物候选物的特性，协助解释PK/PD结果（已在其他文献中报道），帮助构建相关的基于生理的PK模型，确定安全范围，并实现药代动力学模型向人体的扩展，我们还对GSK-3008348/28h进行了体外研究。这些研究包括肝细胞和肝微粒体中的体外代谢稳定性、体外血液、血浆和组织结合、体外血液分布、体外被动渗透性以及P-糖蛋白的初步评估。结果汇总于表6。

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GSK-3008348/28h 的理化性质 [1]
GSK-3008348/28h 的羧酸、四氢萘啶和吡咯烷的 pKa 值分别为 4.1、7.4 和 9.5。GSK-3008348/28h 的两性离子形式为无定形固体，而相应的盐酸盐为结晶态。该盐酸盐在一定温度和相对湿度条件下，固态可稳定保存 4 周。游离碱 28h 在生理盐水（pH 7）和模拟肺液（SLF，pH 6.9）中的溶解度分别大于 71 mg/mL 和 34 mg/mL。盐酸盐 28h 在 pH 值分别为 4、5、6 和 7 的生理盐水中的溶解度均大于 55 mg/mL。在 pH 值为 7.5 的生理盐水中，其溶解度为 31 mg/mL；在 pH 值为 6.6 的人工肝液 (SLF) 中，其溶解度大于 55 mg/mL。因此，化合物 28h 具有可接受的雾化吸入给药溶解度。浓度为 1 mg/mL 的 28h 在 pH 值为 4、温度为 50 °C 的生理盐水中可稳定保存长达 6 周；而 pH 值为 5、6 和 7 的溶液在冷藏条件下可稳定保存 6 周。

体外安全性概况[1]
根据ICH M7指南，对直接作用致突变性进行了计算机模拟评估，评估工具包括由Lhasa Ltd.开发的基于专家规则的构效关系模型Derek Nexus 4.0.5版（KB 2014 1.0版）和由Leadscope Inc.开发的基于统计学的构效关系模型Leadscope 1.8版（沙门氏菌版本3，大肠杆菌-Sal 102版本1）。Derek Nexus 4.0.5版预测GSK-3008348/28h不具有致突变性，但其超出了Leadscope模型的适用范围。在AMES和鼠淋巴瘤筛选试验中评估了28h盐酸盐的致突变性和致染色体断裂性，结果表明，在推荐的最大测试浓度范围内，该盐酸盐在这些试验中均未显示出遗传毒性。

[1] J Med Chem . 2018 Sep 27;61(18):8417-8443. doi: 10.1021/acs.jmedchem.8b00959.

[2] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02612051.

采用非对映选择性方法，通过铑催化的芳基硼酸在(R)-BINAP存在下与巴豆酸酯的不对称1,4-加成反应，合成了一系列3-芳基(吡咯烷-1-基)丁酸，从而得到(S)绝对构型的主要产物。筛选了多种芳基取代基，包括吗啉、吡唑、三唑、咪唑和环醚，并利用细胞黏附实验检测了其对αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6和αvβ8整合素的亲和力。鉴定出许多对αvβ6整合素具有高亲和力和选择性的类似物。 (S)-3-(3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)苯基)-4-((R)-3-(2-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)乙基)吡咯烷-1-基)丁酸盐酸盐在放射性配体结合试验中被发现对αvβ6整合素具有极高的亲和力（pKi = 11），解离半衰期长（7小时），在pH 7的生理盐水中溶解度极高（>71 mg/mL），且其药代动力学特性与雾化吸入给药相符。因此，该化合物被选作治疗特发性肺纤维化的潜在治疗药物，进行进一步的临床研究。[1]

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本文描述了αvβ6抑制剂临床候选药物的发现和特性。该候选化合物来源于一系列新型RGD αvβ6整合素抑制剂的先导化合物优化，这些抑制剂以1,8-四氢萘啶胍等排体取代精氨酸，以吡咯烷环取代受限的甘氨酸，并以3-芳基丁酸取代天冬氨酸。化合物的合成采用了一种非对映选择性路线，该路线涉及铑催化的芳基硼酸不对称1,4-加成反应。因此，研究人员在细胞黏附实验中筛选了多种芳基取代基，包括环烷基、杂环、杂芳基和环醚，以评估其对αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6和αvβ8整合素的亲和力，并鉴定出几种具有高水溶性、高亲和力和对αvβ6整合素（相对于其他αv整合素）选择性的类似物。 (S)-3-(3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)苯基)-4-((R)-3-(2-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)乙基)吡咯烷-1-基)丁酸盐酸盐 (28h) 具有适合雾化给药的理化性质（pH 7 时盐溶液溶解度为 71 mg/mL），分子量为 487，具有中等亲脂性（chromLogD7.4 = 2.77）。测得羧酸基团的 pKa 值为 4.07，四氢萘啶基团的 pKa 值为 7.38，吡咯烷基团的 pKa 值为 9.50。 28h 对 αvβ6 整合素具有极强的抑制活性，放射性配体结合试验中其 pKi 值为 11，且解离半衰期长达 7 小时。在原代人细胞试验中，它能抑制活性 TGFβ 的释放，并由于其能快速诱导 αvβ6 内吞作用（内化，可在数分钟内完成），随后缓慢循环（持续数小时），从而表现出持久的作用。28h 的高溶解度和整体药代动力学特性，包括快速的肺部吸收、多种消除途径以及可能有限的全身生物利用度，均适合吸入给药。因此，28h 的盐酸盐被选为治疗特发性肺纤维化的潜在治疗药物，目前正在进行临床试验。 [1]

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GSK3008348 是一种在研药物，由葛兰素史克研发有限公司（申办方，一家总部位于英国的制药公司）开发，用于治疗特发性肺纤维化 (IPF)。IPF 是一种罕见且病因不明的疾病，会导致肺部瘢痕形成。主要症状是呼吸困难和干咳。症状通常会随着时间推移而加重，在某些患者中甚至可能致命。IPF 的病因尚不明确。这是一项首次人体试验的 I 期临床试验，共分为三个部分，由昆泰公司代表申办方开展。A 部分的主要目的是在健康志愿者中考察单次吸入雾化（药物喷雾）剂量 GSK3008348 的安全性和耐受性。次要目标是确定人体如何以及以何种速率吸收、分布、分解和消除该药物。本研究的B部分和C部分将纳入特发性肺纤维化（IPF）住院患者。B部分和C部分的目的是研究特发性肺纤维化（IPF）患者吸入单次雾化（药物喷雾）剂量GSK3008348后的安全性和耐受性，以及药物与靶点的结合情况。次要目标是确定这些患者如何以及以何种速率吸收、分布、分解和消除该药物。A部分的总持续时间为65-87天，B部分为62天，C部分为43天。[2]

C29H38CLN5O2

524.0973

487.294

C, 71.43; H, 7.65; N, 14.36; O, 6.56

1629249-33-7

122553774

Brown to orange solid powder

1.3±0.1 g/cm3

716.2±60.0 °C at 760 mmHg

387.0±32.9 °C

0.0±2.4 mmHg at 25°C

1.659

3.57

83.3

3

6

9

37

722

0

Cl[H].O([H])C(C([H])([H])C([H])(C1C([H])=C([H])C([H])=C(C=1[H])N1C(C([H])([H])[H])=C([H])C(C([H])([H])[H])=N1)C([H])([H])N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])(C([H])([H])C([H])([H])C2C([H])=C([H])C3C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C=3N=2)C1([H])[H])=O

ZMXBIIQMSGOIRZ-WIOPSUGQSA-N

InChI=1S/C29H37N5O2/c1-20-15-21(2)34(32-20)27-7-3-5-24(16-27)25(17-28(35)36)19-33-14-12-22(18-33)8-10-26-11-9-23-6-4-13-30-29(23)31-26/h3,5,7,9,11,15-16,22,25H,4,6,8,10,12-14,17-19H2,1-2H3,(H,30,31)(H,35,36)/t22-,25+/m0/s1

(3S)-3-[3-(3,5-Dimethylpyrazol-1-yl)phenyl]-4-[(3R)-3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)ethyl]pyrrolidin-1-yl]butanoic acid

GSK3008348; GSK 3008348; Integrin Antagonist 1 hydrochloride; 1629249-40-6; GSK3008,348; Integrin Antagonist 1 (hydrochloride); 1629249-33-7; 3-[3-(3,5-dimethylpyrazol-1-yl)phenyl]-4-[3-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-2-yl)ethyl]pyrrolidin-1-yl]butanoic acid;hydrochloride; GSK-3008348 HCl; SCHEMBL18092915;GSK-3008348

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。